Questo protocollo descrive la funzionalizzazione della superficie personalizzabile del sistema destiobiotina, streptavidina e APTES al fine di isolare specifici tipi di cellule di interesse. Inoltre, questo manoscritto copre le applicazioni, l'ottimizzazione e la verifica di questo processo.
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Articolo metodologico
Un metodo di isolamento delle cellule mirata tramite Glass funzionalizzazione superficiale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Uno dei fattori limitanti all'adozione e al progresso della medicina personalizzata è l'incapacità di sviluppare strumenti diagnostici per sondare le sfumature individuali nell'espressione da paziente a paziente. Le attuali metodologie che cercano di separare le cellule per riempire questa nicchia provocano l'interruzione dell'espressione fisiologica, rendendo la tecnica di separazione inutile come strumento diagnostico. In questo protocollo, descriviamo la funzionalizzazione e l'ottimizzazione di una superficie per la cattura e il rilascio cellulare. Questa superficie funzionalizzata integra anticorpi biotinilati con una superficie di vetro funzionalizzata con un aminosilano (APTES), destiobiotina e streptavidina. Il rilascio cellulare è facilitato dall'introduzione di biotina, che consente la raccolta e la purificazione delle cellule catturate dalla superficie. Questo rilascio avviene attraverso il targeting della porzione secondaria destiobiotina, che si traduce in un paradigma di rilascio molto più delicato. Questa riduzione dei reagenti aggressivi e delle forze di taglio riduce i cambiamenti nell'espressione cellulare. La superficie funzionalizzata cattura fino all'80% delle cellule in una singola miscela cellulare e ha dimostrato una cattura del 50% in una miscela a doppia cella. Vengono studiate le applicazioni di questa tecnologia agli xenotrapianti e agli studi di separazione del cancro. Vengono descritte anche le tecniche di quantificazione per la verifica delle superfici, come il lettore di piastre e le analisi ImageJ.
Introduzione
Da banco approcci separazione cella corrente (ad esempio, la fluorescenza delle cellule attivate di smistamento 1, cattura laser micro-dissezione 2, immuno-magnetico tallone di separazione 1) può richiedere diverse ore di preparazione e smistamento. Questi grandi scale temporali possono influenzare i livelli di risposta e di espressione fisiologici, con conseguente analisi che non sono rappresentativi della risposta fisiologica 3. I sistemi sono necessari che possono rapidamente ed efficacemente isolare specifici tipi cellulari senza interrompere recettore livelli di superficie cellulare per migliorare l....
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Protocollo
1. Pulizia della superficie di vetro e Preparazione Reagenti
- Inserire una superficie di vetro in una macchina di plasma di ossigeno per 5 min a 50% di potenza per pulirlo.
- Preparare ricostituito (3-amminopropil) trietossisilano (APTES) soluzione 2,5 ml 2%, con l'aggiunta di 50 ml di APTES e 2,45 ml di etanolo in un tubo conico.
2. APTES e DSB Funzionalizzazione
- Aggiungere la soluzione APTES alle superfici. Dispensare 150 ml per pozzetto per 8 pozzetti. Pipettare 100 ul per pozzetto per 24 pozzetti. Pipettare 1,1 ml per piatti di vetro 60 x 15 mm. Coprire le superfici per evitare l'evaporazione....
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Risultati
Usando questo protocollo mostriamo cattura cellule (Figura 3A) e il rilascio di cellule (Figura 3C) di cellule MCF7GFP nonché controlli cellule vive (Figura 4). Abbiamo quantificato la cattura cella come 60% e 80% sono stati rilasciati (Figura 3C). Quando abbiamo esteso questo approccio ad una miscela di RAW 264.7 macrofagi e cellule MCF7GFP, il 50% dei macrofagi RAW sono stati catturati (Fig. 3D) e l&.......
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Discussione
Miglioramenti nelle tecniche di isolamento delle cellule promuove studi scientifici nelle relazioni struttura-funzione in neuroscienze 18, staminali programmazione delle cellule in biologia rigenerativa, e la segnalazione angiogenico in biologia vascolare 19. Infatti, colture primarie 20 (ad esempio, HUVEC) in biologia vascolare avviene principalmente attraverso l'uso di tecniche di isolamento cellulare. Isolamento delle cellule è stata recentemente utilizzata anche per il f.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare l'American Cancer Society, la Divisione dell'Illinois (282802) e la National Science Foundation CBET (1512598) per il sostegno finanziario. Vorremmo anche ringraziare la dottoressa Dianwen Zhang dell'Università dell'Illinois Beckman Institute per la formazione in microscopia. Infine, vorremmo ringraziare Jared Weddell, Stacie Chen e Spencer Mamer per le discussioni approfondite.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| (3-Aminopropil) trietossisilano (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | Utilizzato per produrre la soluzione APTES al 2% |
| Detergente al plasma Pico | Diener | Modello 1 | Pulisce le superfici e consente l'incollaggio di PDMS al vetro |
| d-Desthiobiotin (DSB) | Sigma | D20655 | Utilizzato come meccanismo di rilascio nella superficie di cattura cellulare. |
| dimetilsolfossido (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | Dissolve il DSB in soluzione |
| 1-Etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) | Termo-scientifico | 5g: 22980 25g: 22981 | Attiva gli acidi carbossilici e consente il legame delle proteine alla superficie del vetro. |
| vetrino di coltura a 8 pozzetti non rivestito | BD Falcon | Confezione da 24: 354118 Confezione da 96: 354108 | Utilizzato in esperimenti cellulari con microscopio a fluorescenza Zeiss, come gli esperimenti iniziali di cattura e quantificazione del rilascio |
| Piastre a 24 pozzetti con fondo in vetro | MatTek | P24G-0-13-F | Utilizzato in esperimenti cellulari con lettore di piastre, come gli esperimenti di anticorpi e titolazione cellulare |
| Mercaptoetanolo | Science Lab | 60-24-2 | Utilizzato per estinguere la reazione tra EDC e DSB |
| Acido 4-morfolinoetsolfonico idrato (MES idrato 99%) | Fisher Scientific | AC172590250 | Utilizzato per produrre tampone MES 0,1 M da utilizzare nella reazione EDC |
| Forno di precisione | Thermo Scientific | 11-475-153 | Utilizzato nella polimerizzazione dello strato PDMS e APTES. |
| Agitatore Titramax 1000 | Heidolph | 13-889-420 | Utilizzato per garantire una distribuzione uniforme di APTES sulle superfici. |
| 1x Streptavidina 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | Proteina legante la biotina. Può causare irritazione. |
| Piatto in vetro da 5 cm | Fisher Scientific | 08748A | Utilizzato negli studi HUVEC e nei futuri studi di profilazione. |
| Piastra di Petri da 14 cm con coperchio | Sigma-Aldrich | Z717231 | Utilizzata per contenere i campioni in fase di funzionalizzazione e trasportarli. |
| Cellule MCF7-GFP | Cell Biolabs | AKR211 | Conservato in azoto liquido |
| RAW264.7 macrofagi di topo | ATCC | TIB-71 | Regalatoci dal laboratorio Smith dell'Università dell'Illinois. Conservato in azoto liquido. |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | Conservato in 100 ml a temperatura ambiente |
| Dulbecco' s modificato Eagle medium | Cell Media Facility presso la School of Chemical Sciences presso UIUC | 50003PC | Fornitore: Corning |
| Aminoacidi non essenziali | Cell Media Facility presso la School of Chemical Sciences presso UIUC | 25-025-CI | Già aggiunto in DMEM dalla struttura. Fornitore: Corning. |
| Raschietto cellulare | Fisher Scientific | 12-565-58 | Piccolo 23 cm 50 confezione |
| Soluzione di dissociazione cellulare | Corning | MT-25-056CI | Utilizzato per sollevare le cellule in modo non enzimatico per l'uso in esperimenti cellulari |
| Ematocitometro | Hausser | 02-671-54 | Utilizzato per contare le cellule per la quantificazione delle soluzioni cellulari e l'efficacia della cattura e del rilascio. |
| Biotina | Amresco | 58-85-5 | Utilizzato per rilasciare cellule dalla superficie. |
| HBSS | Creato da Ricetta | N/A | Utilizzato per mantenere in vita le cellule in sospensione e per lavare le superfici di legame non specifico. Adattato dai protocolli di Cold Spring Harbor: Nel 500 ml, utilizzare 4 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,0402 g Na2PO4• 7H2O, 0,03 g KH2PO4 e 0,5 g di glucosio. Aggiungi acqua deionizzata per arrivare a 500 ml, filtrare e conservare in frigorifero. |
| Anticorpo HLA-ABC | Anticorpo BioLegend | 311402 | utilizzato per catturare le cellule MCF7gfp |
| Anticorpo hIgG | BioLegend | HP6017 | Anticorpo utilizzato per catturare le cellule MCF7gfp |
| Cellule GFP MCF7 | AKR-211 | Cell Biolabs | che è stata trasfettata con proteina fluorescente verde. |
| Coniche Assortite | Termo-Scientifiche | 15mL: 12-565-268 | 50/15 ml Coniche in plastica per la conservazione di soluzioni e aliquote. |
| Rotatori per mini-provette (miscelatore end over end) | Fisher Scientific | 05-450-127 | Utilizzato per incubare anticorpi e miscelare altre soluzioni cellulari al fine di miscelare |
| Axiovert 200M (microscopio a fluorescenza) | Zeiss | N/A Microscopio | a florescenza invertita Zeiss Axiovert 200 M. |
| Colonne di desalinizzazione Zeba | Thermo-Scientific | PI-87770 | Utilizzate per purificare gli anticorpi appena biotinilati dopo l'uso del Kit di Biotinilazione. Istruzioni fornite su: |
| http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf EZ Link Sulfo NHS Kit di biotinilazione a basso peso | Termo-Scientifico | Utilizzato per biotinilare gli anticorpi per consentirne l'integrazione con la superficie di cattura | |
| Lettore di piastre | BioTek | Synergy HTX Lettore multimodale | Utilizzato per misurare quantitativamente l'intensità della fluorescenza negli esperimenti di titolazione. |
Riferimenti
- Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
- De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W.
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Ristampe e permessi
