High-throughput screening degli enzimi carboidrati di degradazione Utilizzando Novel insolubile Chromogenic Substrate Assay Kit

Le tecniche per l'estrazione di genomi e metagenomi si sono sviluppate rapidamente negli ultimi anni, così come le strategie a medio e alto rendimento per il clonaggio e l'espressione di enzimi ricombinanti. Inoltre, le risorse bioinformatiche e i depositi associati, come (CAZy)^1,2, si sono notevolmente ampliati. Tuttavia, lo sfruttamento della diversità enzimatica microbica a fini industriali presenta notevoli sfide e la determinazione empirica delle attività enzimatiche è ormai diventata un serio collo di bottiglia. Ad esempio, si stima che, utilizzando i metodi attuali, possiamo prevedere con sicurezza le attività di non più del 4% delle proteine all'interno del database CAZy. Sebbene siano disponibili numerosi metodi per monitorare le attività enzimatiche, tutti presentano alcune limitazioni. Per valutare i frammenti oligomerici delle attività della glicosil idrolasi (GH) sono disponibili tecniche consolidate basate sulla cromatografia combinata con la spettrometria di massa^3,4. Tuttavia, questi approcci sono ad alta intensità di lavoro e generalmente a bassa produttività. I metodi basati sulla misurazione degli zuccheri riducenti, come i saggi dell'acido dinitrosalicilico⁵ e Nelson-Somogyi⁶, sono ampiamente utilizzati per valutare l'attività del GH. Tuttavia, questi saggi hanno una produttività limitata e possono essere soggetti a reazioni collaterali. I singoli substrati polisaccaridici cromogenici, come l'azzurrina reticolata (AZCL), sono ampiamente utilizzati per la determinazione delle attività enzimatiche, ma l'acquisto di tutti i substrati separatamente e la distribuzione manuale delle polveri di substrato all'interno della piastra di analisi può essere ingombrante e costoso⁷.

Abbiamo sviluppato una nuova generazione di substrati di idrogel polimerico cromogenico (CPH) basati su coloranti di clorotriazina che, se utilizzati in combinazione con una piastra filtrante a 96 pozzetti, formano un sistema di analisi ad alto rendimento. Sono stati sviluppati ulteriori substrati di biomassa cromogenica insolubile (ICB) che forniscono informazioni sulla disponibilità di substrati all'interno di miscele polimeriche complesse, come quelle esistenti nella biomassa lignocellulosica. Ogni substrato può essere prodotto in uno dei quattro colori e substrati di colori diversi possono essere combinati in un unico pozzetto. In questo protocollo è dimostrato che questa metodologia può essere applicata a un'ampia varietà di polisaccaridi e proteine e il potenziale per lo screening di GH, polisaccaridi litici monoossigenasi (LPMO) e proteasi. Protocolli specifici sono forniti per l'uso di piastre a 96 pozzetti e risultati rappresentativi illustrano l'elevata efficienza dei kit di substrati CPH e ICB come strumenti per lo screening enzimatico.

Un vantaggio significativo dei kit di analisi descritti, indipendentemente dal substrato, è che i kit sono pronti per l'uso entro 15 minuti, dopo la fase di attivazione. Ciò elimina la necessità di un lungo assemblaggio del saggio da materiali grezzi del substrato, come nel caso di altri metodi⁷. I substrati CPH e ICB hanno un'eccellente conservazione (almeno un anno a temperatura ambiente), stabilità del pH e della temperatura ⁸ e non richiedono attrezzature o formazione specializzate. I saggi CPH o ICB si basano su una piastra filtrante a 96 pozzetti all'interno della quale viene condotta la reazione con l'enzima. Se l'enzima è attivo con un dato substrato, vengono generati oligomeri colorati solubili, producendo un surnatante colorato che può quindi essere filtrato in una piastra regolare a 96 pozzetti utilizzando un collettore sottovuoto o una centrifuga ⁸.

I substrati sono tinti con coloranti clorotriazinici che assorbono nell'intervallo dello spettro visibile (VIS) e i singoli colori (rosso, blu, giallo e verde) possono essere risolti utilizzando la regressione lineare se diversi substrati CPH di colori diversi vengono mescolati in un singolo pozzetto e l'enzima agisce su più di un substrato. La piastra risultante con i surnatanti può essere misurata utilizzando un lettore di piastre per microtitolazione standard in grado di misurare l'assorbanza nell'intervallo VIS. La miscelazione di substrati diversi con colori diversi in un pozzetto aumenta la produttività del sistema di analisi, per un totale di 384 esperimenti in una piastra da 96 pozzetti (4 diversi substrati di colori diversi per pozzetto).

I substrati CPH forniscono uno strumento prezioso per valutare l'attività specifica di un enzima, mentre i substrati ICB vengono utilizzati per valutare la capacità di un enzima di digerire un componente nel contesto di miscele di substrati complessi che gli enzimi di solito incontrano all'interno della biomassa. Sebbene i substrati ICB non forniscano informazioni sulle specificità dei singoli enzimi, sono comunque strumenti utili per valutare le prestazioni commerciali di enzimi, cocktail o brodi.

1. Cromogenico Assay con CPH substrati in una zolla formato a 96 pozzetti

1. L'attivazione della piastra kit di analisi
   1. Attivare il filtro a 96 pozzetti (contenente blu CPH-xilano) kit di analisi piastra (elenco dei materiali) con l'aggiunta di una soluzione 200 ml di attivazione (ottenuti con il kit) in ciascun pozzetto, seguita da 10 minuti di incubazione a temperatura ambiente senza agitazione.
   2. Applicare vuoto usando un collettore di vuoto (con il blocco distanziale dentro e qualsiasi standard, trasparente piastra a 96 pozzetti come piastra di raccolta) per rimuovere soluzione di attivazione esistente. È anche possibile utilizzare una centrifuga a 2.700 xg per 10 min per questa fase invece del collettore del vuoto.
   3. Lavare i substrati CPH aggiungendo 100 microlitri di acqua sterile e applicare il vuoto (o la forza centrifuga) per rimuovere lo stabilizzatore. Ripetere questa operazione altre due volte e le piastre sono ora pronti per l'uso.
2. reazione enzimatica
   NOTA: includere sempre il tamponesolo come controllo negativo e, se possibile enzimi precedentemente caratterizzati come controlli positivi. Utilizzare un numero statisticamente adeguato di repliche. I substrati CPH sono stabili tra pH 3,0 al 10.0 e il volume totale di soluzione enzimatica fine buffer in ciascun pozzetto non dovrebbe superare 180 microlitri. estratto vegetale o brodo di coltura possono anche essere utilizzati al posto della soluzione enzima purificato.
   1. Aggiungere 150 microlitri 100 mM tampone di acetato di sodio, pH 4,5 e 5 microlitri endo soluzione -cellulase (ad una concentrazione finale di 1 U / ml) a ciascun pozzetto della piastra kit di analisi.
   2. Mettere la piastra di prodotto (una piastra chiara ben compatibile con il lettore di micropiastre-plate) sotto la piastra kit di analisi per raccogliere qualsiasi potenziale perdita dalla piastra di reazione durante l'agitazione.
   3. Incubare la piastra kit di test a 25 ° C per 30 minuti in un agitatore orizzontale a 150 rpm.
      NOTA: Miscelazione reazione nella piastra kit di analisi durante l'incubazione è essenziale per ottenere una costante e reprorisultato riducibile. substrati CPH sono stabili fino a 90 ° C. Il tempo di incubazione dovrebbe essere aumentata fino a 24 ore durante il test brodi di coltura contenente concentrazioni enzimatiche sconosciuti con substrati CPH. Si noti che appropriati tempi di incubazione dipendono dall'attività dell'enzima (s), ma in generale se non c'è attività rilevabile entro 24 ore, è probabile che l'enzima non si degradano il substrato testato. Un enzima attivo è degradante polisaccaridi cromogeni insolubili del substrato CPH in oligosaccaridi cromogenici solubili, che sono visibili come supernatante colorato.
   4. Posizionare la piastra prodotto pulito all'interno del collettore del vuoto con il blocco distanziale all'interno.
   5. Posizionare il kit piastra di analisi sulla parte superiore e applicare il vuoto (pressione negativa massima di -60 kPa). È anche possibile utilizzare una centrifuga a 2.700 xg per 10 min.
      NOTA: Il filtrato contenente oligosaccaridi colorati come prodotto di reazione è ora nella piastra prodotto per ulteriori analisi ⁸
3. Individuazione e la quantificazione
   1. Verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto della piastra prodotto è circa la stessa mediante ispezione visiva.
   2. Leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 595 nm per il blu CPH-xilano utilizzando un lettore di piastre.
   3. Quando si effettua l'analisi dei dati, sottrarre il buffer-unici valori di controllo negativo dai valori dai pozzetti in cui è stato aggiunto un enzima. Calcolare il valore medio e l'errore standard di mezzi (SEM) dai pozzetti replicati ^8.

2. Cromogenico Assay con ICB substrati in un formato a 96 pozzetti

1. reazione enzimatica
   1. Aggiungere 150 microlitri 100 mM tampone di acetato di sodio, pH 4,5 e 5 microlitri 31 U / ml endo -xylanase soluzione a ciascun pozzetto della piastra kit di analisi contenente paglia rosso ICB grano (concentrazione dell'enzima finale nel pozzetto: 1 U / ml) .
      NOTA: Le piastre kit di analisi (filtro a 96 pozzetti plAtes contenenti substrati ICB) sono realizzati come descritto in letteratura (vedi elenco dei materiali). I substrati ICB sono stabili nel buffer con un intervallo di pH compreso tra pH 3,0 e 10,0. Sempre includere tampone da solo come un controllo negativo, enzimi commerciali come controllo positivo e utilizzare un numero statisticamente adeguato di repliche.
      1. Non attivare i substrati ICB come la piastra di supporto CPH, ma rimuovere lo stabilizzatore lavando tre volte con 100 ml di acqua seguita da filtrazione sotto vuoto o centrifugazione.
   2. Mettere la piastra di prodotto sotto la piastra di supporto per raccogliere qualsiasi potenziale perdita dalla piastra di supporto durante l'agitazione.
   3. Incubare la reazione a 25 ° C agitando a 150 rpm per 2 ore.
      NOTA: Un enzima attivo è degradante i polisaccaridi insolubili cromogeniche nel substrato ICB in oligosaccaridi solubili, che sono visibili come surnatante colorato. substrati ICB sono stabili fino a 90 ° C. L'incubazione time dovrebbe essere aumentato fino a 24 ore se si utilizzano gli enzimi non purificato, come brodi di coltura.
   4. Posizionare la piastra prodotto all'interno del collettore del vuoto con il blocco distanziale all'interno.
   5. Posizionare il kit piastra di test sopra, applicare il vuoto (pressione negativa massima di -60 kPa) o utilizzare una centrifuga per filtrare il prodotto dalla piastra kit di analisi nel pozzo della piastra prodotto.
      NOTA: Il filtrato contenente oligosaccaridi colorati come prodotto di reazione è ora nella piastra di raccolta per ulteriori analisi ^8.
2. Rilevamento e la quantificazione
   1. Verificare che il volume di liquido in ciascun pozzetto della piastra di raccolta è circa la stessa mediante ispezione visiva.
   2. Leggere l'assorbanza della piastra di raccolta a 517 nm per il rosso paglia ICB-grano utilizzando un lettore di piastre.
   3. Quando si effettua l'analisi dei dati - sottrarre il tampone - solo i valori di controllo negativo dai valori dai pozzetti in cui un enzimaè stato aggiunto. Calcolare il valore medio e l'errore standard di mezzi (SEM) dai pozzetti replicati ^8.
      NOTA: Nel caso di screening di enzimi sconosciuti, si consiglia di effettuare una serie di diluizioni al fine di ottenere dati più dettagliati circa la gamma dinamica dell'attività dell'enzima.

L'alta produttività e la capacità di multiplexing di questo test si basa su insolubile polimero cromogenico (o proteine) idrogel (CPH) substrati disposti in piastre filtranti da 96 pozzetti. Enzimi così come controlli negativi vengono aggiunti alla piastra kit di analisi (Figura 1A) e gli enzimi degradano corrispondente substrato producendo un surnatante colorata (Figura 1B). Dopo che la reazione è terminata, il supernatante viene trasferito in una piastra prodotto chiaro pozzetti e l'assorbanza può essere misurata direttamente mediante uno spettrofotometro adatto per piastre a 96 pozzetti (Figura 1C).

Un esempio di risposta dose di CPH-arabinoxilano per xilanasi a diverse concentrazioni di enzima (0.00 - 0.75 U / ml) è mostrato in figura 1D in cui la concentrazione dell'enzima discendente può essere osservato visivamente. Una più dettagliata quant spettrofotometricaification può essere usato per tracciare l'assorbanza rispetto alla concentrazione di enzima (Figura 1E). L'intensità del segnale corrisponde all'attività enzimatica. La riproducibilità del test è indicato dalle barre di errore (errore standard della media, SEM, di tre repliche). Esperimenti più dettagliate sulla riproducibilità di questo test sono pubblicati altrove 8.

Figura 1. trattamento Xylanase di CPH-arabinoxilano. A) Uno schema della piastra kit di analisi con il substrato CPH (ad esempio, CPH-arabinoxilano) caricato in pozzetti della piastra filtrante a 96 pozzetti appena prima l'aggiunta di enzimi 1 e 2 e il buffer controllo -solo (enzima 1 aveva attività -xylanase endo); B) degradazione di CPH-arabinoxilano da enzima 1 ha prodotto un surnatante di colore; c) su filtrat vuoto-assistitaione dei supernatanti in alla piastra di prodotto, l'assorbanza viene misurata spettrofotometricamente; D) piastra prodotto contenente i prodotti di reazione dopo il trattamento di CPH-arabinoxilano in 4 colori differenti con differenti concentrazioni di endo -β-1,4-xilanasi a 100 mM tampone acetato di sodio, pH 4,5 per 60 minuti a temperatura ambiente;. E) Quantificazione dei prodotti di reazione da D utilizzando spettrofotometria cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Ci sono diverse opzioni per l'utilizzo di questo test nello screening degli enzimi. Una possibilità è quella di utilizzare una piastra a 96 pozzetti contenente polisaccaridi diversi per lo screening, ad esempio, un piccolo numero di (purificata) endo enzimi con attività di sconosciuto. In questo caso il risultato mostrerà quali polisaccaridi sono DEGRADgrado dall'enzima destinazione. Per dimostrare questo principio, un -cellulase endo è stato testato contro diversi substrati CPH a 25 ° C. Tre diverse concentrazioni enzimatiche (0,5 U / ml, 1,0 U / ml e 5 U / ml) sono state incubate per 30 min. Il risultato è chiaramente visibile nella piastra prodotto (Figura 2A). La scheda prodotto per questo endo -cellulase a disposizione dal fornitore specifica laterale di attività per xyloglucan (Tamarind), orzo β-glucano, glucomannano, xilano legno di betulla e bassa laterale di attività per galattomannano. Coerentemente con questo, l'attività aggiuntiva per cellulasi è stata trovata contro CPH-β-glucano (orzo), CPH-xyloglucan (tamarindo), CPH-xilano (faggio) e bassa attività contro CPH-galattomannano (Figura 2B). Glucomannano non è stato testato. Gli stessi substrati CPH sono stati digeriti con gli enzimi disponibili commerciali (tre differenti concentrazioni enzimatiche: 0.1 U / ml, 0,5 U / ml e 1,0 U / ml) utilizzati come controlli positivi nelle stesse condizioni del precedentesperimentare. Tutti i substrati sono stati degradati dall'enzima controllo positivo e l'intensità del segnale aumentato corrispondente ad elevata concentrazione dell'enzima (Figura 2C).

Figura 2. Otto differenti substrati CPH state incubate sotto agitazione a 25 ° C per 30 minuti. A) La piastra prodotto diversi substrati CPH digerito con endo -cellulase, a diverse concentrazioni. B) Determinazione dell'attività e in varie attività lato l'endo -cellulase. Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di tre repliche C) Attività di diversi enzimi commerciali al corrispondente substrato CPH (endo-cellulasi e 2-HE-cellulosa. E-LAMSE e CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucano (orzo); e-XYAN4 e CPH-xylan, e-XEGP e CPH-xyloglucan, E-BLAAM e CPH-amilosio, E-BMACJ e CPH-galattomannano; tutti gli enzimi da Megazyme). Le barre di errore rappresentano l'errore standard della media di due repliche. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

La biomassa cromogenico (ICB) substrati insolubili sono un'utile aggiunta al repertorio substrato cromogenico perché conservano in parte la disposizione naturale di polisaccaridi a pareti cellulari delle piante, che sono il principale costituente delle biomasse. CPH e ICB supporti sono utilizzati nel nostro esempio per analizzare i enzimi secreti di Phanerochaete chrysosporium quando coltivato in mezzo liquido. Il setup piatto della piastra kit di analisi è mostrato in Figura 3A, con 19 CPH substrati e 5 substrati ICB (4 pozzetti per ciascun substrato, Figura 3B). P. chrysosporium era cultivatDE per tre giorni e poi il supernatante della coltura analizzato. Pertanto, 125 microlitri 200 mM tampone è stato trasferito a ciascun supernatante di coltura bene e 25 microlitri aggiunto. Tre differenti condizioni di pH sono stati testati utilizzando tampone di acetato di sodio pH 4,0, tampone sodio fosfato pH 6,0 o pH 8,0 (Figura 3C). La piastra è stata incubata agitando (150 rpm) a 25 ° C per 2 ore.

I prodotti di reazione sono stati trasferiti alla piastra prodotto (Figura 3D) e analizzati. P. chrysosporium prodotta enzimi per la degradazione di vari glucani, amido e xilani (Figura 3E). segnali inferiori potrebbero essere rilevati per il arabinan emicellulose (barbabietole da zucchero) e galattano pectic nonché per RGI (soia). Gli enzimi prodotti erano più attivi in ​​condizioni acide (pH 4,0) che in condizioni neutre o leggermente basici (pH 8,0). Attività inferiore verso substrati ICB (Figura 3F)dimostra che quando i polisaccaridi sono in un contesto più naturale, l'efficienza dell'enzima non è la stessa con un polisaccaride puro ed è per questo substrati ICB dimostrano una visione più realistica sull'efficienza enzima, se è stato applicato a crudo o pre materiale vegetale trattata.

Figura 3. Proiezione di un surnatante cultura da una vecchia coltura liquida di 3 giorni di Phanerochaete chrysosporium utilizzando una piastra a più substrato contenente 19 CPH e 5 substrati ICB. A) un programma di setup piastra con 4 pozzi per ogni singolo substrato (sfondo grigio = substrati CPH, sfondo arancione = substrati ICB). B) Immagine della piastra saggio contenente il substrato. C) Schema che mostra le condizioni di buffer utilizzati in tale esperimento (200 mM acetato di sodio pH 4,0, fosfato pH sodio 6,0 e sodio fosfato pH 8,0). D) immagine della piastra prodotto dopo 2 ore a 25 ° C. E) Assorbanze stati rilevati a 517 nm e tracciati per ogni singolo substrato CPH e F ) risultati substrato ICB per i rispettivi enzimi. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

I substrati cromogeni possono anche essere utilizzati per studiare gli effetti sinergici utilizzando una miscela di diversi substrati CPH colorate in un pozzetto e analizzare il supernatante reazione dopo trattamento con enzimi singoli o enzima cocktail.

Nel seguente esempio mostrato in Figura 4, rosso CPH-cellulosa e substrati CPH-xilano giallo sono state mescolate insieme in un approssimativamente equal rapporto in 96 pozzetti pozzetti della piastra filtrante. La figura 4A mostra i prodotti di reazione di colore dopo il trattamento di 1 ora a temperatura ambiente senza enzima (controllo), cel cellulosa (2 U / ml), xilanasi xyl (1 U / ml) e miscela di entrambi gli enzimi (3 repliche per ogni approccio) in 100 mM sodio acetato tampone pH 4.5. Per l'analisi, il prodotto di reazione viene quantificato spettrofotometricamente scansione spettro di assorbimento da 350 nm a 700 nm (Figura 4B). Spesso ispezione visiva da sola può dare un'indicazione del fatto che l'enzima agisce su uno o più supporti, tuttavia registrato assorbanza spettri derivanti da diversi coloranti possono anche essere risolto utilizzando semplice regressione lineare 8 per dare un'indicazione più precisa della portata di degrado di ogni substrato dalla miscela.

Usando substrati CPH come miscele sostanzialmente aggiunge il throughput del test, consentendo screening contro un massimo di 4 supporti differenti in un esperimento (un bene). Nell'esempio illustrato sono quattro diversi substrati utilizzati: blu CPH-β-glucano (orzo), giallo CPH-xilano (legno di faggio), verde CPH-amilosio e galattano CPH-pectic rosso (lupino). Il layout della piastra substrato è mostrato in figura 4C e un'immagine della piastra di test in figura 4D. La reazione è stata eseguita in 100 mM sodio acetato tampone pH 4,5 per 30 minuti a 25 ° C e 150 rpm. Primi enzimi singoli con l'aumentare della concentrazione dell'enzima sono stati testati con il corrispondente substrato CPH (Figura 4E) e il supernatante è stato ricevuto colorata come previsto nella piastra prodotto (Figura 4F, fila 1A - 12D). Riga E conteneva i due diversi substrati CPH giallo CPH-xylan e blu CPH-β-glucano, che sono stati degradato con diversi rapporti di enzimi corrispondenti endo -xylanase e di endo -glucanase. Dopo la reazione, il risultato è visible nella piastra di prodotto: il colore del prodotto di reazione era più scuro verde-blu, quando più endo -glucanase era presente (Figura 4F, 4E-6E) e trasformato in un accendino giallo-verde, quando l'endo -xylanase concentrazione aumentata ( Figura 4F, 10-12E). Lo stesso è visto in fila F, dove i due substrati rosso CPH-pectic galattano e giallo CPH-Xylan sono stati degradati con endo -galactanase e di endo -xylanase. Tutti e quattro differenti substrato CPH colorato erano presenti (Figura 4F, 1G-12F) e enzimi singoli degradato substrato CPH appropriato e aggiungendo ulteriori enzimi una combinazione dei prodotti di reazione di colore è stato ricevuto.

Figura 4. Una combinazione di due differenti substrati CPH, rosso CPH-cellulosa e giallo CPH-xilano, trattata con diversi enzimi. UN) Surnatanti reazione dopo il trattamento di due substrati con endo -cellulase (CEL) o endo -xylanase (Xyl) o entrambi gli enzimi. B) spettri di assorbimento dei surnatanti di reazione. Una combinazione di quattro diversi substrati CPH trattati con differenti enzimi C) Schema della piastra substrato contenente substrati CPH:. Blue CPH-β-glucano (orzo), giallo CPH-xilano (faggio), verde CPH-amilosio e CPH- rossa galattano pectic (lupino) D) Immagine della piastra di test contenente i diversi substrati CPH E) Schema della piastra di prodotto che mostra il rapporto degli enzimi aggiunti (concentrazioni nominali (NC):.. glu = 1 U / ml endo -glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo -amylase e gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Immagine della piastra prodotto dopo 30 minuti di incubazione a 25 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Elenco delle disponibile Chromogenic polimeri idrogel (CPH) e substrati insolubile cromogenico biomassa (ICB).

Ci sono due domande di brevetto depositate coinvolge il test substrato piatto CPH 96 pozzetti e 96 pozzetti test substrato ICB (WO2015036000 e Danimarca PA 2015 70311).