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Articolo metodologico

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

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⸱

DOI:

10.3791/54256

⸱

20 settembre 2016

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

In questo articolo

Sommario

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.

Abstract

In vitro trascrizione sono stati sviluppati e ampiamente utilizzati per molti anni per studiare i meccanismi molecolari coinvolti nella trascrizione. Questo processo richiede multi-subunità DNA-dipendente RNA polimerasi (RNAP) e una serie di fattori di trascrizione che agiscono per modulare l'attività di RNAP durante genica. gel elettroforesi sequenziamento dei trascritti radiomarcati viene utilizzato per fornire informazioni meccanicistica dettagliate su come procede trascrizione e quali parametri possono incidere su di essa. In questo lavoro descriviamo il protocollo per studiare come il fattore di allungamento essenziale Nusa regola la pausa di trascrizione, così come un metodo per identificare un agente antibatterico mira trascrizione iniziazione attraverso l'inibizione della formazione di oloenzima RNAP. Questi metodi possono essere utilizzati come una piattaforma per lo sviluppo di approcci aggiuntivi per esplorare il meccanismo di azione dei fattori di trascrizione che rimangono ancora chiaro, così come nuovi agen antibattericots mira trascrizione che è un obiettivo sottoutilizzato della droga in ricerca e sviluppo di antibiotici.

Introduzione

La trascrizione è il processo in cui l'RNA è sintetizzato da un modello di DNA specifico. Nelle cellule eucariotiche sono tre RNAPs distinte: RNAP che trascrive rRNA precursori, RNAP II è responsabile della sintesi di mRNA e di alcuni piccoli RNA nucleari, e la sintesi di rRNA 5S e tRNA viene eseguita da RNAP III. Nei batteri, c'è solo un RNAP responsabile della trascrizione di tutte le classi di RNA. Ci sono tre fasi di trascrizione: inizio, allungamento e terminazione. La trascrizione è uno dei processi più altamente regolamentati nella cellula. Ogni fase del ciclo di trascrizione rappresenta un punto di controllo per la regolazione dell'espressione genica 1. Per l'inizio, RNAP deve associare a un fattore sigma per formare holoenzyme, che è necessario per dirigere l'enzima a siti specifici chiamato promoters 2 per formare un complesso promotore aperta. Successivamente, una grande suite di fattori di trascrizione sono responsabili per la regolamentazione oattività f RNAP durante le fasi di allungamento e di terminazione. Il fattore di trascrizione qui esaminato è la proteina altamente conservata ed essenziale, Nusa. Esso è coinvolto nella regolazione della trascrizione pausa e risoluzione, così come anti-terminazione durante rRNA sintesi 3-5.

In vitro di trascrizione sono stati sviluppati come potenti strumenti per studiare le fasi complesse di regolazione durante la trascrizione 6. In generale, un frammento lineare di DNA comprendente un promotore è richiesto come modello per la trascrizione. Il DNA templato è solitamente generato mediante PCR o linearizzazione un plasmide. proteine ​​purificate e PTR (tra cui uno radioattivo NTP a fini di rilevazione) sono poi aggiunti e dei prodotti analizzati dopo il periodo di incubazione richiesto. Utilizzando i modelli appropriati e condizioni di reazione, tutte le fasi della trascrizione sono stati esaminati utilizzando questo approccio che ha permesso la caratterizzazione molecolare dettagliato della trascription nel corso dell'ultimo mezzo secolo 7. In combinazione con le informazioni sulla struttura 3-dimensionale delle RNAP è stato anche possibile sondare il meccanismo molecolare di inibizione della trascrizione da antibiotici e lead antibiotico, e utilizzare queste informazioni per lo sviluppo di nuovi farmaci migliorati 8-10.

In questo lavoro fornendo esempi di come saggi di trascrizione possono essere utilizzati per determinare il meccanismo di regolazione mediante trascrizione allungamento / fattore di terminazione Nusa, e come il meccanismo di azione di un romanzo piombo inibitore inizio della trascrizione può essere determinato.

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Protocollo

Attenzione: Gli esperimenti prevedono l'utilizzo della radioattivo dell'isotopo 32 P e nessun lavoro dovrebbero essere intraprese fino a quando tutte le condizioni di sicurezza adeguate sono state soddisfatte. In generale il personale sono tenuti a frequentare un corso di sicurezza e sottoposti pratica supervisionata prima di esperimenti usando reagenti radioattivi. Si prega di indossare dispositivi di protezione individuale (dosimetro thermoluminescent, occhiali di sicurezza, guanti, camici camera radiazioni, pantaloni a figura intera, chiuso-toe scarpe) quando si esegue la reazione.

1. Preparazione di materiali necessari al test

  1. Ottenere il proteine ​​necessarie per il dosaggio di trascrizione.
    1. Per l'esperimento descritto qui, sovrapproduzione e purificare E. coli RNAP in laboratorio come descritto 11, o ottenere da una fonte commerciale (Materials List).
      Nota: entrambi forniscono risultati simili. Altri metodi per la purificazione di RNAP nativo o affinità etichettati possono anche essere usate 12,13. Sigma / fattori Nusa possono essere ottenuti come ddescritto nella precedente lavoro 14,15.
  2. Acqua Preparazione di dietilpirocarbonato (DEPC) trattati
    Nota: In alternativa, l'acqua RNase-free può essere ottenuto da fonti commerciali (Materials List).
    1. Aggiungere 1 ml dietilpirocarbonato (DEPC) a 1 L di acqua purificata (0,1% v / v) e miscelare notte.
    2. acqua DEPC autoclave e suggerimenti per due volte.
  3. DNA stampo Preparazione
    1. Purificare plasmide pSG1154 16 e / o 17 pIA226 utilizzando un kit di purificazione plasmide (Elenco materiali) secondo le istruzioni del produttore.
    2. Per amplificare il modello per le analisi di trascrizione run-off (un frammento di 360 bp che comprende la regione xyl promotore P), assemblare una reazione di PCR in ghiaccio tra cui 25 microlitri 2x PCR mix (Elenco materiali), 2 ml ciascuno dei primer (5 micron) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(in avanti) e 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (reverse), 1 ml pSG1154 plasmide preparation (250 mM) e 20 ml di acqua depurata).
      1. Oppure, in alternativa, per i singoli saggi di trascrizione rotonde, amplificare un frammento di 447 bp che comprende la regione R promotore λ P da pIA226 17. Impostare una reazione di PCR in ghiaccio con 25 microlitri 2x PCR mix, 2 ml ciascuno dei primer (5 micron): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(in avanti) e 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (reverse), pIA226 1 ml 17 miniprep (250 mM) e 20 ml di acqua depurata).
        Nota: Questo modello manca citosina fino alla posizione +26 nt, che è il 26 ° nucleotide dal sito di inizio della trascrizione. Pertanto, trascrizione utilizzando questo modello consentirà apertura, passaggio promotore e stallo al +26 nt per formare un complesso di allungamento trascrizione stabile (CE), quando solo ATP, UTP e GTP sono presenti nella reazione.
    3. Impostare una reazione PCR con le seguenti condizioni: 95 °; C per 30 sec, 50 ° C per 30 sec, 72 ° C per 30 sec, ripetendo per 30 cicli.
    4. Purificare il prodotto utilizzando un kit PCR clean-up (Materials List) secondo le istruzioni del produttore ed eluire in 100 microlitri di buffer di trascrizione per il saggio di trascrizione.
    5. Determinare la concentrazione modello di DNA utilizzando un fluorospectrometer (Materials List).
  4. NTP Preparazione
    Nota: PTR possono essere ottenuti da diverse fonti commerciali (Materials List).
    1. Sciogliere PTR (≥99% puro) in acqua DEPC trattati per fare 1 m stock, aliquota 1 ml della soluzione in provette da 1,5 ml (50 ml in ciascun tubo) e conservare a -20 ° C.
    2. Ordine α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) prima dell'esperimento. 32 P ha una breve emivita di 14.29 giorni.
      Nota: Usando UTP alpha-marcato evita confrontando l'intensità delle bande di diversa lunghezza.
  5. Preparazione RNA Ladder
    1. Montare il followreazione ing a temperatura ambiente: 0,5 mg di RNA Template Mix (Materials List), 80 mm tampone HEPES pH7.5, 12 mm MgCl 2, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 2 mM ATP / CTP / GTP, 0,5 mM UTP, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 microlitri T7 RNAP (Elenco materiali), acqua DEPC trattati a 20 ml.
    2. Lasciare reazione di procedere a 37 ° C per 1 ora. Utilizzare immediatamente o conservare a -80 ° C.

2. Preparazione di RNA Sequencing Gel

  1. Gel di Preparazione
    1. Pulire le piastre da un apparato gel di sequenziamento (Materials List) due volte con etanolo al 70% e acqua purificata, e assemblare la cella con un pettine e due distanziatori.
      Nota: Un piatto può essere rivestito con siliconatura reagente (Materials List) per facilitare la rimozione di gel nel passaggio 4.2.
    2. Sciogliere 33,6 g di urea in 22 ml di acqua e 16,4 ml di borato EDTA (TBE) tampone / (54 g tris (idrossimetil) aminomethane / 5x Tris; acido borico 27,5 g; 10 ml di 1 M di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 7,4 in 1 L di acqua) con un agitatore magnetico.
    3. Aggiungere 16 ml di 40% / soluzione acrilamide bis-acrilamide (19: 1) per la soluzione di urea e filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron.
    4. Aggiungere 514 microlitri al 10% (w / v) di persolfato di ammonio appena preparato in acqua seguita da 51,4 ​​microlitri N, N, N ', N' -Tetramethylethylenediamine (TEMED) alla soluzione filtrata.
    5. Capovolgere delicatamente la soluzione di gel al fine di evitare un eccessivo aerazione e iniettare immediatamente e senza intoppi nella cella di sequenziamento preconfezionata posizionato orizzontalmente dal foro di iniezione fondo. Fare attenzione a evitare di fare le bolle durante l'iniezione.
    6. Consentire 1-1,5 ore finché il gel sia completamente indurito prima dell'uso in un test di trascrizione. Il gel può essere conservato a temperatura ambiente per due o tre giorni, quando avvolto con tessuto bagnato acqua sulla parte superiore della cella sequenziamento.

3. Trascrizione di reazione

  1. Trascrizione Allungamento Assay Pausa
    1. Formazione di un complesso di allungamento trascrizione
      1. Aggiungere 1 ml di RNAP nucleo dell'enzima (1 mM magazzino in tampone trascrizione) in una provetta da 1,5 ml.
      2. Aggiungere 1 ml di purificato sigma-70 fattore (σ 70; 3 micron magazzino nel buffer di trascrizione) per la RNAP e incubare in ghiaccio per 10 minuti in modo da formare RNAP oloenzima.
      3. Aggiungere 3 ml 500 nM template purificato DNA (λ P R promotore dal prodotto pIA226 PCR) in tampone di trascrizione alla holoenzyme RNAP e incubare a 37 ° C per 5 minuti per formare il complesso aperto.
      4. Preparare una miscela di componenti di reazione in un'altra provetta da 1,5 ml con 5 ml di 10x tampone di trascrizione (Elenco materiali: 400 mM Tris-HCl, 1,6 M KCl, 100 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 50% glicerolo, pH 7,9 a DEPC trattati acqua), 2 ml di 250 micron ciascuna GTP e UTP, 1 ml di 1 mm ATP, e 1 ml di α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Aggiungere acqua trattata DEPC a 41 ml.
        Note: inibitore RNasi (Materials List) può essere usato per ridurre la contaminazione RNasi.
      5. Trasferire la soluzione della miscela nella provetta contenente il complesso aperto e incubare a 37 ° C per 15 minuti per formare il complesso di trascrizione allungamento fermato a +26 nt.
      6. Spostare la reazione a temperatura ambiente (~ 21 ° C) e aggiungere 1 ml di 2,5 mg / ml rifampicina ad una concentrazione finale di 50 pg / ml.
      7. Aggiungere 1 ml di 0,1 mM purificati Nusa alla miscela di reazione e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
      8. Aggiungere 2 ml di 250 mM CTP nella miscela di reazione per fare un volume finale di 50 microlitri e misurare il tempo di reazione usando un timer.
      9. Trasferimento 5 ml di soluzione di reazione in 2 ml di tampone RNA gel di carico (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e lo 0,05% xilene cianolo) a 30, 60, 120, 240, 480 e 1.200 sec per placare la reazione.
      10. Smaltire le punte 32 P UTP e tubi in un cont rifiuti radioattiviAiner.
  2. Trascrizione iniziazione Assay
    1. La formazione della Open Complex
      1. Diluire purificato σ 70-0,5 micron.
      2. Ripetere i punti 3.1.1.1 al 3.1.1.3 utilizzando 0,5 micron (invece di 3 micron) purificato σ 70, e il modello di DNA (la regione xyl promotore P dal prodotto pSG1154 PCR).
    2. L'inibizione di test iniziazione di trascrizione
      1. Aggiungere l'inibitore progettato per impedire la formazione di RNAP oloenzima di enzima nucleo RNAP prima dell'aggiunta σ 70 (dopo il passo 3.1.1.1), seguita da passi 3.1.1.2 e 3.1.1.3 di esaminare se l'inibitore è in grado di interrompere oloenzima formazione.
      2. In alternativa, dopo la fase 3.1.1.2, aggiungere l'inibitore di esaminare se sia in grado di inibire in modo competitivo σ 70 legame RNAP.
      3. Utilizzare la stessa quantità di DMSO, il solvente dell'inibitore, invece dell'inibitore stock nelle reazioni di controllo.
    3. Il completamento della reazione
      1. Sciogliere eparina in acqua ad una concentrazione stock di 1 mg / ml e magazzino a -20 ° C.
        Nota: L'eparina è un concorrente di DNA che può sequestrare RNAP che non ha formato un complesso aperto. Una volta che il complesso aperto è formato, eparina non può entrare nel sito di legame al DNA di RNAP e inibire la trascrizione dal complesso aperto preformato. Pertanto, l'eparina è richiesta solo per i dosaggi turno unico; non è necessario per le analisi multi-rotonde.
      2. Preparare la miscela di reazione con 5 ml di 10x tampone di trascrizione (Elenco materiali), 1 ml di 1 mg / ml di soluzione di eparina, 1 ml di 10 mm ciascuna ATP, GTP, e CTP, 2,5 mM UTP, e 1 ml di α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Aggiungere acqua trattata DEPC a 45 ml.
      3. Mescolare la miscela di reazione con la trascrizione complesso aperto, rotazione impulso e incubare a 37 ° C per 20 min.
      4. Trasferire 10 microlitri della reazione cosìluzione in 5 ml di tampone RNA gel di carico (95% formammide, 0,05% blu di bromofenolo e lo 0,05% xilene cianolo) per placare la reazione.

4. Esecuzione e sviluppo RNA Gel

  1. L'esecuzione del gel poliacrilammide denaturazione
    1. Attivare il gel a 50 ° C e 50 W in 1x tampone TBE per circa 1,5 ore fino a quando la temperatura del gel e il buffer è stabile a 50 ° C.
    2. campioni di calore a 90 ° C per 30 sec e spostarli sul ghiaccio prima di carico sul gel.
    3. Caricare i campioni nei pozzetti sulla parte superiore del gel fianco una corsia contenente 2 microlitri scaletta RNA (diluizione 1: 100).
    4. Attivare il gel a 50 W e 50 ° C in 1x tampone TBE fino a quando il colorante blu bromofenolo raggiunge ~ 2/3 verso il basso il gel.
  2. Trattamento Gel
    1. Aprire lentamente e con attenzione separare la piastra superiore dalla cella sequenziamento. Fare molta attenzione per evitare di rompere il gel.
    2. Cut chromatography carta (Materials List) in base alle dimensioni del gel dall'alto verso il colorante blu di bromofenolo. Utilizzare un contatore Geiger per confermare la posizione approssimativa di trascritti di RNA marcati radioattivamente.
    3. coprire con cura il gel con la carta da filtro, e premere con decisione fino a quando il gel aderisce alla carta da filtro. Tagliare e gettare il fondo del gel di rifiuti radioattivi come PTR non costituite corrono al fondo del gel, che può essere molto caldo.
    4. Posizionare un pezzo di dimensioni simili di carta da filtro sul letto di essiccazione di una macchina per essiccamento sotto vuoto, e adagiare il foglio gel rivestito su di esso con il gel verso l'alto.
    5. Coprire il gel con una pellicola trasparente e asciutto a 60 ° C per 1,5 ore.
    6. Avvolgere l'altro lato della carta da filtro rivestito gel di involucro di plastica e posizionare su un piatto fosforo fotostimolabile nel caso di imaging, con il tempo di esposizione appropriata, che può variare da 1 ora a seconda overnight sull'efficienza reazione.
    7. Immagine la piastra di fosforo conuno scanner imager in base alle istruzioni del produttore. Determinare l'intensità della banda relativa utilizzando il software ImageJ secondo il manuale del software.
    8. Utilizzare un contatore Geiger per controllare la contaminazione radioattiva nella zona di lavoro, pulire gli elementi sospetti e la zona con il tessuto e un detergente e smaltire il tessuto nel contenitore di smaltimento.

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Risultati

efficienza della trascrizione può essere determinata misurando il livello di radiazione nelle bande in diversi momenti. Il saggio pausa per testare la funzione di fattore di Nusa visualizzazione della pausa, terminazione attivata, e prodotti (Figura 1A) run-off. Alla presenza del dominio N-terminale di Nusa (Nusa NTD; residui di aminoacidi 1-137), l'aspetto dei prodotti di RNA è stato significativamente ritardato rispetto al esperimento di controllo manca NUSA. Soppr...

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Discussione

In tutti gli organismi, la trascrizione è un processo strettamente regolata. In vitro di trascrizione sono stati sviluppati per fornire una piattaforma per testare gli effetti dei fattori di trascrizione, piccole molecole e gli inibitori della trascrizione. In questo lavoro metodo, un saggio per la trascrizione batterica generale è stato descritto. saggi di trascrizione in combinazione con il sequenziamento elettroforesi su gel di trascrizioni sono molto importanti per gli studi meccanicistici in quanto consent...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro riconosce una sovvenzione per l'inizio della carriera della facoltà dell'Università di Newcastle (CM).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ottenere le proteine necessarie per il saggio
E. coli RNAPEpicentreS90250
Preparazione di acqua
DEPC dietilpirocarbonato (DEPC) Sigma-Aldrich D5758
Acqua senza RNasi 
Acqua senza nucleasi AmbionThermoFisherAM9937
Procedura guidata per la preparazione
  Plus SV Minipreps Sistema di purificazione del DNAPromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
Primer
Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System Spettrometro fluorometrico PromegaA9281
NanoDrop 3300Thermo ScientificND-3300
NTP Preparazione
ATPSigma-Aldrich A6559
UTPSigma-Aldrich U1006
GTPSigma-Aldrich G3776
CTPSigma-Aldrich C9274
rNTP ad alta purezzaGE Healthcare27-2025-01
α-32P UTP PerkinElmer   BLU007C001MCPreparazione
della scala di RNA composto radioattivo 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1– 1 kbMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich H7006
Cloruro di sodioSigma-Aldrich S7653
Cloruro di magnesioSigma-Aldrich M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
Preparazione
Cellula di sequenziamento dell'acido nucleico Sequi-Gen GTBio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich SL2
urea   Sigma-Aldrich U6504
tris(idrossimetil)amminometano   Sigma-Aldrich 
acido borico Sigma-Aldrich B7901
 Sigma-Aldrich ED
40% acrilammide/bis-acrilammide Sigma-Aldrich A9926
persolfato di ammonio Sigma-Aldrich A3678
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)Saggio
P9541
glicerolo   Sigma-Aldrich G5516
rifampicina   Sigma-Aldrich R3501
formammide   Sigma-Aldrich F9037
blu bromofenolo Sigma-Aldrich B0126
xilene cianolo Sigma-Aldrich X4126
eparina Sigma-Aldrich 84020
Inibitore della RNasina RibonucleasiPromegaN2511
Tampone di trascrizione 
Tris baseSigma-Aldrich T1503
Cloruro di potassioSigma-Aldrich P9541
Cloruro di magnesioSigma-AldrichM2393
DTT   Sigma-Aldrich Glicerolo DTT-RO
 Sigma-Aldrich G5516
Carta
Whatman  Carta per cromatografia Chr da 3 mmFisher Scientific05-714-5
Decontaminante
Decon 90decondecon90
Trattamento in gel
Imager Typhoon Trio+GE Healthcare Life Sciences63-0055-89
di trascrizionetrattata con del modello di DNAPCRdel gel154563Acido etilendiamminertetraacetico di trascrizione Sigma-Aldrich T9281 Cloruro di potassio Sigma-Aldrich da filtroradioattivo

Riferimenti

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