Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Sommario

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Abstract

I piccoli RNA non codificanti (miRNA) sono stati implicati in una varietà di malattie umane, comprese le sindromi metaboliche. Possono essere utilizzati come biomarcatori per la diagnosi e la prognosi o possono servire come bersagli per lo sviluppo di farmaci, rispettivamente. Recentemente è stato dimostrato che i miRNA sono trasportati nelle lipoproteine, in particolare nelle lipoproteine ad alta densità (HDL) e vengono consegnati alle cellule riceventi per l'assorbimento. Ciò solleva la possibilità che i miRNA svolgano un ruolo critico e cardine nella funzione cellulare e degli organi attraverso la regolazione dell'espressione genica, nonché messaggeri per le comunicazioni cellula-cellula e il crosstalk tra gli organi. Gli attuali metodi per l'isolamento dei miRNA da HDL purificato non sono pratici quando si utilizzano piccoli campioni su larga scala. Ciò è in gran parte dovuto ai metodi laboriosi e dispendiosi in termini di tempo utilizzati per l'isolamento delle lipoproteine. Abbiamo sviluppato un approccio semplificato per isolare rapidamente HDL purificato adatto per l'analisi dei miRNA da campioni di plasma. Questo metodo dovrebbe facilitare le indagini sul ruolo dei miRNA nella salute e nella malattia e in particolare fornire nuove informazioni sulla varietà di funzioni biologiche, al di fuori del trasporto inverso del colesterolo, che sono state attribuite alle HDL. Inoltre, le specie di miRNA presenti nelle HDL possono fornire preziose informazioni sui biomarcatori clinici per la diagnosi di varie malattie.

Introduzione

I microRNA sono minuscole specie di RNA endogene non codificanti che sono altamente conservate e sono considerate attori chiave nella regolazione di vari processi biologici degradando o reprimendo specifici RNA messaggeri bersaglio¹. Poiché i miRNA agiscono a livello intracellulare, sono stati esplorati come biomarcatori derivati dai tessuti che hanno portato alla scoperta delle funzioni tessuto-specifiche di questi miRNA. Tuttavia, i miRNA si trovano anche a livello extracellulare associati a proteine o in esosomi/micro vescicole che possono efficacemente proteggerli dalla degradazione da parte delle RNasi extracellulari². Studi più recenti hanno dimostrato che l'effetto protettivo delle HDL potrebbe non essere strettamente legato alla sua capacità di promuovere l'efflusso di colesterolo, ma piuttosto al suo carico non di colesterolo, in particolare come vettore di miRNA circolanti ^{3, 4}. Questi miRNA possono non solo modulare il metabolismo dei lipidi, ma sono anche associati agli effetti antinfiammatori, antiossidanti e antitrombotici del complesso HDL-miRNA ^{5, 6}.

Per esplorare ulteriormente il ruolo dei miRNA trasportati nelle particelle HDL, è necessario stabilire un protocollo semplice e facile per l'estrazione di miRNA da HDL isolati altamente purificati per l'uso nella routine clinica. Sono stati descritti numerosi metodi per isolare l'HDL. Questi metodi richiedono molto tempo o un grande volume di plasma che può richiedere il raggruppamento dei campioni, un'ampia dialisi per la desalinizzazione delle lipoproteine isolate e non rimuovono completamente gli esosomi come fonte di miRNA³, rispettivamente. Qui descriviamo un metodo semplice e rapido in grado di isolare i miRNA da HDL altamente purificati utilizzando piccoli volumi di campioni di sangue su scala più ampia. Riteniamo che questo metodo possa servire come buon riferimento per promuovere la ricerca sul ruolo dei miRNA circolanti e in particolare sul ruolo delle HDL nel facilitare la comunicazione tra varie cellule e organi.

Protocollo

1. Raccolta dei campioni di sangue

1. Raccogliere digiuno periferico campioni di sangue venoso in apposite provette 10 ml di plastica contenenti acido anticoagulante etilendiamminotetraacetico (EDTA) (che ha diversi vantaggi rispetto ad altri anticoagulanti) per venopuntura standard di una vena di primo piano nella fossa antecubitale.
2. Centrifugare i campioni di sangue a 1.600 xg per 20 min a 4 ° C in una centrifuga da tavolo per ottenere plasma privo di globuli rossi e piccole quantità di RNA.
3. Sequenziale centrifugare il surnatante a 3,000 g (4 ° C) in un rotore secchio oscillante per 10 minuti per rimuovere WBC e piastrine e quindi ulteriori 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari restante rispettivamente.
4. Misurare la densità del plasma utilizzando un densitometro a RT come da istruzioni fabbricazione.
   NOTA: la regolazione della densità (d = 1,023 g / ml) con soluzione fisiologica allo 0,9% può essere richiesto dopo la rimozione del esosomi ma prima gradiente di densità ultracentrifugazione.

2. Rimozione Exosome dal plasma

1. Rimuovere le exosomes circolanti che hanno una densità simile a HDL e rappresentano una quantitativamente rilevante fonte di miRNA ^3.
   1. Fare questo aggiungendo 252 microlitri soluzione exosome precipitazione di 1 ml di plasma seguita da incubazione per 30 minuti a 4 ° C. Per sedimentare le esosomi, centrifugare la miscela per 30 minuti a 1500 ga 4 ° C.
   2. Per isolare HDL, trasferire 1 ml del supernatante risultante a un policarbonato a pareti spesse tubo ultracentrifuga per ulteriore trattamento con gradiente di densità ultracentrifugazione (vedi sotto).

3. gradiente di densità Ultracentrifugazione (Figura 1).

1. Per separare HDL utilizzare un processo in 3 fasi che impiega un ultracentrifuga pavimento con un rotore ad angolo fisso che operano a 448.811 x G e 8 ° C, rispettivamente.
2. Preparare tre diverse soluzioni di densità in sequenza e fresco per ogni isolamento.
   1. Preparare la soluzione A (isolamento di VLDL, d = 1.006 g / ml) sciogliendo 11,4 g di NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml 1N NaOH in 1000 ml di acqua distillata autoclave-. Quindi aggiungere un ulteriore 3 ml di acqua distillata autoclave-.
   2. Preparare la soluzione B (isolamento di LDL, d = 1.182 g / ml), aggiungendo 25,2 g NaBr a 100 ml di soluzione A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Preparare la soluzione C (isolamento di HDL, d = 1.470 g / ml) mescolando 78,8 g NaBr con 100 ml di soluzione A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confermare la densità appropriata a temperatura ambiente utilizzando un densitometro. Conservare tutte le soluzioni a 4 ° C fino all'utilizzo.

4. Isolamento di VLDL

1. Mescolare 1 ml di plasma (densità media = 1.023 g / ml) e nucleasi libere 200 ml di grasso Red 7B in 6,5 ml in policarbonato tubo ultracentrifuga pareti spesse.
2. Poi strato accuratamente 5 ml di soluzione A in cima alla miscela. Se necessario, aggiungere ulteriori rosso grasso 7B sulla sommità della soluzione A to bilanciare il peso di ciascun tubo. Centrifuga per 2 ore (accelerazione - 5), (decelerazione - 7).
   NOTA: Durante la centrifugazione, le lipoproteine ​​sono accumulati come una banda a loro regioni di densità di equilibrio.
3. Alla fine della corsa osservare 2 strati. Rimuovere 1,5 ml della frazione VLDL che rappresenta lo strato superiore e conservare a 4 ° C.
4. Infine, utilizzando una pipetta di trasferimento 4 ml dal fondo della provetta contenente il LDL, HDL, albumina e frazione di acido grasso in un tubo in policarbonato per l'isolamento LDL.

5. Isolamento di LDL

1. Mescolare 2 ml di soluzione B e 100 microlitri di nucleasi senza grassi Red 7B nella provetta contenente la frazione LDL e HDL (sezione 4), rispettivamente.
2. Poi centrifugare per 3 ore (accelerazione 9, decelerazione 7). Successivamente, rimuovere 1,5 ml della frazione LDL che rappresenta lo strato superiore e mantenere a 4 ° C o conservare a -80 ° C. Infine, trasferire 4 ml dal fondo della provetta contenente il HDLfrazione in un nuovo tubo in policarbonato.

6. L'isolamento di HDL

1. Mescolare 2 ml di soluzione C, 100 microlitri di nucleasi senza grassi Red 7B e 15 ml di 98% β-mercaptoetanolo nella provetta contenente la frazione HDL, rispettivamente.
2. Centrifuga per 3 ore (accelerazione 9, la decelerazione 7). rimuovere Successivamente 2 ml della frazione HDL rappresentano lo strato superiore e sia mantenere a 4 ° C o conservare a -80 ° C.

7. Dissalazione e concentrazione delle lipoproteine ​​Frazioni

1. Per evitare interferenze con la successiva elettroforesi su gel di agarosio e PCR, rimuovere eccesso di sale aggiunto durante gradiente di densità ultracentrifugazione utilizzando dispositivi di filtro centrifugo con cutoff peso molecolare appropriato (tubo 3K per VLDL e tubo 10K per LDL / HDL), come descritto nelle istruzioni del produttore.
   1. In breve, dopo aver aggiunto 2,5 ml di PBS freddo (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mm Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) centrifuge l'intera frazione VLDL raccolte-in gradiente di densità ultracentrifugazione a 4 ° C per 60 minuti utilizzando un rotore oscillante.
   2. Desalt la frazione LDL due volte con 10 ml di PBS freddo ghiaccio per 30 minuti ciascuno. Successivamente, utilizzare 13 ml di ghiaccio freddo PBS due volte per la demineralizzazione della frazione HDL. Il volume PBS superiore è necessario per migliorare la mobilità con elettroforesi su gel di agarosio. Dopo la centrifugazione, rimuovere le lipoproteine ​​contenenti soluti e mantenere a 4 ° C o conservati a -80 ° C.

8. Agarosio elettroforesi su gel

1. Perfrom lipoproteina elettroforesi su gel di agarosio utilizzando il kit con modifiche minime di istruzioni del produttore come segue.
   NOTA: Questo passaggio è solo per valutare la qualità e la purezza dei campioni lipoproteine ​​concentrati.
   1. In breve, è necessario ottenere 6 ml della frazione lipoproteine ​​dissalato con gradiente di densità ultracentrifugazione e caricare su un gel di lipoproteina pre-cast. Utilizzare lipop umananorme rotein per VLDL, LDL e HDL come riferimento le dimensioni. Effettuare elettroforesi a temperatura ambiente a 100 V per 60 minuti utilizzando tampone Rep Prep.
   2. Essiccare il gel per 10 minuti e poi colorare per 10 min a temperatura ambiente con Fat Red 7B. Decolorare il gel in una miscela di metanolo-acqua 75:25 (v / v) e asciugare ancora per 5 min.

9. RNA estrazione e purificazione

1. Perfrom isolamento dei miRNA da purificata HDL umano utilizzando il kit di siero / plasma isolamento miRNA e purificazione.
   1. In breve, aggiungere 1 ml di RNA reagente di lisi a 200 ml di HDL purificata, mescolare con un vortex e poi incubate per 5 minuti a temperatura ambiente per garantire la completa dissociazione dei complessi nucleoproteici e l'inattivazione di RNasi.
   2. Poi spike 3,5 ml di sintetico Caenorhabditis elegans microRNA (miR-cel-39; 1,6 x 10 ⁸ copie / mL) nella miscela. Poi effettuare l'estrazione di RNA in base alle istruzioni del produttore.
2. eseguire purificatisu di estratto-miRNA con colonne di rotazione eluire come da istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione di miRNA da HDL purificato con un spectrophorometer.
   NOTA: eluizione di miRNA dalle colonne di spin impiegato 16 ml di acqua RNase-free.

10. trascrizione inversa (RT-PCR)

1. Isolare 100 ng del miRNA da HDL a spillo con miRNA sintetico (cel-miR-39) e reverse-trascritte in un volume di reazione di 20 microlitri utilizzando il kit di trascrizione inversa e secondo le istruzioni del produttore.
2. Effettuare controlli adeguati senza modello miRNA (NTC) e senza mix trascrittasi inversa enzima (NRT).

11. Real-time PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom Real-time PCR in un volume totale di 20 ml con 2 ml di una diluizione 1: 2 del cDNA, 10 microlitri PCR mix, 2 ml primer universale, 2 l di primer miRNA e acqua priva di RNasi 4 ml.
2. Eseguire i riattion in piastre da 96 pozzetti a 95 ° C per 15 minuti, seguiti da 45 cicli di 94 ° C per 15 sec e 55 ° C per 30 s ed una fase di estensione a 70 ° C per 30 s.ec perfrom tutte le reazioni in triplicato .
3. Avanti, calcuate quantità relative di miRNA utilizzando il metodo 2 ^-ΔΔ Ct dopo la normalizzazione al gene housekeeping sintetico secondo le istruzioni del produttore.

Risultati

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità dopo la rimozione di Esosomi
Per ottenere miRNA da HDL altamente purificato è necessario rimuovere esosomi che rappresentano una fonte di contaminazione miRNA ^7. Ciò è stato fatto prima gradiente di densità ultracentrifugazione con un kit disponibile in commercio. Per scopi pratici standard gradiente di densità protocollo ultracentrifugazione tre fasi sviluppato dalla società commerciale è stat...

Discussione

L'identificazione di nuovi biomarcatori dal sangue sarà di aiuto nella diagnosi clinica e la prognosi di varie malattie. I microRNA sono noti per possedere tutte le qualità di biomarcatori e hanno dimostrato in vari studi ^14-17. In questo studio abbiamo dimostrato metodo facile rapida e semplice per isolare miRNA da HDL plasma. Densità convenzionale gradiente metodo ultra-centrifugazione di isolamento di VLDL, LDL e HDL dipende accurata campionamento di plasma, preparazione precisa della soluzione tampone...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vacutainer in plastica Lavanda K2EDTA tubi	Becton, Dickinson and Company	366643
centrifuga	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R
Densitometro Densito 30PX	Mettler Toledo	MT51324450
soluzione ExoQuick	Invitrogen	4484451
Provetta per ultracentrifuga a pareti spesse in policarbonato	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrifuga	Thermo Scientific	46902
Rosso grasso 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Dispositivi di filtraggio centrifugo 10K	Millipore	UFC901008
Dispositivi di filtro ultra-centrifughi Amicon	3K Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Helena Laboratories	3344,3544T
Standard lipoproteici umani per VLDL, LDL e HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Helena Laboratories	3100
RNeasy MinElute colonne di spin	Analizzatore Qiagen
NanoDrop 1000	Kit Thermo Scientific
miScript II RT	Qiagen	218161
CFX96 Touch sistema di rilevamento PCR in tempo reale	BioRad
miRNeasy Kit siero/plasma	QIAGEN	217184
miScript Primer Saggi	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Controllo dei picchi di siero/plasma	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0,20 µ M filtro per siringa sterile	SIGMA-ALDRICH	Z227536