Articolo metodologico

Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale

DOI:

10.3791/54315

⸱

20 settembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive la funzionalizzazione della superficie personalizzabile del sistema destiobiotina, streptavidina e APTES al fine di isolare specifici tipi di cellule di interesse. Inoltre, questo manoscritto copre le applicazioni, l'ottimizzazione e la verifica di questo processo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno dei fattori limitanti all'adozione e al progresso della medicina personalizzata è l'incapacità di sviluppare strumenti diagnostici per sondare le sfumature individuali nell'espressione da paziente a paziente. Le attuali metodologie che cercano di separare le cellule per riempire questa nicchia provocano l'interruzione dell'espressione fisiologica, rendendo la tecnica di separazione inutile come strumento diagnostico. In questo protocollo, descriviamo la funzionalizzazione e l'ottimizzazione di una superficie per la cattura e il rilascio cellulare. Questa superficie funzionalizzata integra anticorpi biotinilati con una superficie di vetro funzionalizzata con un aminosilano (APTES), destiobiotina e streptavidina. Il rilascio cellulare è facilitato dall'introduzione di biotina, che consente la raccolta e la purificazione delle cellule catturate dalla superficie. Questo rilascio avviene attraverso il targeting della porzione secondaria destiobiotina, che si traduce in un paradigma di rilascio molto più delicato. Questa riduzione dei reagenti aggressivi e delle forze di taglio riduce i cambiamenti nell'espressione cellulare. La superficie funzionalizzata cattura fino all'80% delle cellule in una singola miscela cellulare e ha dimostrato una cattura del 50% in una miscela a doppia cella. Vengono studiate le applicazioni di questa tecnologia agli xenotrapianti e agli studi di separazione del cancro. Vengono descritte anche le tecniche di quantificazione per la verifica delle superfici, come il lettore di piastre e le analisi ImageJ.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Da banco approcci separazione cella corrente (ad esempio, la fluorescenza delle cellule attivate di smistamento 1, cattura laser micro-dissezione 2, immuno-magnetico tallone di separazione 1) può richiedere diverse ore di preparazione e smistamento. Questi grandi scale temporali possono influenzare i livelli di risposta e di espressione fisiologici, con conseguente analisi che non sono rappresentativi della risposta fisiologica 3. I sistemi sono necessari che possono rapidamente ed efficacemente isolare specifici tipi cellulari senza interrompere recettore livelli di superficie cellulare per migliorare l'isolamento delle cellule e arricchimento per applicazioni biomediche. Pertanto, il razionale per il nostro approccio è quello di sviluppare un approccio dolce per l'isolamento delle cellule.

Il "lab on a chip" concetto offre la promessa di ordini di grandezza più veloce di isolamento cellulare (ore-to-minuti), e coinvolge più frequentemente catturare cellule su una superficie e rilasciare cellule o conte intracellularenti attraverso fisico 4,5 o metodi chimici 6. Anche se questi approcci offrono alcuni vantaggi, quali l'identificazione dell'espressione proteica 7,8, individuando espressione di RNA 9-11, o addirittura fornire cellule per coltura in vitro 12,13, molte di queste tecniche non può essere tradotto per la diagnostica, come recettore delle cellule profilatura a causa ai loro ambienti non fisiologici. Agenti di sollevamento enzimatici come la collagenasi può colpire anche queste quantità del recettore 14,15, cioè le tecniche di quantificazione recettore delle cellule che utilizzano questi agenti di sollevamento non genererà dati fisiologici precisi. Lisi cellulare impedisce differenziazione tra i recettori di superficie nativi e quelli precedentemente internalizzato 16. Questo protocollo descrive un approccio rapido e delicato per l'isolamento delle cellule.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pulizia della superficie di vetro e Preparazione Reagenti

  1. Inserire una superficie di vetro in una macchina di plasma di ossigeno per 5 min a 50% di potenza per pulirlo.
  2. Preparare ricostituito (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) soluzione 2,5 ml 2%, con l'aggiunta di 50 ml di APTES e 2,45 ml di etanolo in un tubo conico.

2. APTES e DSB Funzionalizzazione

  1. Aggiungere la soluzione APTES alle superfici. Dispensare 150 ml per pozzetto per 8 pozzetti. Pipettare 100 ul per pozzetto per 24 pozzetti. Pipettare 1,1 ml per piatti di vetro 60 x 15 mm. Coprire le superfici per evitare l'evaporazione e la distribuzione non uniforme della soluzione APTES. Collocare le superfici su un agitatore piattaforma per 50 min a temperatura ambiente, che crea una distribuzione uniforme dello strato APTES.
    NOTA: APTES è un aminosilane che forma il primo strato di superficie. Se si utilizza una superficie diversa, euristicamente determinare il volume di soluzione necessario per coprire la superficie.
  2. Selezionare la temperatura del forno, mentre le superfici sono shaker: Riscaldare a 55 ° C per 2 ore per gli 8 pozzetti e 24 pozzetti. vetro di calore solo piatti a 90 ° C per 1 ora.
  3. Lavare le superfici con etanolo.
    1. Somministrare la quantità di etanolo richiesto facendo riferimento basato sulla superficie utilizzata. Aggiungere 150 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 8 pozzetti. Aggiungere 125 ml di etanolo a ciascun pozzetto per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di etanolo per piatti di vetro.
    2. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Risciacquare altre due volte con etanolo.
      NOTA: Se uno dei fondo di vetro piatti e hanno alcuna plastica in loro, non li riscaldare superiore a 65 ° C, come la plastica inizierà a sciogliersi e ordito.
  4. Lavaggio con gas 100% di azoto erogato da un serbatoio. Mettere le superfici in oVen.
  5. Preparare 2,5 ml di soluzione di d-desthiobiotin (DSB) combinando 1,5 mg / ml DSB in 37,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO), e 5 mg / ml-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) in 2462,5 microlitri della (pH 6) tampone 0,1 M di acido 4-morpholinoethanesulfonic hydrate (MES). Poi combinare entrambe le soluzioni.
  6. Aggiungere 1 ml di 2-mercaptoetanolo β, dopo 15 minuti, nella soluzione di estinguere la reazione tra DSB e EDC. Rimuovere APTES calde funzionalizzati superfici di vetro dal forno. Attendere 5-10 min per le superfici in vetro a raffreddarsi.
  7. Aggiungere MES tampone la superficie da lavare, utilizzando importi basati sulla superficie. Aggiungere 150 ml MES tampone di 8 pozzetti. Aggiungere 125 microlitri MES tampone di per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml MES buffer per piatti di vetro.
  8. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamentenella superficie. Risciacquare altre due volte con tampone MES.
  9. Applicare la soluzione DSB alle superfici da consentire loro di incubare. Aggiungere 150 microlitri soluzione DSB per ben 8 pozzetti. Aggiungere 100 pl per soluzione DSB bene per 24 pozzetti. Aggiungere 1,1 ml di soluzione di vetro piatti DSB.
  10. Posizionare le superfici in vetro DSB coperti su un tovagliolo di carta umido all'interno di una capsula di Petri. Coprire e incubare in un C frigo a 4 ° C per 18-24 ore.

3. Streptavidina Funzionalizzazione

  1. Risciacquare ogni superficie di vetro tre volte con 1 ml di 1.0x tampone fosfato (PBS). Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Diluire la soluzione streptavidina (SAV) stock di 0,4 mg / ml (consigliato).
    NOTA: PBS isotonica modo che possa essere utilizzato come mezzo per diluizione e risciacquo. PBS è usato come solvente per il SAv, e quindi, non influenzerà la capacità del SAv per legarsi alla superficie.
  2. Applicare 0,4 mg / ml di soluzione di SAv uniformemente alle superfici in modo che un sottile strato di forme sul fondo del bicchiere, selezionare la quantità di soluzione basata sulla superficie. Per 8 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 150 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per 24 pozzetti, aggiungere la soluzione SAv 100 ml 0,4 mg / ml per pozzetto. Per i piatti di vetro, aggiungere la soluzione SAv / ml 1,1 ml 0,4 mg.
  3. Coprire e spostare le piastre a 14 cm capsula di Petri di trattenere l'umidità. Incubare la piastra di Petri in frigorifero per 18-24 ore.
    NOTA: E 'essenziale utilizzare volumi consistenti di APTES, DSB, e SAV su ogni superficie.
  4. Risciacquare ogni superficie di vetro per tre volte con 150 ml di PBS per rimuovere SAv. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
  5. Bagnare un tovagliolo di carta wesimo acqua deionizzata e posizionare il tovagliolo di carta appartamento a 14 centimetri Petri che circonda le piastre per trattenere l'umidità nei pozzetti. Coprire la piastra di Petri contenente i pozzi. Incubare la piastra di Petri in un livello 1 (BSL-1) frigorifero 4 ° C fino al momento biosicurezza.

4. Acquisizione delle cellule e di uscita

  1. Inizia con pallone T175 (s) di cellule destinati per l'esperimento. Aspirare il supporto dal pallone (s). Lavare i media rimanenti con 5 ml di temperatura ambiente PBS. Aspirare PBS dal pallone (s).
  2. Aggiungere 10 ml di agente di sollevamento non enzimatica, come cellule dissociazione Solution, al pallone T-175 delle cellule. Mettere il pallone in incubatrice per 6 minuti per consentire il sollevamento delle cellule dal pallone.
  3. Dopo 6 minuti, aggiungere 10 ml di soluzione salina bilanciata freddo di Hank (HBSS; Vedi elenco dei materiali) per inattivare l'agente di sollevamento. Estrarre 20 ml di cellule per contare il numero di cellule in soluzione utilizzando un emocitometro.
    NOTA: A seconda del funcsuperfici utilizzate nell'esperimento cattura tionalized, il numero di cellule necessaria varia. Per funzionalizzati 8 pozzetti, utilizzare 300.000 cellule per pozzetto. Per i piatti di vetro funzionalizzati, utilizzare 1,1 milioni di cellule. Per funzionalizzati 24 pozzetti, sono raccomandati 125.000 cellule. Maggiori informazioni sul conteggio delle cellule si trova nel Supplemento.
  4. Ripetere i punti 4.1- 4.3 per un altro fiasco di cellule, se un numero inferiore di cellule sono presenti quanto necessario per l'esperimento. Unire sospensioni cellulari e cellule raccontano per ottenere il numero totale di cellule in soluzione.
  5. Centrifugare sospensione di cellule in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C per ottenere un pellet di cellule concentrate. Trova la quantità appropriata di HBSS aggiungere alla sospensione cellulare per ottenere una concentrazione di 1 x 10 6 cellule per ml, quindi aspirare il supernatante dalle cellule centrifugare e aggiungere il volume calcolato. Questo volume può essere calcolata utilizzando le equazioni nel supplemento.
  6. Pipetta su e giù (triturare) per risospendere °e le cellule in soluzione e ridurre aggregazione cellulare in soluzione che può ridurre legame degli anticorpi. Dividere la soluzione cellulare in soluzioni sperimentali di controllo separata e. Visualizza File supplementare per i componenti e calcoli.
  7. Aggiungere gli anticorpi biotinilati alle rispettive soluzioni di cellule, come descritto nel file supplementare. Incubare per 30 minuti a 4 ° C in un mixer end-over-end.
    NOTA: Per le cellule MCF7GFP, 0,5 mg / ml hIgG o 0,5 mg anticorpi / ml HLA-ABC sono raccomandati. Per macrofagi RAW, 1 mg / ml mCD11b sono raccomandati a metà del volume per tenere conto delle differenze di diluizione. Per le cellule ombelicale Vena endoteliali (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 è raccomandato.
  8. Lavare la superficie di vetro funzionalizzata con HBSS. Per questo esperimento, si consiglia una piastra 8 bene.
    1. Aggiungere 150 microlitri HBSS ad ogni pozzetto per 8 pozzetti. Risciacquare altre due volte con HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo.Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Mantenere freddo a 4 ° C.
  9. Aggiungere le soluzioni cellulari ai pozzetti ed attendere 45 min per le cellule di incubare su ghiaccio sul shaker. Effettuare la soluzione di biotina in sterili HBSS utilizzando volumi calcolati come descritto nel supplemento.
  10. Rimuovere la soluzione di cellule dai pozzetti vetro utilizzando HBSS.
    1. Delicatamente pipetta 150 microlitri HBSS in tutti i pozzetti. Pipettare quindi il HBSS. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
    2. Ripetere altre due volte. Dopo il lavaggio, aggiungere HBSS ai pozzetti per mantenere le cellule bagnato.
  11. Aggiungere 150 ml di soluzione di biotina 20 mm a ogni rispettivo rilascio bene, e poi attendere 20 minuti per consentire la reazione.
  12. Ricordare cellule non specificamente, legatos mediante lavaggio con HBSS come detto sopra, e quindi se si utilizza cellule fluorescente, procedere alla fluorescenza immagine cellule. Anche immagine cellule vive in un pallone (come controllo, per confrontare con le cellule nel pozzo). Se si utilizza verdi proteina fluorescente (GFP), le cellule trasfettate, l'eccitazione sarà 470 nm, e l'emissione sarà 515 nm.

5. Anticorpo Ottimizzazione: la titolazione degli anticorpi

  1. Iniziare sollevando le cellule dal pallone T75 o T175, come spiegato al punto 4.1- 4.3.
    NOTA: Questi volumi sono tarati per 24 pozzetti, ma possono essere modificati per adattarsi a qualsiasi superficie di vetro funzionalizzati attraverso test euristico. Una titolazione rappresentante anticorpo è mostrato in Figura 1.
  2. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro e quindi centrifugare la soluzione di cellule in una provetta conica a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire cellule di 1 milione di cellule per ml, utilizzando i calcoli descritti nel supplemento.
  3. Dividere il 1 mcellule ilioni per ml di soluzione in sei diverse soluzioni di 500 ml in diverse provette da centrifuga per l'anticorpo (Ab) soluzioni.
    1. Diluire la soluzione di anticorpi stock da 10 mg / ml, 1 mg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Creare i controlli utilizzando 100 ml di Stain tampone (PBS + 1% di sodio azide + 1% BSA), e 500 microlitri di cellule per il controllo senza Ab in esso. Per il controllo in bianco (No Ab e non le cellule), utilizzano una soluzione di 300 l di PBS.
      NOTA: ATTENZIONE: La sodio azide è estremamente tossici, esplosivi, e l'estrema cura deve essere presa quando lo si utilizza. Si prega di consultare la scheda di sicurezza (SDS) e utilizzare l'equipaggiamento di sicurezza appropriato.
  4. Combinare e incubare le soluzioni Ab con le soluzioni di cellule del mixer end-over-end a 4 ° C per 30 min. Sciacquare i funzionalizzati 24 pozzetti con HBSS tre volte. Risciacquare la superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere il pi grecopipetta ad un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie.
  5. Aliquota 125 ml di ogni soluzione campione nelle APTES appropriati, DSB, e SAV funzionalizzati bene. Incubare a 4 ° C o su ghiaccio per 45 min sulla superficie del vetro. Risciacquare la superficie con HBSS tre volte per rimuovere le cellule non specificamente collegati. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Non sciacquare la riga inferiore, come quelli sono i controlli.
  6. Aggiungere 150 ml di HBSS ad ogni lavato bene, mettere i 24 piastre e su ghiaccio, e quindi utilizzare un lettore di piastre per misurare la fluorescenza delle cellule GFP (eccitazione 485 nm / emissione 528 nm).

6. cellulare Ottimizzazione: Titolazione cellulare

  1. Sollevare le cellule di cui al punti 4.1 -4.3.
  2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Spin giù cellulare in modoluzione in tubo conico a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Ricostituire le cellule a 1 milione di cellule per ml.
    NOTA: Ulteriori informazioni sull'uso del emocitometro può essere trovato nel supplemento.
  3. Pipettare 1,6 ml della soluzione di cellule per lo stock di 1,6 milioni di cellule e mettere in un tubo conico. Pipetta 800 ml di cellule dalla soluzione di cellule per lo stock di 800.000 cellule e mettere in un tubo conico. Pipettare 80 microlitri dal magazzino delle cellule per lo stock di 80.000 cellule e mettere in un tubo conico. Dispensare 8 microlitri dal magazzino cella per 8.000 cellule magazzino e posto in un tubo conico.
    NOTA: Le concentrazioni sono date per 8 misure pozzetti, replicare, se necessario. Un esempio di output piastra è illustrata nella Figura 2.
  4. Prendere le soluzioni quattro Stock e spin in una centrifuga a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere tutte le soluzioni azionari in 400 ml di HBSS.
  5. Aggiungere 1,6 microlitri di 100 anticorpi ng / ml per lo stock 1,6 milioni di cellule, 0,8 μl allo stock 800.000 cellule, e 0,5 ml a tutti gli altri stock. Incubare l'anticorpo per 30 minuti nel mixer end-over-end per 30 minuti a 4 ° C. Lavare la superficie di vetro funzionalizzato con HBSS tre volte.
    NOTA: La piastra ben funzionalizzati 8 è consigliato per la microscopia quantificazione, mentre il 24 pozzetti funzionalizzato è raccomandato per lettore di piastre quantificazione. concentrazione dell'anticorpo per 8.000 cellule azione non è stata ridotta per consentire il fattore limitante della superficie cattura di non essere la mancanza di anticorpi in soluzione, ma piuttosto le proprietà cattura della superficie.
  6. Applicare 150 ml di soluzioni campione in ciascun pozzetto. Applicare lo stock 1,6 milioni cella alla prima colonna di pozzi a sinistra. Applicare lo stock 800.000 cella alla seconda colonna da sinistra. Applicare lo stock di 80.000 cellule per la terza colonna da sinistra. Infine applicare lo stock di 8.000 cellule per l'ultima colonna. Incubare per 45 minuti a 4 ° C su shaker.
    NOTA: Il 1,6 milionicella stock serve come la più alta concentrazione da testare, ed è il doppio della quantità di cellule che viene tipicamente utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (600.000 cellule per pozzetto) Lo stock 800.000 cellule serve come controllo per l'esperimento come è tipico concentrazione cellulare che viene utilizzato in esperimenti di separazione cellulare (3.000.000 cellule per pozzetto). Lo stock di 80.000 cellule serve come una diluizione di dieci volte per verificare le concentrazioni più basse per la cattura cellulare (30.000 cellule per pozzetto). Lo stock 8.000 cellule serve come una diluizione cento volte da utilizzare come un test per verificare il limite inferiore della separazione cellulare (3.000 cellule per pozzetto).
  7. Risciacquare con HBSS tre volte. Risciacquare superficie scaricando e prelievo del liquido da un punto fisso come l'angolo del pozzo. Tenere la pipetta in un angolo di circa 70 ° in modo che la punta non è puntato direttamente nella superficie. Raccogliere tutti i lavaggi.
  8. Immagine le cellule su un microscopio a fluorescenza, se si utilizza 8 piastre e, scattare foto di ogni survolto, e applicare 150 microlitri biotina per ogni superficie per un'ora a 4 ° C su shaker. Dopo un'ora, risciacquare pozzetti rilascio biotina con HBSS 3 volte come prima. Raccogliere tutti i lavaggi da pozzi per il conteggio con l'emocitometro e l'immagine dei pozzi di rilascio.
  9. Applicare 150 ml di 20 mM soluzione biotina in eccesso nei relativi pozzetti di rilascio di biotina per 1 ora, se si utilizza 24 tavole bene, e poi sciacquare quei pozzetti 3 volte con HBSS. Quantificare 24 pozzetti utilizzando un lettore di piastre. Utilizzare un emocitometro per contare le cellule da tutti i lavaggi e raccolti.

Analisi 7. Immagine

Nota: Si raccomanda Il pacchetto software FIJI (http://fiji.sc/Fiji) per l'analisi delle immagini. Inizialmente, le immagini sono state convertite in scala di grigi in, e quindi la luminosità / contrasto è stato modificato per portare fuori le cellule.

  1. Caricare l'immagine, e convertire in scala di grigi facendo clic sulla scheda immagine poi scorrendo verso il basso per "Tipo" e quindi facendo clic4; 8 bit ".
  2. Aumentare il contrasto dell'immagine facendo clic sulla scheda immagine e poi scorrendo a "Regola". Clicca su "Luminosità e Contrasto", e quindi utilizzare le barre di scorrimento per rendere le cellule spiccano. Se si utilizza immagini di fluorescenza, invertire le immagini per rendere le cellule più definiti.
  3. Caricare un plugin su ImageJ chiamato ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) per analizzare le immagini.
  4. Aprire ITCN. Quando viene visualizzata una finestra di dialogo che richiede all'utente con diversi parametri per valutare la dimensione della cella, impostare la larghezza minima della cella di interesse prima. Selezionare l'opzione "Rileva scuri Peaks" se l'immagine è a fluorescenza e le cellule sono oscurati.
  5. Impostare il valore soglia a 2 inizialmente, e poi premere il pulsante "Count". Una nuova versione contato dell'immagine apparirà con puntini rossi che delineano in cui le cellule sono state contate.
  6. Regolare il parametro di soglia e la larghezza per ottenere dati cellulare più precise defining le dimensioni di una "cella". Nota: Il numero di cellule contate sarà in una finestra di dialogo sulla destra. Modifica dei parametri daranno diverso numero di cellule contate.
  7. Continuare a scorrere attraverso i parametri di soglia e larghezza fino a raggiungere una buona stima del numero di cellule.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Usando questo protocollo mostriamo cattura cellule (Figura 3A) e il rilascio di cellule (Figura 3C) di cellule MCF7GFP nonché controlli cellule vive (Figura 4). Abbiamo quantificato la cattura cella come 60% ​​e 80% sono stati rilasciati (Figura 3C). Quando abbiamo esteso questo approccio ad una miscela di RAW 264.7 macrofagi e cellule MCF7GFP, il 50% dei macrofagi RAW sono stati catturati (Fig. 3D) e l'...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miglioramenti nelle tecniche di isolamento delle cellule promuove studi scientifici nelle relazioni struttura-funzione in neuroscienze 18, staminali programmazione delle cellule in biologia rigenerativa, e la segnalazione angiogenico in biologia vascolare 19. Infatti, colture primarie 20 (ad esempio, HUVEC) in biologia vascolare avviene principalmente attraverso l'uso di tecniche di isolamento cellulare. Isolamento delle cellule è stata recentemente utilizzata anche per il f...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo ringraziare l'American Cancer Society, la Divisione dell'Illinois (282802) e la National Science Foundation CBET (1512598) per il sostegno finanziario. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Dianwen Zhang dell'Università dell'Illinois Beckman Institute per la formazione in microscopia. Infine, vorremmo ringraziare Jared Weddell, Stacie Chen e Spencer Mamer per le discussioni approfondite.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
(3-Aminopropil) trietossisilano (APTES)Acros Organics919-30-2Utilizzato per produrre la soluzione APTES al 2%
Detergente al plasma PicoDienerModello 1Pulisce le superfici e consente l'incollaggio di PDMS al vetro
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Utilizzato come meccanismo di rilascio nella superficie di cattura cellulare.
dimetilsolfossido (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDissolve il DSB in soluzione
1-Etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC)Termo-scientifico5g: 22980
25g: 22981		Attiva gli acidi carbossilici e consente il legame delle proteine alla superficie del vetro.
vetrino di coltura a 8 pozzetti non rivestitoBD FalconConfezione da 24: 354118
Confezione da 96: 354108		Utilizzato in esperimenti cellulari con microscopio a fluorescenza Zeiss, come gli esperimenti iniziali di cattura e quantificazione del rilascio
Piastre a 24 pozzetti con fondo in vetroMatTekP24G-0-13-FUtilizzato in esperimenti cellulari con lettore di piastre, come gli esperimenti di anticorpi e titolazione cellulare
MercaptoetanoloScience Lab60-24-2Utilizzato per estinguere la reazione tra EDC e DSB
Acido 4-morfolinoetsolfonico idrato
(MES idrato 99%)		Fisher ScientificAC172590250Utilizzato per produrre tampone MES 0,1 M da utilizzare nella reazione EDC
Forno di precisioneThermo Scientific11-475-153Utilizzato nella polimerizzazione dello strato PDMS e APTES.
Agitatore Titramax 1000Heidolph13-889-420Utilizzato per garantire una distribuzione uniforme di APTES sulle superfici.
1x Streptavidina 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Proteina legante la biotina. Può causare irritazione.
Piatto in vetro da 5 cmFisher Scientific08748AUtilizzato negli studi HUVEC e nei futuri studi di profilazione.
Piastra di Petri da 14 cm con coperchioSigma-AldrichZ717231Utilizzata per contenere i campioni in fase di funzionalizzazione e trasportarli.
Cellule MCF7-GFPCell BiolabsAKR211Conservato in azoto liquido
RAW264.7 macrofagi di topoATCCTIB-71Regalatoci dal laboratorio Smith dell'Università dell'Illinois. Conservato in azoto liquido.
TrypLELife Technologies12605036Conservato in 100 ml a temperatura ambiente
Dulbecco' s modificato Eagle mediumCell Media Facility presso la School of Chemical Sciences presso UIUC50003PCFornitore: Corning
Aminoacidi non essenzialiCell Media Facility presso la School of Chemical Sciences presso UIUC25-025-CIGià aggiunto in DMEM dalla struttura. Fornitore: Corning.
Raschietto cellulareFisher Scientific12-565-58Piccolo 23 cm 50 confezione
Soluzione di dissociazione cellulareCorningMT-25-056CIUtilizzato per sollevare le cellule in modo non enzimatico per l'uso in esperimenti cellulari
EmatocitometroHausser02-671-54Utilizzato per contare le cellule per la quantificazione delle soluzioni cellulari e l'efficacia della cattura e del rilascio.
BiotinaAmresco58-85-5Utilizzato per rilasciare cellule dalla superficie.
HBSSCreato da RicettaN/AUtilizzato per mantenere in vita le cellule in sospensione e per lavare le superfici di legame non specifico. Adattato dai protocolli di Cold Spring Harbor: Nel 500  ml, utilizzare 4  g NaCl, 0,2  g KCl, 0,0402  g Na2PO4• 7H2O, 0,03  g KH2PO4 e 0,5  g di glucosio. Aggiungi acqua deionizzata per arrivare a  500 ml, filtrare e conservare in frigorifero.
Anticorpo HLA-ABCAnticorpo BioLegend311402utilizzato per catturare le cellule MCF7gfp
Anticorpo hIgGBioLegendHP6017Anticorpo utilizzato per catturare le cellule MCF7gfp
Cellule GFP MCF7AKR-211Cell Biolabsche è stata trasfettata con proteina fluorescente verde.
Coniche AssortiteTermo-Scientifiche15mL: 12-565-26850/15 ml Coniche in plastica per la conservazione di soluzioni e aliquote.
Rotatori per mini-provette (miscelatore end over end)Fisher Scientific05-450-127Utilizzato per incubare anticorpi e miscelare altre soluzioni cellulari al fine di miscelare
Axiovert 200M (microscopio a fluorescenza)ZeissN/A Microscopioa florescenza invertita Zeiss Axiovert 200 M.
Colonne di desalinizzazione ZebaThermo-ScientificPI-87770Utilizzate per purificare gli anticorpi appena biotinilati dopo l'uso del Kit di Biotinilazione. Istruzioni fornite su:
http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf EZ Link Sulfo NHS Kit di biotinilazione a basso pesoTermo-ScientificoUtilizzato per biotinilare gli anticorpi per consentirne l'integrazione con la superficie di cattura
Lettore di piastreBioTekSynergy HTX Lettore multimodaleUtilizzato per misurare quantitativamente l'intensità della fluorescenza negli esperimenti di titolazione.
Linea di cancro al seno luminale di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791(2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434(2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Glass Surface FunctionalizationCell Capture ReleaseBiotinylated AntibodiesDesthiobiotin StreptavidinAPTES Surface TreatmentCell Isolation MethodFluorescence Imaging AnalysisFlow Cytometry DownstreamTumor Angiogenesis ScreeningPersonalized Medicine Diagnostics

Articoli correlati