Illustriamo qui un saggio di legame della membrana in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e le membrane lipidiche vengono analizzate visivamente utilizzando Gag con tag YFP sintetizzato in un sistema di traduzione in vitro basato su germe di grano e GUVs preparati con una tecnica di elettroformazione.
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Articolo metodologico
Visualizzazione del virus HIV-1 gag rilegatura a Giant unilamellari vescicole (GUV) Membrane
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteina strutturale del virus HIV-1, Pr55 Gag (o Gag), si lega alla membrana plasmatica in cellule durante il processo di assemblaggio virus. legame di Gag membrana è un passo essenziale per la formazione di particelle di virus, dal momento che un difetto nella membrana Gag risultati vincolanti in grave compromissione della produzione di particelle virali. Per ottenere i dettagli meccanicistici di interazioni di membrana Gag-lipidi, metodi in vitro basati sulla risonanza magnetica nucleare, footprinting proteine, risonanza plasmonica di superficie, liposomi flottazione centrifugazione, o tallone di fluorescenza dei lipidi vincolanti sono stati sviluppati finora. Tuttavia, ciascuno di questi metodi in vitro ha i suoi limiti. Per superare alcune di queste limitazioni e fornire un approccio complementare ai metodi precedentemente stabiliti, abbiamo sviluppato un test in vitro in cui le interazioni tra HIV-1 Gag e membrane lipidiche si svolgono in un ambiente "cell-like". In questo saggio, Gag legame con membrane lipidiche viene analizzato visivamente utilizzando YFP-Tagged Gag sintetizzato in un germe di grano, con sede a sistema di traduzione vitro e GUVs preparati da una tecnica electroformation. Qui si descrive lo sfondo e dei protocolli di ottenere proteine Gag full-length myristoylated e membrane GUV necessarie per il test e di individuare Gag-GUV vincolante al microscopio.
Introduzione
dell'immunodeficienza umana di tipo 1 del virus (HIV-1) è un virus con involucro che assembla a gemme e dalla membrana plasmatica (PM) nella maggior parte dei tipi di cellule. L'assemblaggio del virus HIV-1 particelle virali è guidato dal 55 kDa proteina virale chiamata nucleo Pr55 Gag (Gag). Gag è sintetizzato come un precursore poliproteico composta da quattro principali domini strutturali, ovvero matrice, capside, nucleocapside e p6, nonché peptidi due distanziatori SP1 e SP2. Durante il montaggio, la matrice (MA) dominio è responsabile per il targeting di Gag al sito di assemblaggio, il capside (CA) dominio media interazioni-Gag Gag, il nucleoc....
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Protocollo
Giorno 1: Espressione di proteine Gag Uso del germe di grano lisato-based in vitro trascrizione-traduzione sistema
1. Preparazione del virus HIV-1 gag
- Rimuovere tutti i reagenti del kit commerciale CECF germe di grano da congelatori (lisati germe di grano sono conservati a -80 ° C; altri reagenti a -20 ° C). Li Scongelare su ghiaccio e miscelare i componenti come mostrato nella Tabella 1.
| Mix-1 (alimentazione della miscela) | |
| soluzione di aliment.... |
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Risultati
Utilizzando il protocollo di cui sopra, abbiamo preparato GUVs composto da POPC + POPS + Chol (rapporto molare: 4.66: 2.33: 3). Questa composizione è stata scelta in modo da riflettere circa le concentrazioni di PS e di colesterolo del PM. Robusto ed efficiente vincolante di Gag è stato osservato solo quando il cervello-PI (4,5) P2 è stato incluso nella miscela POPC + POPS + Chol (PI-cervello (4,5) P 2 [rapporto molare POPC + POPS + Chol + : 4: 2: 3: 1] in que.......
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Discussione
Il saggio di legame GUV come descritto sopra fornisce una buona alternativa in scenari in cui altri test interazione proteina-lipide hanno i loro limiti. Questo test ci permette di esaminare le interazioni tra myristoylated Gag a figura intera e lipidi acidi con catene acilici lunghezza nativa nel contesto doppio strato lipidico e farlo senza lunghe centrifugazione di galleggiamento grazie ad alta densità gradienti di saccarosio o di altre lavorazioni di post-binding di Gag-lipidico complessi. Un altro vantaggio è che i.......
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Dichiarazioni
Dichiariamo di non avere interessi in conflitto.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Mohammad Saleem, Jing Wu e Krishnan Raghunathan per le discussioni utili. Ringraziamo anche Priya Begani per l'assistenza durante le riprese. Questo lavoro è sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 AI071727 (Ao) e R01 GM110052 (a SLV).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Multimetro digitale | Meterman | 30XR | Un multimetro generico in grado di misurare la resistenza e i volt servirà allo scopo. |
| Generatore di funzioni | Instek | GFG-8216A | È sufficiente un generatore di funzioni generico in grado di generare un'onda sinusoidale a 10 Hz e 1 V. |
| Vetrini in vetro rivestito ITO Delta | Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubatore | Hoefer | Qualsiasi incubatore in grado di mantenere con precisione la temperatura sarà sufficiente | |
| Camera a vuoto | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Siringa | Hamilton | 80400 | Calibro 22S, numero di siringa 702 |
| Kit | base in elastomero PDMS Sylgard, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Kit CECF per germe di grano | BiotechRabbit, Berlino, Germania | BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Lipidi Polari, Alabastro, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Colesterolo | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipidi | 840046X |
Riferimenti
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A.
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Ristampe e permessi
