Questo protocollo descrive l'applicazione della tomografia combinata a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) imaging e micro-computerizzata (microCT) per la visualizzazione tromboembolie cerebrale. Questa tecnica consente la quantificazione del carico trombotico ed evoluzione. La tecnica di imaging NIRF visualizza fluorescente trombo nel cervello asportato, mentre la tecnica microCT visualizza trombo all'interno gli animali viventi utilizzando oro-nanoparticelle.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie
In questo articolo
Sommario
Abstract
l'imaging diretto trombo visualizza la causa principale di infarto tromboembolica. Essere in grado di immagine trombo permette direttamente di gran lunga migliore ricerca di ictus che basarsi su misure indirette, e sarà uno strumento potente e robusto ricerca vascolare. Usiamo un approccio di imaging ottico che etichetta trombi con un pennarello l'imaging molecolare trombo - una sonda fluorescente Cy5.5 vicino infrarosso (NIRF) che è legata covalentemente ai filamenti di fibrina del trombo dall'azione enzimatica fibrina reticolazione di attivazione fattore della coagulazione XIIIa durante il processo di maturazione coagulo. Un micro-tomografia computerizzata (microCT) approccio basata su utilizza nanoparticelle di oro trombo-seeking (AuNPs) funzionalizzati di indirizzare il componente principale del coagulo: fibrina. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la combinata in vivo microCT e ex vivo l'imaging NIRF di tromboembolie in un modello murino di ictus embolico. Abbiamo dimostrato che in vivo </ em> microCT e AuNPs glicole-chitosano fibrina mirati (FIB-GC-AuNPs) può essere utilizzato per la visualizzazione sia in situ trombi e cerebrale trombi embolico. Descriviamo anche l'uso di imaging in vivo trombo diretta microCT-based per monitorare serialmente gli effetti terapeutici del plasminogeno tissutale trombolisi attivatore-mediata. Dopo l'ultima sessione di imaging, dimostriamo da ex vivo NIRF imaging la portata e la distribuzione di tromboembolie residua nel cervello. Infine, si descrive l'immagine di analisi quantitative e microCT NIRF dati di imaging. La tecnica combinata di immagini dirette trombo permette due metodi indipendenti di visualizzazione trombo da confrontare: l'area del segnale fluorescente trombi correlati a ex vivo NIRF l'imaging rispetto al volume di iperdensa microCT trombi in vivo.
Introduzione
Uno in 6 persone avranno un ictus a un certo punto nella loro vita. Ictus ischemico è di gran lunga il tipo di tratto più comune, e rappresenta circa il 80 per cento di tutti i casi di ictus. Perché tromboembolie causano la maggior parte di questi ictus ischemico, vi è un crescente interesse per l'imaging diretto trombo.
E 'stato stimato che circa 2 milioni di cellule cerebrali muoiono durante ogni minuto di cerebrale media occlusione dell'arteria 1, che porta lo slogan "Il tempo è cervello". La tomografia computerizzata (CT) studi può essere fatto rapidamente, e sono ampiamente disponibili; Per questo motivo, CT ri....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutte le procedure sugli animali hanno dimostrato in questo protocollo sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso di animali Ilsan Hospital Dongguk University e condotto in conformità con i principi e le procedure descritte nella Guida NIH per la cura e l'uso di animali.
1. Preparazione di esogena coagulo formato etichetta con la fluorescenza Marker (Figura 1)
- Anestetizzare un topo in una camera di induzione utilizzando 3% isoflurano miscelato con il 30% di ossigeno (1,5 L / min 100% di ossigeno). Assicurare un'adeguata profondità dell'anestesia osservando tono muscolare e confermando l'assenza del riflesso pu....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Immagini Baseline microCT, ottenuti in vivo dopo somministrazione FIB-GC-AUNP (10 mg / ml, 300 ml) in 1 ora dopo ictus embolico, chiaramente visualizzato trombo cerebrale nel MCA - ACA zona biforcazione distale dell'arteria carotide interna (Figura 6 ). Follow-up di immagini microCT non ha mostrato alcun cambiamento nel trombo mucca con trattamento salino. Tuttavia, il trattamento con tPA mostrato una graduale dissoluzione del trombo COW (frecce blu in
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Abbiamo dimostrato l'uso di due complementari molecolari tecniche di imaging per l'imaging trombo diretta in modelli sperimentali di ictus embolico: un fibrina mirata nanoparticelle d'oro (FIB-GC-AUNP) per l'imaging microCT-based in vivo, e un FXIIIa mirato sonda di imaging ottico per ex vivo per immagini a fluorescenza.
Dopo somministrazione endovenosa di fib-GC-AuNPs, trombi divenne visibile alla TC come strutture dense, causata dalle particelle diventando.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
DE.K., JY.K, CH.A, e KK sono i titolari di brevetti di nanoparticelle d'oro di fibrina mirati (10-1474063-0000, coreano Intellectual Property Office). I restanti autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Corea Healthcare Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare (HI12C1847, HI12C0066), il Programma di Bio & Medical Technology Development (2.010-0.019.862) e programma di Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) del Fondazione nazionale delle Ricerche, finanziato dal governo coreano.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Corea | NFR Polaris-G90 | |
| Sistema di imaging NIRF | Roper-scientific, Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flussimetro | Perimed, Stoccolma, Svezia | PeriFlux System 5000 | |
| Microscopio operatorio | Leica Microsystems, Seoul, Corea | EZ4HD | |
| Macchina per anestesia per inalazione | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| Controllo NFR | NanoFocusRay, JeonJu, Corea | NFR Polaris-G90 | microCT software di controllo |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Corea | Lucion | 3D rendering imaging software |
| Cartella clinica 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Cartella clinica 7 | rCBF |
| Software ImageJ | Wanye Rasband, NIH, USA | Analisi di imaging | 1.49d |
| Dispositivi/Strumenti | |||
| Pompa per infusione | Harvard, Massachusetts, USA | pompa 22(55-2226) | |
| Coperta omeotermica | Panlab, Barcellona, Spagna | HB101 | |
| Cauterizzazione tascabile | Daejong, Seoul, Corea | DJE-39 | |
| Matrice cerebrale | Ted pella, CA, USA | 15003 | sezione coronale |
| PE-50 tubo | Natsume, Tokyo, Giappone | SP-45 (PE-50) | ID 0,58 mm O.D. 0,96 mm |
| Tubo PE-10 | Natsume, Tokyo, Giappone | SP-10 (PE-10) | ID 0,28 mm O.D. 0,61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Corea | ||
| Siringa | CPL-medical, Ansan, Corea | 1 & 3 cc | |
| Garza | Panamedic, Cheonan, Corea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Corea | 3M-810 | |
| Micro pinze | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro forbice | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8,5 cm |
| Sutura in seta nera | Ailee, Busan, Corea | SK6071, SK728 | 6-0 e 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Corea | ||
| unguento veterinario | Novartis, Basilea, Svizzera | ||
| 10% iodio povidone (betadina) | Firson, Cheon-an, Corea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, Stati Uniti | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurano | Hana-Pham, Gyeonggi, Corea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Corea | LB001-02 | 500 ml |
| Nanoparticelle | d'oro | ||
| C15 agente ottico | Sintesi | ||
| Attivatore tissutale del plasminogeno | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germania | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Soluzione salina normale | Daihan Pham, Seoul, Corea | 48N3AF3 | Confezione da 20 ml |
Riferimenti
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
