Descriviamo un protocollo di base per quantificare l'attività dell'ATPasi in vitro. Questo protocollo può essere ottimizzato in base al livello di attività e ai requisiti di una data ATPasi purificata.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Adenosina trifosfato enzimi-idrolisi, o ATPasi, svolgono un ruolo critico in una gamma diversificata di funzioni cellulari. Queste proteine dinamici in grado di generare energia per il lavoro meccanico, come il traffico di proteine e il degrado, trasporto dei soluti, e movimenti cellulari. Il protocollo qui descritto è un metodo semplice per misurare l'attività in vitro di ATPasi purificata per la caratterizzazione funzionale. Proteine idrolizzano ATP in una reazione che provoca il rilascio inorganica fosfato e la quantità di fosfato liberato viene poi quantizzati utilizzando un saggio colorimetrico. Questo protocollo altamente adattabile può essere regolata per misurare l'attività ATPasi in saggi cinetici o endpoint. Un protocollo rappresentativo è qui fornito in base all'attività e requisiti di EPSE, AAA + ATPasi coinvolta nella secrezione di tipo II nel batterio Vibrio cholerae. La quantità di proteina purificata necessaria per misurare l'attività, la lunghezza del test e la sincronizzazione e il numero di saintervalli mpling, buffer e la composizione del sale, temperatura, co-fattori, stimolanti (se presente), ecc possono variare da quelli qui descritti, e quindi un po 'di ottimizzazione può essere necessario. Questo protocollo fornisce un quadro di base per ATPasi caratterizzano e può essere eseguita rapidamente e facilmente regolato come necessario.
Introduzione
Le ATPasi sono enzimi integrali in molti processi in tutti i regni della vita. Le ATPasi agiscono come motori molecolari che utilizzano l'energia dell'idrolisi dell'ATP per alimentare reazioni diverse come il traffico, il dispiegamento e l'assemblaggio delle proteine; replicazione e trascrizione; metabolismo cellulare; movimento muscolare; motilità cellulare; e pompaggio ionico1-3. Alcune ATPasi sono proteine transmembrana coinvolte nel trasporto di soluti attraverso le membrane, altre sono citoplasmatiche e possono essere associate a una membrana biologica come la membrana plasmatica o quelle degli organelli.
AAA+ Le ATPasi (ATP....
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Protocollo
1. Eseguire ATP idrolisi di reazione con proteina purificata
- Preparare scorte di tutti i reagenti necessari per l'incubazione con proteina purificata.
- Preparare tampone 5x HEPES / NaCl / glicerolo (HNG) contenente 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl, e il 5% glicerolo (o altro tampone a seconda dei casi).
- Preparare 100 mM MgCl 2 (o altro metallo, se ATPasi è in metallo-dipendente) in acqua.
- Preparare fresco 100 mM ATP a 200 mm Tris Base (non regolare il pH ulteriormente) con alta ATP purezza. Aliquota e memorizzare il titolo ATP a -20 ° C per non più di un paio di settimane, come l'ATP si rompe nel corso del temp....
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Risultati
L'attività in vitro del T2S ATPasi Epse può essere stimolato da copurification del Epse con il dominio citoplasmatico di EPSL (Epse-cytoEpsL) e l'aggiunta di acido cardiolipina fosfolipide 12. È anche possibile determinare il ruolo di particolari residui Epse a idrolisi confrontando l'attività di tipo selvatico (WT) per forme varianti della proteina utilizzando questo saggio. Qui, l'effetto di sostituire due residui di lisina nel dominio zinc-binding E.......
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Discussione
Questo è un protocollo generale per la misurazione dell'attività di ATPasi vitro di proteine purificate per la caratterizzazione biochimica. Questo metodo può essere facilmente ottimizzato; per esempio, regolando la quantità di proteine, tampone e composizioni di sale, la temperatura, e variando la lunghezza del test e intervalli (compreso l'aumento del numero totale di intervalli) può migliorare l'attività di quantificazione. Disponibili in commercio malachite reagenti verde-based sono m.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento da una sovvenzione del National Institutes of Health RO1AI049294 (a M. S.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tampone HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Cloruro di sodio | Fisher | BP358-212 | |
| Cloruro di magnesio | Fisher | BP214-500 | |
| Adenosina trifosfato (ATP) | Fisher | BP41325 | |
| piastre a 96 pozzetti (trasparenti, fondo piatto) | VWR | 82050-760 | |
| BIOMOL Green | Enzo Life Sciences | BML-AK111 | Reagente preferito per la rilevazione del fosfato. Attenzione: irritante. |
| Lettore di | BioTek Synergy o | ||
| software | Prism 5 |
Riferimenti
- Hanson, P. I., Whiteheart, S. W. AAA+ proteins: have engine, will work. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (7), 519-529 (2005).
- Baker, T. A., Sauer, R. T. ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochimica et Biophysica Acta. 1823 (1), 15....
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Ristampe e permessi
