A High-contenuti In Vitro La replica della piattaforma Discovery isole pancreatiche β-cellule

Sommario

sfide critiche per il campo di ricerca sul diabete sono di comprendere i meccanismi molecolari che regolano la replicazione isolotto β-cellule e di sviluppare metodi per stimolando la rigenerazione delle cellule β-. Qui un metodo ad alto contenuto di screening per identificare e valutare l'attività di replica di promozione β-cellule di piccole molecole è presentato.

Abstract

La perdita di cellule β produttrici di insulina è una caratteristica centrale del diabete. Mentre si sta esplorando una varietà di potenziali terapie sostitutive, l'espansione delle cellule β delle isole pancreatiche endogene produttrici di insulina rimane una strategia interessante. β-cellule hanno una limitata attività rigenerativa spontanea; Di conseguenza, uno sforzo di ricerca cruciale è quello di sviluppare una comprensione precisa dei percorsi molecolari che frenano la crescita delle cellule β e di identificare farmaci in grado di superare queste restrizioni. In questo articolo viene presentato un metodo automatizzato di screening delle cellule primarie ad alto contenuto di immagini per identificare piccole molecole che promuovono la replicazione delle cellule β. Diversi limiti delle metodologie precedenti sono stati superati. In primo luogo, l'uso di cellule insulari primarie piuttosto che di una linea cellulare immortalizzata massimizza la ritenzione dei vincoli di crescita in vivo. In secondo luogo, l'uso di colture di cellule insulari a composizione mista piuttosto che di una linea di β cellule consente l'identificazione sia di stimolatori di crescita limitati al lignaggio che di stimolatori di crescita generali. In terzo luogo, la tecnica rende pratico l'uso delle isole primarie, una risorsa limitante, attraverso l'uso di un formato a 384 pozzetti. In quarto luogo, la dannosa variabilità sperimentale associata alla qualità irregolare della coltura delle isole viene superata attraverso l'ottimizzazione dei parametri di isolamento, dispersione, placcatura e coltura. In quinto luogo, le difficoltà di misurare in modo accurato e coerente il basso tasso di replicazione basale delle cellule endocrine insulari sono superate con parametri di immunocolorazione ottimizzati, acquisizione e analisi automatizzate dei dati; L'automazione migliora contemporaneamente la produttività e limita la distorsione dello sperimentatore. I limiti notevoli di questo test sono l'uso di colture di isole disperse che interrompono l'architettura delle isole, l'uso di roditori piuttosto che di isole umane e le limitazioni intrinseche di produttività e costi associati all'uso di cellule primarie. È importante sottolineare che la strategia è facilmente adattabile per gli studi di replicazione delle isole umane. Questo test è particolarmente adatto per studiare l'effetto mitogenico delle sostanze sulle cellule β e i meccanismi molecolari che regolano la crescita delle cellule β.

Introduzione

Diabete comprende una raccolta di disturbi che condividono il punto finale di omeostasi del glucosio perturbato comune. Sebbene i meccanismi patogenetici dei sottotipi di diabete sono distinte, che condividono la conseguenza della riduzione della massa β-cellule, cioè, la perdita di capacità di produzione di insulina ^1,2. Attualmente, le strategie di trattamento del diabete si basano su somministrazione cronica di insulina esogena, la stimolazione farmacologica della produzione di insulina o il miglioramento della sensibilità all'insulina, e raramente, il trapianto di isole pancreatiche o tutta ^3,4 pancreas. Purtroppo, il successo di queste strategie è di breve durata e / o non sufficientemente ricapitolare la funzione di produzione di insulina endogena. Nonostante l'utilità di sviluppare un metodo per stimolare la rigenerazione β-cellule, non esiste tale approccio. Di conseguenza, uno dei principali obiettivi di ricerca del diabete è quello di sviluppare metodi per generare nuove cellule beta o per espandere la massa endogena β-cellule ⁵ . Anche se la rigenerazione delle cellule β-da fonti rinnovabili come le cellule staminali embrionali sta avanzando, sicurezza ed efficienza preoccupazioni rendono il perseguimento di strategie alternative, tra cui l'espansione delle beta cellule mature, una priorità ^6,7. È importante sottolineare che la fonte principale di nuove beta-cellule in vivo è preesistenti beta-cellule, piuttosto che le cellule progenitrici specializzate ^8,9. Sebbene cellule beta sembrano avere capacità di replicazione limitata, un piccolo incremento della massa β-cellulare (~ 30%) può essere sufficiente a ripristinare l'omeostasi del glucosio in molti diabetici. Inoltre, in situ stimolazione farmacologica della massa β-cellule è una strategia di trattamento potenzialmente poco costoso e scalabile. Qui un metodo di screening ad alto contenuto per identificare e caratterizzare piccole molecole che stimolano la crescita delle cellule β-è presentato.

Una varietà di metodi sperimentali in vitro può essere utilizzato per identificare prodotti genici e / o molecole that promuovere la replicazione β-cellule primarie. I primi sforzi per misurare l'induzione replica β-cellule utilizzate fetale cultura roditore pancreas o culture isolate delle isole intatte per misurare ^[3 H] timidina, incorporazione di BrdU o gli organismi mitotico all'interno della aldeide-tionina o insulina popolazione macchiato in risposta a condizioni di trattamento specifiche ^{10, 11.} Questi approcci in vitro e varianti dello stesso hanno diverse limitazioni. Carenze prominenti includono (1) l'uso di cellule fetali che, a differenza di beta-cellule mature, mostrano un alto tasso di replicazione β-cellule basali e sono la crescita regolata in modo distinto ^12; (2) la natura personale di aggiudicazione sperimentatore-dipendente di eventi di replica β-cellule; (3) del lavoro e la natura intensiva tempo di conteggio sperimentatore-dipendente di eventi di replica β-cellule ritarda il throughput sperimentale; (4) l'uso di armi nucleari incorporazione / macchie / aspetto di individuare replica anchets e una macchia citoplasmatica non sovrapposizione di identificare cellule beta porta alla falsa attribuzione di eventi di replica non β-cellule prossimità cellule beta.

Più recentemente mature beta cellule primarie sono stati utilizzati per valutare l'impatto del transgene sovra-espressione, così come prodotto del gene o composto trattamento sulla replica β-cellule ^13-16. Tuttavia, questi studi hanno anche invocato il conteggio personale di eventi di replica, metodi staining- citoplasmatica o non specifici per l'identificazione β-cellulare e / o passaggi alta intensità di lavoro che limitano il throughput, ad esempio, slide-ben placcatura individuale di cellule o isolotto intatto paraffina e l'elaborazione ^17. In particolare, un β-cellula umana metodologia di screening replica basata su immagine, simile a quella qui presentata, è stato pubblicato ^18; tuttavia, l'uso di successo di questo test non è stato dimostrato e l'uso di isole umane per lo screening primario può non essere ampiamente FEAbile.

Una strategia alternativa per identificare le sostanze replica di promozione è quello di valutare l'induzione della crescita delle linee di β-cellule. Gli sforzi iniziali usati trasformate cellule beta-linee come MIN6 cellule o INS 832/13-celle ^14,19-21. Tuttavia, queste linee cellulari dimostrano la crescita incontrollata e somigliano poco a ben differenziati cellule beta ^22. Di conseguenza, la capacità di crescita di induzione è minima, di rilevanza poco chiare e talvolta difficile ricapitolare. Una migliore strategia per lo screening basato linea cellulare utilizza "reversibile trasforma" le cellule che sono la crescita arrestato in assenza di tetraciclina (doxiciclina) -dipendente SV40 antigene T espressione ^23,24. Tuttavia, non è chiaro se queste cellule ritornare allo stato β-cell-like "normale" dopo la rimozione doxiciclina. Purtroppo, l'uso di queste cellule ha ceduto composti promotori della crescita generalizzate che non sembrano avere utilità immediata24. In generale, l'uso di linee cellulari per studiare regolazione della crescita di una cellula tipo visualizzazione minima attività di replica spontanea può avere limitata applicabilità.

La piattaforma di screening replica β-cellule qui presentata utilizza maturi primari di ratto beta-cellule per mantenere nella regolazione della crescita in vivo, per quanto possibile, le culture isolotto-cellula di composizione delle cellule di tipo misto per consentire l'identificazione delle attività di promozione della crescita lignaggio-ristretta, Multi -well formattazione per massimizzare il throughput e analisi automatizzata per eliminare pregiudizi e facilitare il throughput. Uso di successo di questa piattaforma ha permesso l'identificazione di diversi composti che promuovono la replicazione β-cellule ^25,26. Inoltre, il test è stato utilizzato per studi di relazione struttura-attività ed esperimenti epistatici chimici per fornire intuizioni meccanicistici nella regolazione molecolare della replicazione β-cellule. La piattaforma presentata è stata adattata con successo FOindagine R lentiviral RNAi-based di replica β-cellule Percorsi di ^25. Limitazioni del test comprendono limitati scalabilità (uso di cellule primarie), uso di roditore piuttosto che isolotto-cellule umane (anche se il dosaggio può essere adattato per gli studi delle isole umane), spese associate con l'imaging a base di anticorpi e l'uso isolotto primaria, l'uso di isolotti dispersi (architettura isolotto interrotto) per facilitare l'acquisizione delle immagini automatizzata e dipendenza dalla disponibilità di un microscopio automatico con acquisizione delle immagini e capacità di analisi. Sebbene un metodo in vivo facile screening per identificare prodotti genici o composti che stimolano la rigenerazione β-cellule in situ sarebbe ideale, tale piattaforma non è ancora disponibile ^27. Di conseguenza, la piattaforma descritto è appropriato per ricercatore interessa indagare molti aspetti della replica β-cellule.

Protocollo

Questo protocollo è stata effettuata in accordo con il Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Stanford University School of Medicine. Il protocollo descritto viene scalata per isolamento delle isole da sei 250 - 300 g (8 - 9 settimane) maschi ratti Sprague Dawley, che è sufficiente a generare 228 pozzetti di una piastra a 384 pozzetti per la valutazione replica isolotto-cellula.

1. Preparazione del materiale

1. Preparare supporti di rivestimento prima di iniziare isolamento delle isole raccogliendo media condizionato di cellule di carcinoma della vescica di ratto 804G mantenuti a confluenza per 3 giorni (20 ml di RPMI1640) in 15 centimetri coltura tissutale piatto ^28. filtro sterile e conservare (-20 ° C) i media condizionata per un uso successivo.
2. Sterilizzare strumenti chirurgici (uno 12 cm pinze dei tessuti dentate, uno 11,5 cm forbici sottili, uno 14,5 cm forbici chirurgiche, due 16 cm pinze curve, uno di 12 cm emostatica ricurva, uno 12 cm maniglia bisturi) e un setaccio del tessuto 30 mesh prima di initiating isolamento delle isole.
3. Preparare la soluzione di digestione pancreatica sciogliendo un 60%: 40% miscela di classe I purificata: classe collagenasi II (attività collagenasi totale di 300.000 - 400.000 unità) in 60 ml di soluzione salina bilanciata 1x Hanks '(HBSS) supplementato con calcio e magnesio. Carico 10 ml di tampone di digestione pancreatica in 10 ml siringhe (sei) con 1 "22 ago G e posto su ghiaccio.
   Nota: 10 ml di soluzione di digestione viene iniettato per ratto. Scala di conseguenza.
4. Preparare 4,5 ml di cocktail di anestetico in una cappa ventilata miscelando 1,3 ml di ketamina (100 mg / ml), 0,2 ml di xilazina (100 mg / ml) e 3 ml di PBS. Preparare il cocktail anestetico entro 1 ora di iniziare isolamento delle isole.
5. Preparare tampone di lavaggio aggiungendo 25 ml di siero di vitello neonato a 500 ml di HBSS. Mettere il tampone di lavaggio in ghiaccio per un uso successivo.
6. Preparare 1 bottiglia di terreno isolotto che si trova a 500 ml di Modified Eagle Medium basso livello di glucosio Dulbecco (DMEM), 50 ml di siero fetale bovino (FBS), 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina.
7. Preparare funzione isolotto mezzo dalla soluzione funzionalità / vitalità (500 ml) con il 2% FBS, 2 mM glutammina, 5 mM di glucosio, 5.000 unità / ml di penicillina e 5.000 mg / ml di streptomicina. Conservare il supporto funzionalità delle isole (4 ° C) per un uso successivo.
8. Preparare 40 ml di tampone di bloccaggio con l'aggiunta di 2,5 ml di siero asino e 0,12 ml di Triton X-100-37,38 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). Conservare tampone bloccante (4 ° C) per un uso successivo.
9. Ottenere gli anticorpi necessari prima di iniziare il protocollo.
   Nota: PDX-1 (TRITC) e Ki-67 (FITC) co-colorazione viene utilizzato per lo screening primario replica β-cellule. Per l'analisi replica specifici lignaggio, eseguire immunofluorescenza per i marcatori supplementari identità delle cellule (insulina, glucagone, vimentina o somatostatina; TRITC) insieme a nucleare (DAPI), PDX (Cy5) e Ki-67 (FITC) colorazione. rep Alternativemarcatori licazione, ad esempio, PCNA, possono anche essere utilizzati.
10. Preparare un piano di trattamento 228-bene con ogni condizione di trattamento effettuato in quadruplicato. Includi comandata (5-Iodotubercidin [1] micron o il dipiridamolo [15 micron]) e il veicolo di controllo (DMSO 1: 666 diluizione) pozzi.

2. Perfusione del pancreas

1. Anestetizzare topi mediante iniezione ip di soluzione di cocktail anestetico diluito (0.30 ml / 100 g di peso corporeo). Una volta che il ratto è completamente anestetizzato e non risponde agli stimoli nocivi, eseguire la dislocazione cervicale.
2. Posizionare il topo eutanasia in posizione (orientamento cranio-caudale) in posizione supina su una pila di carta assorbente e spruzzare la zona addominale con il 70% di etanolo.
3. Aprire la cavità addominale con una U-incisione (base alla regione pubica) e retrarre pelle in direzione rostrale sul torace per esporre la cavità addominale.
4. afferrare con cautela il duodeno utilizzando due coppie di pinze curve, individuare la voce duodenale dei comuni Bcondotto ile (sfintere di Oddi) e serrare l'apertura duodenale presso la papilla con una pinza emostatica curva.
5. Sollevare la pinza emostatica curva utilizzato per bloccare il dotto biliare comune papilla e afferrare il dotto biliare vicino al fegato utilizzando una pinza curve. Utilizzare smussa con le pinze curve per isolare ed esporre il dotto biliare.
6. Riposizionare il topo con la testa prossimale e distale i piedi.
7. Cannulate il dotto biliare comune (CBD) in corrispondenza o appena distale alla giunzione dei condotti epatici cistiche e comuni con una soluzione di digestione pancreatica MOLLA siringa da 10 ml e iniettare lentamente 10 ml di soluzione di digestione del pancreas. Mentre l'iniezione, sostenere il CBD con un manico bisturi. Riposizionare l'ago se il condotto e il pancreas non riescono a gonfiare.
8. Rimuovere il pancreas gonfiati utilizzando le pinze curve e forbici sottili per separarlo dal colon discendente, intestino, stomaco e la milza. Posizionare il pancreas gonfiati su ghiaccio in una provetta da 50 ml contenente 5 ml di soluzione di digestione del pancreas.
   Nota: Per ottenere la massima resa isolotto, raccogliere tutte pancreas in 30 minuti e il luogo solo 1 o 2 pancreas in ciascun tubo 50 ml digestione.

3. La dissociazione del pancreas

1. Una volta che tutti pancreas sono raccolti, posizionare i tubi di digestione in un bagno d'acqua a 37 ° C per 15 min. Mescolare delicatamente i tubi ogni 3 min.
2. Dopo 15 minuti, agitare vigorosamente (verticale) i tubi per 10 volte e aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio a freddo. Agitare vigorosamente i tubi di un ulteriore 5 volte e disporli sul ghiaccio.
3. Riempire i tubi di digestione a 50 ml con tampone di lavaggio a freddo e mescolare invertendo i tubi 5 volte.
4. Centrifugare le provette a 97 xg a 4 ° C per 1 minuto e versare il sopranatante. Fare attenzione a non rimuovere il tessuto pellet.
5. Aggiungere 25 ml di tampone di lavaggio e risospendere il tessuto vortex delicatamente. Ripetere i punti 3.4 e 3.5 altre due volte.
6. Posizionare un setaccio da 30 mesh tessuto su una sterile 250 ml bicchiere e versare la sospensione di tessuto sul setaccio. Sciacquare il tubo di digestione con altri 20 ml di tampone di lavaggio e versare sulla rete. I tessuti pancreatici e grasso non digerito vengono rimossi in questa fase.
7. Versare il materiale filtrato in due freschi provette da 50 ml e pellet tessuto facendo girare a 97 xg per 1 min a 4 ° C. tubi surnatante e invertire decantare per drenare l'eccesso di buffer.

4. Purificazione di isolotti

1. Aggiungere 20 ml di soluzione diatrizoato freddo polysucrose / sodio (1.119 g / ml densità) per il tessuto pancreatico pellet. Omogeneamente risospendere il contenuto di ciascuna provetta delicatamente pipettando su e giù cinque volte.
2. sovrapporre delicatamente la soluzione diatrizoato polysucrose / sodio con 10 ml di HBSS. Mantenere una interfaccia liquido tagliente aggiungendo lentamente l'HBSS lungo la parete del tubo.
3. Centrifugare il pancreas digerito a 560 xg per 15 min (4 ° C) con lenta accelerazione e senza freno.
4. collect lo strato isolotto dall'interfaccia con un 10 ml pipetta e posto isolotti in fresco provette da 50 ml. Non comune le isole in questa fase.
5. Aggiungere 40 ml di tampone di lavaggio a ciascuna provetta 50 ml e centrifugare per 1 min a 140 xg a 4 ° C.
6. Eliminare il surnatante e risospendere isolotti pool in 50 ml di tampone di lavaggio invertendo i tubi diverse volte. Centrifugare le provette per 1 min a 97 xga 4 ° C per raccogliere isolotti in un pellet.
7. Eliminare il tampone di lavaggio e ripetere il lavaggio. Portare isolotti nella cappa coltura tissutale e aspirare il surnatante.
8. Risospendere ogni tubo di isolotti in 6 ml di terreno isolotto.
9. Trasferire le isolette di ogni tubo da 50 ml in un pozzo di sei pozzetti piatto di coltura di tessuti. Agitare il piatto 6 pozzetti per la raccolta isolette in mezzo del pozzo e di osservare la qualità e la purezza isolotto al microscopio.
10. raccogliere manualmente isolotti usando una pipetta ml 1 e trasferire gli isolotti raccolti nella adiacentepozzetto contenente 6 ml di mezzi insulari. Ripetere vorticoso isolotto e raccogliendo fino a> 90% di purezza si ottiene.
11. Trasferire gli isolotti purificati ad un 10 centimetri piatto di coltura tissutale contenente 20 ml di terreno isolotto.
12. Inserire isolotti in un incubatore di coltura tissutale (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante la notte (Figura 1A).
13. In preparazione di placcatura cellule insulari, cappotto i pozzetti di una piastra da 384 pozzetti con 40 ml di 804G mezzi condizionati per pozzetto. Incubare per una notte in un incubatore di coltura tissutale.

5. Dispersione e placcatura di cellule insulari

1. Il giorno seguente, staccare delicatamente isolotti dal 10 centimetri piatto con un raschietto cellulare e trasferire gli isolotti in un tubo da 50 ml.
2. Pellet gli isolotti di centrifugazione per 1 min a 22 xg a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante.
3. Lavare le isolette con 20 ml di PBS calda e decantare come sopra.
4. Risospendere isolotti a 0,25% tripsina (150 ml per il pancreas di ratto) E incubare a 37 ° C per 10 min. Pipetta isolotti su e giù per 10 volte con 1 ml pipetta dopo 5 e 10 minuti di incubazione.
5. Dopo 10 minuti, la valutazione di un campione di 20 ml di isolotti trypsinized sotto il microscopio per garantire la completa digestione e per contare le cellule delle isole con un emocitometro. Se isolotti non digerito rimangono, continuare incubazione per un ulteriore 3 - 5 minuti e pipetta su e giù per 10 volte di più. Ripetere se necessario.
   Nota: Il rendimento tipico è ~ 125.000 - 150.000 isolotto-cellule per topo.
6. Rimuovere 804G condizionata piastra a 384 pozzetti supporti rivestita dal termostato e rimuovere i supporti utilizzando un aspiratore 12-bene collettore.
7. Sospendere cellule insulari ad una densità di 45.000 cellule per ml in mezzo funzione Islet e piastra 70 microlitri (3.150 celle) per pozzetto con una pipetta multicanale (Figura 1B).
   Nota: Poiché cellule beta situati nei pozzetti esterni tendono a migrare verso il perimetro della piastra di uso righe C a N e colonne 4al 21 al piatto 228 pozzi con l'isolotto cellule isolate da 6 ratti.
8. Porre la piastra in cultura incubatore di tessuto per 48 ore per permettere l'adesione cellulare.

6. Cultura Islet-cellula di trattamento, fissaggio e la colorazione

1. Preparare 200 ml di veicolo e composti (condizioni di trattamento vengono eseguite in quadruplicato) ad una concentrazione 2x in medium funzione Islet. Disporre composti in una piastra a 96 pozzetti sterili per facilitare multi-bene pipettaggio.
2. Rimuovere con cautela media isolotto con un aspiratore 12-bene collettore e sostituire con il mezzo funzionalità delle isole (35 ml / pozzetto) usando una pipetta 12-bene. Rimuovere e sostituire il supporto di una riga alla volta per limitare il rischio di essiccazione (Figura 1C).
3. Iniziare il trattamento con il trasferimento di 35 ml / pozzetto delle soluzioni composti 2x. Ritorna piastra al incubatore per la durata del trattamento 48 hr.
4. Dopo 48 ore di trattamento, decantare il supporto trattamento invertendo la piastra.
5. Lavare delicatamente le cellule delle isole con 50 ml per pozzetto di PBS 1x (1 min). Aggiungere il PBS usando una pipetta multicanale.
6. Decantare il PBS e fissare le cellule con l'aggiunta di 50 ml per pozzetto di freddo 4% paraformaldeide (PFA) diluito in PBS 1x. Incubare le cellule per 15 minuti a 4 ° C.
7. Lavare le cellule tre volte (5 min ciascuna) invertendo la piastra per rimuovere il PFA e aggiungendo delicatamente 60 ml di PBS per pozzetto come sopra.
8. Preparare la soluzione di recupero 15 ml antigene mescolando 14,25 ml di formammide e 0,75 ml 0,15 M citrato di sodio (pH 6). Rendere la soluzione di antigene recupero immediatamente prima dell'uso.
9. Rimuovere PBS dai pozzi invertendo la piastra e aggiungere 60 microlitri soluzione di antigene di recupero in ogni pozzetto. Riscaldare la piastra a 70 ° C bagnomaria per 45 min. Posizionare un blocco riscaldante sulla parte superiore della piastra durante l'incubazione per evitare deformazioni della piastra multi-pozzo.
   Nota: L'acqua dovrebbe essere a metà strada su per la gonna piatto; targa non deve essere immersa.
10. rimuovere la piastra dal bagnomaria e lasciare raffreddare per 20 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la piastra non è deformato mediante ispezione visiva.
11. Lavare le cellule con 60 ml per pozzetto di PBS 1x per tre volte (5 minuti ciascuno). Aggiungere PBS con una pipetta multicanale e decantare PBS invertendo la piastra.
12. Utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 40 microlitri per pozzetto di tampone bloccante e incubare per 30 min a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone bloccante invertendo la piastra e decantazione.
13. Aggiungere 40 ml di topo anti-umano Ki-67 (1: 200) e di capra anti-umano PDX-1 (1: 100) anticorpi diluiti in tampone bloccante in ciascun pozzetto e incubare a 4 ° C durante la notte.
14. Il giorno successivo, decantare la soluzione anti-corpo e lavare le cellule con PBS 1x tre volte (5 min ciascuna) come sopra descritto. Decantare il PBS.
15. Aggiungere 40 ml per pozzetto di diluito (1: 200) asino biotinilato anti-topo IgG e asino rodamina-coniugato anti-IgG di capra in tampone di bloccaggio. Incubare per 1 oraa temperatura ambiente.
16. Lavare le cellule con PBS 1x per tre volte, 5 minuti ciascuno. Aggiungere 40 ml di diluito (1: 400 in tampone bloccante) fluoresceina coniugato streptavidina ad ogni pozzetto. Incubare 30 minuti a temperatura ambiente.
17. Lavare le cellule con PBS 1x per tre volte, 5 minuti ciascuno. Aggiungere 40 ml per pozzetto di DAPI (300 Nm nel tampone di bloccaggio) e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
18. Lavare le cellule con PBS 1x due volte e lasciare le cellule in 40 ml PBS 1x. La piastra è ora pronto per essere analizzati.

La replica Analisi 7. β-cellulare

Nota: Un protocollo dosaggio deve essere stabilito per l'alto contenuto di microscopio di screening utilizzato per misurare la replica di β-cellule. Nella sua composizione semplice, questo protocollo è un saggio a due colori in cui un marcatore di identità viene utilizzato per definire cellule beta (PDX-1 ⁺ -cellule) e un indicatore di replica (Ki-67) viene utilizzato per definire gli eventi di divisione cellulare.

1. Identificare oggetti (cellule beta) basate sul averagintensità di fluorescenza e di PDX-1 colorazione (549 filtro nm) all'interno di un cerchio approssimativa (lunghezza: larghezza <1.6) all'interno dell'area di pixel previsto un nucleo β-cellulare (Figura 2A).
2. Successivamente, stabilire le impostazioni per identificare gli eventi di replica (Ki-67-positività) basati sulla intensità media di fluorescenza (485 nm filtro) all'interno del PDX-1 ⁺ (Figura 2B).
   Nota: I tempi di esposizione devono essere fissati per consentire il confronto di intensità dei pixel attraverso le immagini. parametri del protocollo del test vengono regolati in modo tale che le chiamate di macchine costantemente escludono colorazione, detriti e cellule aggregati non specifici che potrebbero influenzare negativamente la qualità dei dati.
3. Analizzare un minimo di 500 beta-cellule per pozzetto per massimizzare la precisione e limitare la variabilità.
   Nota: L'indice replica β-cellule basali nelle culture delle isole di ratto dovrebbe essere 0,5-3%. Tipicamente, 40 immagini al bene è più che sufficiente per identificare 500 cellule beta.
4. Prima di analizzare ilintera piastra, analizzare negativo- selezionato (DMSO-trattato) e positivo di controllo (5-iodotubercidin [1 micron] o il dipiridamolo [15 micron]) -treated pozzi per valutare la validità del protocollo del test. Quando il test è stabilita in maniera corretta, composti di controllo positivi inducono almeno un aumento di due volte della percentuale di replicare cellule beta.
5. Leggi l'intera piastra una volta che il protocollo di analisi viene convalidato.

Risultati

Per valutare β-cellula o la replicazione α-cellule, è necessario un protocollo di dosaggio a quattro colori. Innanzitutto, gli oggetti sono identificati dalla colorazione DAPI (Canale 1, 386 nm). Successivamente, le cellule beta (evento 1) sono contati: oggetti che co-esprimono PDX-1 ⁺ (canale 2, 650 nm) e di insulina peri-nucleare (canale 3, 549 nm). Successivamente, che replicano le cellule beta (evento 2) sono contati: le cellule beta (evento 1) che co-express Ki-67 (canale...

Discussione

metodi sperimentali per studiare i meccanismi molecolari che controllano la crescita delle cellule β-e rigenerazione sono strumenti importanti per i ricercatori del diabete. Qui, una piattaforma di screening basata rat-isolotto di identificare e caratterizzare stimolatori piccole molecole di replicazione β-cellule è presentato.

Mentre la maggior parte degli aspetti di questo protocollo sono facilmente eseguiti da ricercatori esperti, a pochi passi richiedono particolare tecnica. In primo luo...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
250 g maschio Sprague maschio Dawly Rat	Charles River	Stain # 400
12 cm denti tisuue pinze	Fine Science Tools	11021-12
11,5 cm forbici fini	Fine Science Tools	14058-11
14,5 cm forbici chirurgiche	Fine Science Tools	14001-14
16 cm pinza curva	Fine Science Tools	11003-16
Epostato curvo da 12 cm	Fine Science Tools	13011-12
Manico per bisturi da 12 cm	Fine Science Tools	10003-12
Setaccio per tessuti-30 maglie	Bellco Glass	1985-85000
Cizyme RI, 375.000 unità CDA	VitaCyte	005-1030
salina bilanciata di Hanks (Ca++ e Mg++)	Gibco	24020-117
Ketamina HCl (200 mg/20 ml)	JHP Pharmaceuticals	NDC# 42023-113-10	per preparare cocktail anestetici
Xilazina (5 g/50 ml)	LLOYD	NADA# 139-236	per fare cocktail anestetici
Histopaque 1077	Sigma	H-1077	per fare histopaque 1100
Histopaque 1119	Sigma	H-1119	per fare histopaque 1100
Siero per vitello neonato 500 ml	Hyclone	SH30118.03
Soluzione salina bilanciata di Hanks	Hyclone	SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Glucosio medio/basso	Hyclone	SH30021.01
Soluzione di funzionalità/fattibilità	Mediatech	99-768-CV
RPMI1640 supporti	Hyclone	SH30096.01	per realizzare
una linea cellulare di carcinoma della vescica di ratto con mezzo condizionato 804G	Disponibile su richiesta		per la produzione
siero fetale bovino	Gibco	26160
GlutaMax-I	Gibco	35050-061
Penicillina (5.000 UI/ml/Strptomicina (5 mg/ml)	MP Biomedicals	1670049
Formamide 500 ml	Fisher BioReagents	BP227-500
Soluzione di smascheramento dell'antigene 250 ml (pH 6,0)	Vector Laboratories	H-3300	per produrre una soluzione di sitrato di sodio 0,15 M
Destrosio, EMD anidro	Prodotti chimici	DX0145-1	per produrre una soluzione di glucosio 1 M
Siero d'asino Nomal (polvere)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Triton X-100	Sigma	T8787-100ML
Topo anticorpo Ki67	BD Biosciences	556003
capra anticorpo PDX-1	R& D Systems	AF2419
Anticorpo policlonale anti-insulina di cavia	Dako	2016-08
Anticorpo policlonale anti-glucagone di coniglio	Dako	2014-06
Anticorpo policlonale anti-somatostatina di coniglio	Dako	2011-08
Anticorpo policlonale anti-vimentina di pollo	abcam abcam	ab24525
Biotina-SP-coniugato, Asino Anti-Topo IgG	Jackson ImmunoResearch	715-065-150
StreptAvidin, Alex Farina 488 coniugato	Invitrogen	S32354
IgG anti-capra d'asino coniugato con rodamina	Jackson ImmunoResearch	705-025-147
IgG anti-porcellino d'India coniugato con rodamina	Jackson ImmunoResearch	706-025-148
IgG anti-coniglio d'asino coniugato con rodamina	Jackson ImmunoResearch	711-025-152
IgG anti-porcellino d'asino coniugato Cy 5	Jackson ImmunoResearch	706-175-148
Cy 5-coniugato Donkey Anti-Goat IgG	Jackson ImmunoResearch	705-175-147
Cy 5-coniugato Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	711-175-152
Cy 5-coniugato Donkey Anti-Chicken IgG	Jackson ImmunoResearch	703-175-155
DAPI	Millipore	S7113
Serbatoio per reagenti monouso 25 ml	Sorenson BioScience	39900
Piastra trattata per coltura tissutale a 384 pozzetti, nero/trasparente,	BD Falcon	353962
Piastra trattata per coltura tissutale a 96 pozzetti, nero/trasparente,	Costar	3603
Pipettatore multicanale	Costar	4880
Aspiratore sottovuoto a 12 canali	Drummond	3-000-096
Raschietto cellulare	Falcon	353085
Isotemp Bagno d'acqua Modello 2223	Fisher Scientific
Strumento di screening ad alto contenuto: ArrayScan VTI	Thermo Scientific