In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.
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Articolo metodologico
In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery
In questo articolo
Sommario
Abstract
In vitro trascrizione sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per molti anni per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella trascrizione. Questo processo richiede multi-subunità DNA-dipendente RNA polimerasi (RNAP) e una serie di fattori di trascrizione che agiscono per modulare l'attività di RNAP durante genica. gel elettroforesi sequenziamento dei trascritti radiomarcati viene utilizzato per fornire informazioni meccanicistica dettagliate su come procede trascrizione e quali parametri possono incidere su di essa. In questo lavoro descriviamo il protocollo per studiare come il fattore di allungamento essenziale Nusa regola la pausa di trascrizione, così come un metodo per identificare un agente antibatterico mira trascrizione iniziazione attraverso l'inibizione della formazione di oloenzima RNAP. Questi metodi possono essere utilizzati come una piattaforma per lo sviluppo di approcci aggiuntivi per esplorare il meccanismo di azione dei fattori di trascrizione che rimangono ancora chiaro, così come nuovi agen antibattericots mira trascrizione che è un obiettivo sottoutilizzato della droga in ricerca e sviluppo di antibiotici.
Introduzione
La trascrizione è il processo in cui l'RNA è sintetizzato da un modello di DNA specifico. Nelle cellule eucariotiche sono tre RNAPs distinte: RNAP che trascrive rRNA precursori, RNAP II è responsabile della sintesi di mRNA e di alcuni piccoli RNA nucleari, e la sintesi di rRNA 5S e tRNA viene eseguita da RNAP III. Nei batteri, c'è solo un RNAP responsabile della trascrizione di tutte le classi di RNA. Ci sono tre fasi di trascrizione: inizio, allungamento e terminazione. La trascrizione è uno dei processi più altamente regolamentati nella cellula. Ogni fase del ciclo di trascrizione rappresenta un punto di controllo per la regolazione dell'espr....
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Protocollo
Attenzione: Gli esperimenti prevedono l'utilizzo della radioattivo dell'isotopo 32 P e nessun lavoro dovrebbero essere intraprese fino a quando tutte le condizioni di sicurezza adeguate sono state soddisfatte. In generale il personale sono tenuti a frequentare un corso di sicurezza e sottoposti pratica supervisionata prima di esperimenti usando reagenti radioattivi. Si prega di indossare dispositivi di protezione individuale (dosimetro thermoluminescent, occhiali di sicurezza, guanti, camici camera radiazioni, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe) quando si esegue la reazione.
1. Preparazione di materiali necessari al test
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Risultati
efficienza della trascrizione può essere determinata misurando il livello di radiazione nelle bande in diversi momenti. Il saggio pausa per testare la funzione di fattore di Nusa visualizzazione della pausa, terminazione attivata, e prodotti (Figura 1A) run-off. Alla presenza del dominio N-terminale di Nusa (Nusa NTD; residui di aminoacidi 1-137), l'aspetto dei prodotti di RNA è stato significativamente ritardato rispetto al esperimento di controllo manca NUSA. Soppr.......
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Discussione
In tutti gli organismi, la trascrizione è un processo strettamente regolata. In vitro di trascrizione sono stati sviluppati per fornire una piattaforma per testare gli effetti dei fattori di trascrizione, piccole molecole e gli inibitori della trascrizione. In questo lavoro metodo, un saggio per la trascrizione batterica generale è stato descritto. saggi di trascrizione in combinazione con il sequenziamento elettroforesi su gel di trascrizioni sono molto importanti per gli studi meccanicistici in quanto consent.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro riconosce una sovvenzione per l'inizio della carriera della facoltà dell'Università di Newcastle (CM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ottenere le proteine necessarie per il saggio | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparazione di acqua | |||
| DEPC dietilpirocarbonato (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Acqua senza RNasi | |||
| Acqua senza nucleasi Ambion | ThermoFisher | AM9937 | |
| Procedura guidata per la preparazione | |||
| Plus SV Minipreps Sistema di purificazione del DNA | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| Primer | |||
| Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System | Spettrometro fluorometrico Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparazione | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| rNTP ad alta purezza | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Preparazione |
| della scala di RNA composto radioattivo | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1– 1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Preparazione | |||
| Cellula di sequenziamento dell'acido nucleico Sequi-Gen GT | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(idrossimetil)amminometano | Sigma-Aldrich | ||
| acido borico | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Sigma-Aldrich | ED | ||
| 40% acrilammide/bis-acrilammide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| persolfato di ammonio | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED) | Saggio | ||
| P9541 | |||
| glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicina | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formammide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| blu bromofenolo | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xilene cianolo | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| eparina | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| Inibitore della RNasina Ribonucleasi | Promega | N2511 | |
| Tampone di trascrizione | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | Glicerolo DTT-RO | |
| Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| Carta | |||
| Whatman Carta per cromatografia Chr da 3 mm | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Decontaminante | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Trattamento in gel | |||
| Imager Typhoon Trio+ | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
Riferimenti
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
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Ristampe e permessi
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