Articolo metodologico

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

DOI:

10.3791/54303

⸱

7 ottobre 2016

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1Department of Molecular and Cellular Physiology, Albany Medical College, 2Department of Neuroscience and Experimental Therapeutics, Albany Medical College

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un protocollo per visualizzare volumetricamente cellule marcate con proteine fluorescenti in profondità all'interno di cuori embrionali e postnatali intatti. Utilizzando metodi di pulizia dei tessuti in combinazione con la colorazione dell'intera montatura, è possibile visualizzare in modo chiaro e accurato singole cellule marcate con proteine fluorescenti all'interno di un cuore embrionale o postnatale.

Abstract

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Singolo tracing clonale e analisi a livello intero cuore può determinare il comportamento delle cellule progenitrici cardiache e differenziazione durante lo sviluppo cardiaco, e consentire lo studio delle basi cellulari e molecolari della morfogenesi cardiaca normale e anormale. Recenti tecnologie emergenti di retrospettive singole analisi clonali rendono lo studio della morfogenesi cardiaca a risoluzione singola cella fattibile. Tuttavia, l'opacità dei tessuti e la dispersione della luce del cuore come la profondità delle immagini è aumentata Hinder di imaging intero-cuore con una risoluzione di singola cellula. Per superare questi ostacoli, un sistema di compensazione intero embrione che può rendere il cuore altamente trasparente sia per l'illuminazione e la rilevazione devono essere sviluppati. Fortunatamente, negli ultimi anni, sono stati segnalati molti metodologie per sistemi di compensazione intero organismo, come la chiarezza, la Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, cubi, DBE, BABB e PACT. Questo laboratorio è interessato ai meccanismi cellulari e molecolari della cartaIAC morfogenesi. Recentemente, abbiamo stabilito singola linea cellulare tracciare tramite il ROSA26-Cre ERT2; sistema ROSA26-Confetti alle cellule di etichette scarsamente durante lo sviluppo cardiaco. Abbiamo adattato diverse metodologie embrio-clearing interi compresi Sca le e cubi (chiare, senza ostacoli cocktail di imaging cerebrale e analisi computazionale) per cancellare l'embrione in combinazione con tutto il monte colorazione di immagine singoli cloni all'interno del cuore. Il cuore è stato ripreso con successo ad una risoluzione di singola cellula. Abbiamo trovato che le Sca può cancellare il cuore embrionale, ma non può efficacemente eliminare cuore postnatale, mentre CUBIC può cancellare cuore postnatale, ma danneggia il cuore embrionale sciogliendo il tessuto. I metodi qui descritti permetteranno lo studio della funzione genica in una sola risoluzione clone durante morfogenesi cardiaca, che, a sua volta, può rivelare basi cellulari e molecolari dei difetti cardiaci congeniti.

Introduzione

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Morfogenesi cardiaca è un evento sequenziale che richiede l'organizzazione spaziotemporale di quattro diversi tipi di cellule progenitrici cardiache in settori distinti del cuore, e richiede anche più reti di regolazione genetica di orchestrare questo processo per formare il 1,2 cardiaca funzionale. Cardiac specificazione, differenziazione, patterning, e la maturazione della camera sono regolati da fattori di trascrizione cardiogeno 3. Mutazione genetica o aberrazione posttranscriptional di questi fattori nelle cellule progenitrici cardiache possono provocare sia letalità embrionale o difetti cardiaci congeniti (CHD) 4. Lo studio della morfogenesi cardiaca richiede una comprensione dei dettagli inerenti strutturali in tre dimensioni (3D) e singola etichetta lignaggio cellule progenitrici cardiache tracciamento durante lo sviluppo cardiaco promuoverà la comprensione della morfogenesi cardiaca. Un certo numero di sezione metodi basati tomografia ad alta risoluzione sono stati sviluppati in the negli ultimi decenni a immagine Struttura organo 5,6; tuttavia, questi metodi richiedono costosi, strumenti specializzati, il lavoro esteso, e la mancanza di organizzazione strutturale dettagliata alla risoluzione di singola cellula nel volumetrico finale ricostruita immagine 7,8.

L'imaging volumetrico 3D a livello di singola cellula fornisce un mezzo per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici e comportamento cellulare in vivo 7. Tuttavia, la luce tessuto dispersione rimane l'ostacolo principale per l'imaging cellule e strutture in 3D in profondità all'interno del cuore intatto. I lipidi sono una fonte importante di diffusione della luce, e la rimozione dei lipidi e / o regolazione della differenza di indice di rifrazione tra i lipidi e le aree circostanti sono potenziali approcci per aumentare la trasparenza del tessuto 8. Negli ultimi anni, un certo numero di metodi di compensazione del tessuto sono stati sviluppati, che riducono l'opacità dei tessuti e diffusione della luce, come BABB (alcool benzilico e benzile benzoate miscela) e DBE (tetraidrofurano e dibenzylether); ma in questi metodi, fluorescenza quenching rimane un problema 8-10. Il solvente basa metodi idrofili, come SeeDB (fruttosio / thioglycerol) e 3DISCO (diclorometano / dibenzylether), conserva segnali fluorescenti, ma non rende l'intero organo trasparente 7,8,11. In confronto, il metodo tessuto-clearing CLARITY rende l'organo trasparente, ma richiede un dispositivo per elettroforesi specializzata per rimuovere i lipidi 8,12, come fa PACT (tecnica passiva chiarezza), che richiede anche idrogel incorporamento 7,13. Per informazioni dettagliate su tutti i metodi di tessuto-compensazione disponibili, fare riferimento alla Tabella 1 a Richardson e Lichtman, et al. 7.

Nel 2011, Hama et al. Casualmente scoperto una miscela idrofila 'Sca Le' (urea, glicerolo e Triton X-100 miscela) che rende il cervello di topo ed embrione traspaent mentre completamente preservando segnali fluorescenti da cloni etichettati 14. Questo permette l'imaging del cervello intatto ad una profondità di diversi millimetri e ricostruzione su larga scala di popolazioni neuronali e proiezioni a una risoluzione subcellulare. Susaki et al. ulteriormente migliorata Sca Le aggiungendo amminoalcoli e sviluppato il 'cubica (chiare, senza ostacoli cocktail di brain imaging e analisi computazionale) Metodo tessuto compensazione, che ha aumentato la solubilizzazione fosfolipide, riduzione dei tempi di compensazione, e ha permesso per l'imaging a fluorescenza multicolore 8. Nel presente studio, approfittando della Sca Le e Cubic tecniche del tessuto di compensazione e alta risoluzione sezionamento ottico 3D, i singoli cloni all'interno del cuore durante cardiogenesis sono stati rintracciati utilizzando Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, cTnT-Cre 18, NFATc1-Cre 19, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di mouse. La combinazione del metodo tutto il monte colorazione (WMS) sviluppato in precedenza 21,22 con metodi di compensazione tessuto ulteriormente consentiti per la colorazione di altre proteine in cloni etichettati e per lo studio del loro comportamento in un contesto volumetrica 3D. La combinazione di compensazione tessuti e WMS permette una migliore comprensione dei ruoli dei diversi geni e proteine ​​durante lo sviluppo cardiaco, e l'eziologia di difetti cardiaci congeniti. Questo protocollo può essere applicato per studiare altre differenziazione di cellule progenitrici, comportamento cellulare, ed eventi morfogenesi organo durante lo sviluppo.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali (IACUC) a Albany Medical College ed eseguite secondo la guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Preparazione della soluzione

NOTA: Il Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, αMHC-Cre 17, e Rosa26-mTmG (mTmG) 20 linee di topo sono state acquistate sul mercato cTnT-Cre 18 è stato un dono dal Dott Jiao presso l'Università di Alabama NFATc1-Cre.. era un dono di Dr. Bin Zhou all'Albert Einstein college of Medicine 19. I topi sono stati sacrificati per inalazione di anidride carbonica in un locale chiuso per almeno 60 secondi seguiti da mezzi fisici di verifica morte per toracotomia bilaterale, decapitazione o dislocazione cervicale.

  1. Preparare Tamoxifen. Sciogliere 10 mg di tamoxifene in 10 ml di oi semi di girasolel. Una volta che si è completamente sciolto, aliquotare e conservare a -20 ° C.
  2. Preparare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Sciogliere Na 2 HPO 4 (1,41,96 mila g), KH 2 PO 4 (0,24,496 mila g), NaCl (8,0669 g) e KCl (0,20,129 mila g) in 1 L di acqua distillata e regolare il pH a 7,4.
  3. Preparare PBST: 0.1% Tween-20 soluzione in PBS sciogliendo 100 ml di Tween-20 in 100 ml di PBS.
  4. Preparare tampone di bloccaggio. Rendere 3% di siero albumina bovina (BSA) soluzione bloccante sciogliendo 3 g di BSA in 100 ml di PBST contenente 0,2% Tween-20.
  5. Preparare CUBIC-1 (reattivo 1). Mescolare 25% in peso di urea, 25% in peso di N, N, N ', N'-tetrakis etilendiammina (2-idrossipropil) e il 15% in peso di Triton X-100 in dH 2 O.
  6. Preparare CUBIC-2 (reattivo 2). Mescolare 50 wt% di saccarosio, 25% in peso di urea, 10% in peso di 2, 2 ', 2' '- nitrilotrietanolo e lo 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH 2 O.
  7. Preparare Sca le A2: 4 M urea, 10% w / v di glicerolo e 0,1% w / v Triton X-100 in DH 2 O. Regolare il pH a 7,7.
  8. Preparare Sca le B4: 8 M urea e 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O. Regolare il pH a 8,7.
  9. Preparare Sca le 70: 4 M urea, 70% w / v di glicerolo e 0,1% w / v Triton X-100 in dH 2 O.

2. Tamoxifen Induzione, isolamento degli embrioni e la fissazione

  1. Tamoxifene Induzione e isolamento Embryo
    1. Utilizzando un protocollo sondino ricurvo approvato (ACUP 13-12.007), sonda gastrica i topi di sesso femminile R26Cre ERT2 Confetti (collegato da R26Cre ERT2 topi maschi) con 10 mg / g di Tamoxifen al giorno embrionale di sviluppo E7.75 33. Al giorno embrionale 9,5 (E9.5) o E10.5, eutanasia i topi femmina con CO 2 e dislocazione cervicale.
    2. Dopo la verifica della morte del mouse (vedi Sezione 1 Nota), aprire il mouse cavità addominale con le forbici e sezionare il corno uterino, rimuovere gli strati di tubo uterino con l'aiuto di forbici e pinzette, e reaffittare gli embrioni dal 23,24 tuba uterina.
      1. Trasferire gli embrioni di una capsula di Petri contenente PBS (pH 7,4). Sotto il microscopio da dissezione, rimuovere gli strati non-embrionali (chorion, sacco vitellino e amnion) con l'aiuto di una pinzetta.
    3. Utilizzando le pinzette e forbici, raccogliere i campioni femminili del mouse e della coda degli embrioni per la genotipizzazione come riportato in precedenza 22. Usando una pipetta di plastica, trasferire ogni embrione in un pozzetto di una piastra ben 48 contenente 1 ml di PBS 1x.
    4. Sotto un microscopio a fluorescenza, identificare le GFP / RFP / CFP embrioni positivi tramite un microscopio invertito con una macchina fotografica. Sbucciare via il pericardio con una pinzetta e ruotare il cuore / embrione con l'aiuto di pinzette ricurve per determinare il numero di cloni fluorescenti su entrambi i lati del cuore con i filtri GFP / RFP / CFP. Non sono necessari tagli.
  2. Dopo aver identificato GFP / RFP / CFP embrioni positivi, lavare rapidamente gli embrioni per due volte (2 min ciascuna) con PBS 1x in the 48 ben piastra su un agitatore a temperatura ambiente (RT). Questo rimuoverà il sangue in eccesso.
  3. Fissare l'embrione / cuore embrionale utilizzando 4% paraformaldeide (PFA) a temperatura ambiente. Il tempo di fissazione dipende dall'età e del tessuto dimensioni embrionale. Per E9.5 fissare l'embrione per 2 ore a temperatura ambiente. Gli embrioni fase embrionale fine richiedono un tempo più lungo di fissazione, che può anche essere prolungata fino a 24 ore per il cuore postnatale.
    ATTENZIONE: Paraformaldeide è tossico, evitare il contatto con la pelle, gli occhi e le mucose.
  4. Dopo la fissazione, lavare l'embrione / cuore nel 48 ben piatto due volte (10 minuti ciascuno) con 1x PBS su un agitatore a temperatura ambiente. Questo rimuove l'eccesso di PFA dall'embrione / cuore. Gli embrioni vengono poi ulteriormente trattati per tutto il monte di colorazione e di compensazione dei tessuti.

3. monte intero colorazione

NOTA: Dopo PFA fissaggio l'embrione / cuore è sottoposto a tutto il monte colorazione come segue.

  1. Permeabilize l'embrione / cuore in un 48 ben piastra con 1 ml di 0,1% PBST per 2 ore su piastra agitatore a RT.
  2. A seguito di permeabilizzazione, immergere l'embrione / cuore in 1 ml di tampone di bloccaggio, per 2 ore o durante la notte su un agitatore a 4 ° C.
  3. Immergere l'embrione / cuore al endoteliali cellule-specifiche anticorpi PECAM (CD31), diluito (1: 100) in 0,3 ml di tampone di bloccaggio per 48 ore su piastra agitatore a 4 ° C.
  4. Lavare l'embrione / cuore con PBST 5 volte, 30 min ciascuno a temperatura ambiente sulla piastra shaker. Ciò elimina la non-specifico anticorpo primario legato in eccesso dal tessuto.
  5. Immergere l'embrione / cuore in Alexa Fluor 647 capra anticorpo secondario anti-topo, diluito (1: 1.000) in 1 ml di tampone di bloccaggio per 48 ore su piastra agitatore a 4 ° C.
  6. Ripetere il passaggio 3.4 per lavare l'anticorpo secondario.
  7. Post-fix l'embrione / cuore con 4% PFA per 1 ora a temperatura ambiente sulla piastra shaker e lavare due volte con PBS 5 minuti ciascuno.
  8. Colorare l'embrione / cuore con la macchia nucleare di 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (diluito in PBST a concentrazione di 0,01 mg / ml) per 10 min a tavola oscillante a RT. Seguire con due lavaggi PBS su 5 minuti ciascuno.

4. Embrione / Clearing cuore con Sca l e o metodo CUBIC

NOTA: dopo tutto il monte colorazione, l'embrione / cuore è sottoposto sia alla Sca le o il metodo del tessuto compensazione cubi. La scelta del metodo dipende dalle dimensioni del tessuto ed età embrionale. Per E11.5 o embrioni età precedenti, l'uso Sca l e metodo tessuto compensazione, mentre per gli embrioni di età superiore o cuori postnatali il metodo tessuto compensazione CUBIC è preferito.

  1. Scala del tessuto Metodo Clearing
    1. Incubare l'embrione / cuore con 1 ml di Sca l soluzione e A2 in un flaconcino scintillazione (avvolti in carta stagnola) con occasionali agitando delicatamente (a mano) per 48 ore a 4 ° C.
    2. Dopo l'incubazione Sca l e A2, incubare l'embrione / cuore con 1 ml di Sca l soluzione e B4 a 4 ° C nella stessa fiala con occasionali agitando delicatamente per anotil suo 48 hr.
    3. Incubare l'embrione / cuore per un altro 48 ore con 1 ml Sca l e 70 a 4 ° C con occasionale agitazione delicata. Monte embrione utilizzando il 90% di glicerolo (vedere paragrafo 5.1).
  2. CUBIC tessuto Metodo Clearing
    1. Per tutta la dell'embrione / cuore compensazione cubo, immergere ogni embrione / cuore in 1 ml di Cubic-1 con occasionali delicata agitazione per 48 ore a 37 ° C 7. Dopo 48 ore, sostituire la soluzione con lo stesso volume di reagente CUBIC fresco 1, e incubare il campione per ulteriori 48 ore a 37 ° C, con occasionale agitazione con mano.
    2. Lavare il CUBIC-1 trattati cuore / embrione con PBS 1X diverse volte a temperatura ambiente agitando delicatamente con la mano. Questo rimuove l'eccesso di soluzione CUBIC-1.
    3. Dopo aver lavato i cubico-1 con PBS, immergere gli embrioni / cuori in CUBIC-2 soluzione (1 g per dell'embrione / cuore) per 48 ore a 37 ° C con occasionali agitando delicatamente con la mano. Questo segue dell'embrione / montaggio con glicerolo cuore (vedi sezione 5.2).

5. Montaggio del campione e Imaging

NOTA: Gli embrioni o organi eliminato in Sca l e 70 o cubica-2 soluzione possono essere esposte direttamente con scala 70 e Cubic-2 soluzione come il mezzo di imaging, rispettivamente. Tuttavia, considerando la vulnerabilità dei campioni embrionali ai reagenti di compensazione, se i campioni non sono essere ripreso immediatamente, ma conservati a lungo termine, conservare i campioni a 90% glicerolo seguendo il protocollo di seguito.

  1. Direttamente immergere la Sca Le cancellata campione in 1 ml di 90% glicerolo e conservare a 4 ° C fino imaging.
  2. Lavare il campione trattato cubica con PBS 1x due volte, 5 min ciascuna e sequenzialmente incubare il campione con 1 ml di 30%, 50%, 70% e soluzione di glicerolo 90% ciascuno per 30 min.
  3. Per l'imaging, trasferire il campione a fondo piatto di vetro Petri con una quantità minima di 90% glicerolo e illustrati cloni con un microscopio confocale equipaggiato con due funzionalità fotoni.
  4. Immagine cuore o embrione in glicerolo con un / 0.3 NA 10X, 25X un / 0.8 NA immersione, o di una lente obiettivo correttiva 40X / 1.2 NA acqua. Immagine DAPI utilizzando 2-fotoni da un titanio coerente: zaffiro laser camaleonte. La scelta del microscopio e lente obiettivo dipenderà dallo scopo degli esperimenti, ad esempio per super-risoluzione, un microscopio a fluorescenza foglio leggero potrebbe essere utilizzato.

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Risultati

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Imaging del cuore embrionale eliminato

Formazione del cuore dei vertebrati è un processo morphogenic spatiotemporally regolata e dipende dall'organizzazione e la differenziazione delle cellule progenitrici da quattro diverse fonti 1. Le cellule del primo campo cuore della mezzaluna cardiaca si piega verso la linea mediana ventrale per formare un tubo lineari cuore. Le cellule dal secondo campo cuore, inizialmente re...

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Discussione

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L'isolamento embrione è un passo molto importante. embrioni E9.5 sono molto fragili e di piccole dimensioni, in modo da la cura dovrebbe essere presa per non danneggiare le strutture dell'embrione / cardiaci durante l'isolamento. Gli strati aggiuntivi non embrionali che avvolgono l'embrione / cuore devono essere rimossi con attenzione soprattutto quando l'imaging tutta dell'embrione. Questo permette la penetrazione di anticorpi e di compensazione miscela in profondità all'interno dei tessuti ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Ringraziamo i membri del laboratorio M.W. per la discussione scientifica. Questo lavoro è supportato dall'AHA [13SDG16920099] a M.W. e dalle sovvenzioni del National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] a M.W. Le immagini sono state catturate nell'Imaging Core Facility dell'Albany Medical College.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2,2&primo;,2&primo; '-nitrilotritetanolo Sigma Aldrich90279
4% Paraformaldeide in PBSAffymetrix19943
BSAFischer Scientific 
N,N,N',N'-tetrakis(2-idrossipropil) etilendiammina Sigma Aldrich 122262
Tampone fosfato soluzione salinaSigma AldrichP5368-10PAK
Triton  X-100Sigma AldrichT8787
UreaSigma AldrichU-1250
SaccarosioSigma Aldrich84097
GliceroloSigma AldrichG8773
TamoxifeneSigma AldrichT5648
Olio di semi di girasoleSigma AldrichS5007
Tween 20Sigma AldrichP1379
PECAM (CD31)BD Pharmingen 
Alexa Fluor 647 InvitrogenA-21247
DAPI colorazione nucleareSigma AldrichD9542
37oC IncubatoreThermoscientific FischerHeratherm, incubatori microbiologici compatti piastre a
48 pozzettiCell Treat229148
bilancia analiticaMetler ToledoPB153-S/FACT
Confocal microscopioZeissZeiss 510 microscopio confocale
Microscopio sezionatoreUnitronZ850
Microscopio fluorescenteZeissObserver. Z1
Germinator 500 Sterilizzatore di perline di vetroCellPoint ScientificGER-5287-120V
Sorgente luminosaSCHOTTACE I
Coppia di forbiciFine Science Tools14084-08
Piastra di Petri 60 mm x15 mm TPP Techno Plastic Products AG93060
Rocker II  Piattaforma a bilanciereBoekel Scientific260350
Tubi scintillantiFischer Scientific 03-337-26
Pipetta di trasferimentoSamco Scientific202
PinzetteFine Science Tools11251-20
BP16000550274

Riferimenti

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