Articolo metodologico

misurazione In Vitro Attività ATPasi per enzimatica Caratterizzazione

DOI:

10.3791/54305

⸱

23 agosto 2016

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un protocollo di base per quantificare l'attività dell'ATPasi in vitro. Questo protocollo può essere ottimizzato in base al livello di attività e ai requisiti di una data ATPasi purificata.

Abstract

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Adenosina trifosfato enzimi-idrolisi, o ATPasi, svolgono un ruolo critico in una gamma diversificata di funzioni cellulari. Queste proteine ​​dinamici in grado di generare energia per il lavoro meccanico, come il traffico di proteine ​​e il degrado, trasporto dei soluti, e movimenti cellulari. Il protocollo qui descritto è un metodo semplice per misurare l'attività in vitro di ATPasi purificata per la caratterizzazione funzionale. Proteine ​​idrolizzano ATP in una reazione che provoca il rilascio inorganica fosfato e la quantità di fosfato liberato viene poi quantizzati utilizzando un saggio colorimetrico. Questo protocollo altamente adattabile può essere regolata per misurare l'attività ATPasi in saggi cinetici o endpoint. Un protocollo rappresentativo è qui fornito in base all'attività e requisiti di EPSE, AAA + ATPasi coinvolta nella secrezione di tipo II nel batterio Vibrio cholerae. La quantità di proteina purificata necessaria per misurare l'attività, la lunghezza del test e la sincronizzazione e il numero di saintervalli mpling, buffer e la composizione del sale, temperatura, co-fattori, stimolanti (se presente), ecc possono variare da quelli qui descritti, e quindi un po 'di ottimizzazione può essere necessario. Questo protocollo fornisce un quadro di base per ATPasi caratterizzano e può essere eseguita rapidamente e facilmente regolato come necessario.

Introduzione

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Le ATPasi sono enzimi integrali in molti processi in tutti i regni della vita. Le ATPasi agiscono come motori molecolari che utilizzano l'energia dell'idrolisi dell'ATP per alimentare reazioni diverse come il traffico, il dispiegamento e l'assemblaggio delle proteine; replicazione e trascrizione; metabolismo cellulare; movimento muscolare; motilità cellulare; e pompaggio ionico1-3. Alcune ATPasi sono proteine transmembrana coinvolte nel trasporto di soluti attraverso le membrane, altre sono citoplasmatiche e possono essere associate a una membrana biologica come la membrana plasmatica o quelle degli organelli.

AAA+ Le ATPasi (ATPasi associate a varie attività cellulari) costituiscono un grande gruppo di ATPasi che condividono una certa sequenza e conservazione strutturale. Queste proteine contengono motivi di legame nucleotidico conservati come le scatole Walker-A e -B e formano oligomeri (generalmente esameri) nel loro stato attivo1. Grandi cambiamenti conformazionali in queste proteine al legame nucleotidico sono stati caratterizzati tra diversi membri della famiglia AAA+. L'EpsE è una ATPasi AAA+ e fa parte della sottofamiglia delle NTPasi4-6 di secrezione batterica di tipo II/IV. L'EpsE potenzia la secrezione di tipo II (T2S) nel Vibrio cholerae, l'agente eziologico del colera. Il sistema T2S è responsabile della secrezione di un'ampia varietà di proteine, come la tossina del colera che causa diarrea acquosa quando V. cholerae colonizza l'intestino tenueumano 7.

Le tecniche per quantificare l'attività dell'ATPasi in vitro sono varie, ma comunemente misurano il rilascio di fosfato utilizzando substrati colorimetrici, fluorescenti o radioattivi8-11. Descriviamo un metodo di base per determinare l'attività dell'ATPasi in vitro di proteine purificate utilizzando un saggio colorimetrico basato su un substrato contenente verde di malachite disponibile in commercio che misura il fosfato inorganico (Pi) liberato. A pH basso, il molibdato verde di malachite forma un complesso con Pi greco e il livello di formazione del complesso può essere misurato a 650 nm. Questo test semplice e sensibile può essere utilizzato per caratterizzare funzionalmente nuove ATPasi e per valutare il ruolo di potenziali attivatori o inibitori, per determinare l'importanza di domini e/o residui specifici, o per valutare l'effetto di particolari trattamenti sull'attività enzimatica.

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Protocollo

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1. Eseguire ATP idrolisi di reazione con proteina purificata

  1. Preparare scorte di tutti i reagenti necessari per l'incubazione con proteina purificata.
    1. Preparare tampone 5x HEPES / NaCl / glicerolo (HNG) contenente 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl, e il 5% glicerolo (o altro tampone a seconda dei casi).
    2. Preparare 100 mM MgCl 2 (o altro metallo, se ATPasi è in metallo-dipendente) in acqua.
    3. Preparare fresco 100 mM ATP a 200 mm Tris Base (non regolare il pH ulteriormente) con alta ATP purezza. Aliquota e memorizzare il titolo ATP a -20 ° C per non più di un paio di settimane, come l'ATP si rompe nel corso del tempo, e astenersi dal congelamento e scongelamento del titolo ATP.
    4. Premix MgCl 2 e ATP in un rapporto 1: 1 appena prima di impostare la reazione di idrolisi dell'ATP.
  2. Preparare ed etichettare provette da 1,5 ml per la raccolta di campioni a intervalli regolari durante la reazione. Preparare le provette per raccogliere campioni al tempo 0 e al tempo 15, 30,45, e 60 min.
    NOTA: In alternativa, raccogliere campioni solo in fase 0 e il punto finale.
    1. Aggiungere 245 microlitri di buffer 1x HNG ad ogni provetta in modo da diluire campioni raccolti dalle reazioni di idrolisi dell'ATP 1:50.
  3. Preparare un bagno di ghiaccio secco ed etanolo per il congelamento rapido campioni per arrestare la reazione. In un secchio di ghiaccio gomma o contenitore altra cassetta di sicurezza (non di plastica), aggiungere alcuni pezzi di ghiaccio secco e versare attentamente abbastanza 70-100% di etanolo per coprire il ghiaccio secco.
  4. Diluire proteina purificata in un tampone HNG 1x, a seconda dei casi (tipicamente 5-10 micron), e tenere in ghiaccio.
  5. Impostare le reazioni di idrolisi dell'ATP.
    1. In separati 0,5 ml provette per ogni campione, aggiungere le seguenti reagenti (in ordine): H 2 O (fino ad un volume finale di 30 microlitri), 6 microlitri 5x HNG o altro buffer, 3 microlitri 100 mM MgCl 2 -ATP miscela, e 0,25-5 proteine ​​micron.
    2. Includere un buffer di sola condizione di controllo negativo in cui è stata aggiunta alcuna proteina.
  6. Rimuovere 5 ml dalla reazione al tempo 0, diluire 1:50 nella provetta da 1,5 ml preparato contenente 245 microlitri di buffer HNG, e congelare immediatamente il campione in condizioni di asciutto bagno di ghiaccio / etanolo.
  7. Incubare le reazioni a 37 ° C per consentire idrolisi dell'ATP a verificarsi per 1 ora. Ad ogni intervallo (15, 30, 45 e 60 min), rimuovere 5 aliquote microlitri dalla reazione e aggiungere al provettoni etichettati contenenti tampone HNG come al punto 1.6.
  8. Al termine della reazione di idrolisi dell'ATP, spostare campioni diluiti in un congelatore C -80 ° per la conservazione. Per garantire tutti i campioni sono completamente congelati, attendere almeno 10 minuti prima di procedere.

2. I campioni Incubare contenenti libero Pi con Detection Reagent

  1. Scongelare i campioni diluiti contenenti aliquote reazione di idrolisi dell'ATP in ogni momento (ottenuti da misure 1.6 e 1.7) a temperatura ambiente.
  2. Impostare una piastra a 96 pozzetti contenenti i campioni e gli standard di fosfati.
    1. In un ml tu 0,5essere, diluire lo standard di fosfato (fornito con il reagente di rilevamento Pi) da 800 micron a 40 micron con l'aggiunta di 5,5 ml di buffer HNG 800 micron standard per 104,5 ml. Mescolare bene e aggiungere 100 ml di questa 40 micron di serie Pi a ben A1 di una piastra a 96 pozzetti.
    2. Aggiungere tampone HNG 50 microlitri di pozzi B1-H1 per 1: 1 diluizioni seriali dello standard Pi.
    3. Rimuovere 50 ml di 40 mM Pi dal pozzetto A1 e aggiungere al tampone 50 microlitri nel pozzetto B1, mescolare, e rimuovere 50 ml da ben B1 e aggiungere al ben C1, diluizioni continui attraverso ben G1. Scartare 50 ml da ben G1 dopo la miscelazione per assicurare ogni pozzetto ha lo stesso volume. Ebbene H1 dovrebbe contenere solo buffer per creare uno standard Pi 40 a 0 pM.
      NOTA: Se un fattore aggiuntivo (come un inibitore) è stato aggiunto ai campioni, creare una curva standard contenente quel fattore di controllo per i cambiamenti nel rilascio fosfato o assorbanza in queste condizioni.
    4. Aggiungere 50 ml di ogni SAMPLe in duplice copia alla piastra. Aggiungere campioni dallo stesso punto temporale in colonne verticali (campione 1 ora 0 = A2, A3; campione 2 tempo 0 = B2, B3) e differenti tempi orizzontalmente. Questo permette fino a 8 campioni e 5 punti temporali per piastra.
  3. Utilizzare una pipetta sterile per rimuovere abbastanza verde malachite molibdato reagente di rilevamento / Pi aggiungere 100 ml a ciascuno dei pozzetti contenenti campioni e gli standard (reagente necessario (ml) = 0,1 x numero di campioni e gli standard) e aggiungere ad un piatto per una facile pipettaggio usando una pipetta multicanale. Non versare il reagente di rilevamento direttamente nel piatto, come la contaminazione Pi è probabile che si verifichi.
  4. Usando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di reagente di rilevamento Pi in ogni pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù un consistente numero di volte senza bolle introduzione, preferibilmente nell'ordine da ultimi punti temporali ai primi punti temporali.
  5. Incubare la piastra per 25 min a temperatura ambiente, o secondo la maindicazioni nufacturer.

3. Risultati quantificare utilizzando un lettore di micropiastre

  1. Leggere l'assorbanza dei campioni a 650 nm con un lettore di micropiastre assorbanza.
  2. Effettuare una curva standard Pi. Utilizzando un software grafici, grafico i valori di assorbanza per i campioni standard Pi funzione della concentrazione al fine di trovare una equazione utilizzata per risolvere per la quantità di fosfato in ciascun campione.
  3. Calcolare l'ATPasi per ogni campione calibrando con lo standard di fosfato. Fosfato rilasciato = (OD 650 - Y intercetta) / pendio.
    1. Nella media del totale Pi da duplicati di ogni campione. Sottrarre lettura di assorbanza del controllo del buffer solo da questo numero. Moltiplicate questo per il fattore di diluizione (50 nel nostro esempio).
    2. Determinare il Pi nmol rilasciato per proteine ​​micromol. Rappresentazione grafica questi valori per ogni punto temporale in un saggio cinetica dovrebbe produrre attacchi lineari di almeno R = 0,99 (figura 1); Se not, il dosaggio può essere regolato con più o meno proteina o un tempo di incubazione più lungo o più breve.
  4. Rappresentano i risultati come nmol Pi / mol proteina / min (figure 2, 3), o come nmol Pi / mg proteine ​​/ min se desiderato.

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Risultati

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L'attività in vitro del T2S ATPasi Epse può essere stimolato da copurification del Epse con il dominio citoplasmatico di EPSL (Epse-cytoEpsL) e l'aggiunta di acido cardiolipina fosfolipide 12. È anche possibile determinare il ruolo di particolari residui Epse a idrolisi confrontando l'attività di tipo selvatico (WT) per forme varianti della proteina utilizzando questo saggio. Qui, l'effetto di sostituire due residui di lisina nel dominio zinc-binding Epse viene misura...

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Discussione

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Questo è un protocollo generale per la misurazione dell'attività di ATPasi vitro di proteine ​​purificate per la caratterizzazione biochimica. Questo metodo può essere facilmente ottimizzato; per esempio, regolando la quantità di proteine, tampone e composizioni di sale, la temperatura, e variando la lunghezza del test e intervalli (compreso l'aumento del numero totale di intervalli) può migliorare l'attività di quantificazione. Disponibili in commercio malachite reagenti verde-based sono m...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento da una sovvenzione del National Institutes of Health RO1AI049294 (a M. S.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
tampone HEPESFisherBP310-500
Cloruro di sodioFisherBP358-212
Cloruro di magnesioFisherBP214-500
Adenosina trifosfato (ATP)FisherBP41325
piastre a 96 pozzetti (trasparenti, fondo piatto)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life SciencesBML-AK111Reagente preferito per la rilevazione del fosfato. Attenzione: irritante.
Lettore diBioTek Synergy o
softwarePrism 5
micropiastre GraphPad comparabile

Riferimenti

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