Articolo metodologico

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

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DOI:

10.3791/54343

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8 agosto 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In questo articolo

Sommario

Tre calore metodi di precipitazione sono presentati che rimuove efficacemente oltre il 90% delle proteine ​​della cellula ospite (HCP) da tabacco estrae prima di qualsiasi altra fase di purificazione. L'impianto di operatori sanitari in modo irreversibile aggregare a temperature superiori a 60 ° C.

Abstract

Le piante non solo forniscono alimenti, mangimi e materie prime per l'uomo, ma sono stati sviluppati come un sistema di produzione economica per le proteine ​​biofarmaceutiche, come gli anticorpi, vaccini candidati ed enzimi. Questi devono essere purificati dalla biomassa vegetale, ma passaggi di cromatografia sono ostacolati dalle alte concentrazioni di proteine ​​della cellula ospite (operatori sanitari) in estratti di piante. Tuttavia, la maggior parte HCPs irreversibilmente aggregano a temperature superiori a 60 ° C agevolare successiva purificazione della proteina bersaglio. Qui, tre metodi vengono presentati per ottenere la precipitazione di calore degli operatori sanitari del tabacco in foglie sia intatte o estratti. Il pallore di foglie intatte può essere facilmente incorporato in processi esistenti, ma può avere un impatto negativo sulle successive fasi di filtrazione. L'opposto è vero per la precipitazione di calore di estratti di foglie in un recipiente agitato, che può migliorare le prestazioni delle operazioni a valle anche se con grandi cambiamenti nella progettazione apparecchiature di processo, qualiGeometria omogeneizzatore. Infine, una configurazione scambiatore di calore è ben caratterizzato in termini di condizioni di trasferimento di calore e facile in scala, ma pulizia può essere difficile e potrebbe esserci un impatto negativo sulla capacità del filtro. L'approccio progettuale-di-esperimenti può essere utilizzato per identificare i parametri di processo più importanti che influenzano la rimozione HCP e recupero del prodotto. Questo facilita l'applicazione di ciascun metodo in altre piattaforme di espressione e l'identificazione del metodo più adatto per una data strategia di purificazione.

Introduzione

I moderni sistemi di assistenza sanitaria dipendono sempre più sulle proteine ​​biofarmaceutiche 1. Produrre queste proteine ​​nelle piante è vantaggioso a causa del basso carico patogeno e maggiore scalabilità rispetto ai sistemi di espressione convenzionali 2-4. Tuttavia, la lavorazione a valle (DSP) di farmaci di origine vegetale può essere difficile perché le procedure di estrazione dirompenti si traducono in un onere elevato di particelle, con torbidità superiore a 5.000 unità nefelometrica torbidità (NTU), e di proteine ​​della cellula ospite (HCP) concentrazioni spesso superiore a 95 % [m / m] 5,6.

Procedure di chiarificazione elaborati sono tenuti a rimuovere particelle disperse 7-9, ma l'apparecchiatura cromatografia è meno costoso per operare in modalità bind-and-eluire durante il recupero iniziale del prodotto se c'è un passaggio precedente per la rimozione efficiente degli operatori sanitari 10,11. Ciò può essere ottenuto sia da precipitare la proteina bersaglio utilizzando flocculformiche 12 o basso pH 13,14, così come provocando la operatori sanitari di aggregare. L'aggregazione selettiva di ribulosio-1,5-bisfosfato carbossilasi / ossigenasi (Rubisco), l'operatore sanitario più abbondante nelle piante verdi come il tabacco (Nicotiana tabacum), può essere promossa aggiungendo polietilene glicole 15, ma questo è costoso e incompatibile con grande la produzione -scale. Il trattamento termico è stato dimostrato per denaturare e precipitare più del 95% degli operatori sanitari tabacco, mentre vaccini candidati proteina malaria come Vax8 rimangono stabili in soluzione 16-18.

Tre diversi approcci sono stati usati per ottenere la precipitazione indotta dal calore degli operatori sanitari tabacco: (i) la scottatura, cioè, l'immersione delle foglie intatte in liquido caldo, (ii) una temperatura controllata agitata nave, e (iii) uno scambiatore di calore ( Figura 1) 16. Per foglie intatte, scottatura raggiunto la precipitazione rapida ed efficace degli operatori sanitari ed era anche facilea scalare e compatibile con i processi di produzione su larga scala esistenti che includono un primo passo per lavare la biomassa vegetale 19. Al contrario, navi temperatura controllata sono già disponibili in alcuni processi e possono essere utilizzati per il trattamento termico di estratti vegetali 20, ma la loro scalabilità e velocità di trasferimento di energia è limitato perché il rapporto superficie-volume dei serbatoi è progressivamente ridotta e diventa inadatto a scala processo. Uno scambiatore di calore è un'alternativa tecnicamente ben definito per riscaldata navi agitate ma richiede un abbondante approvvigionamento di riscaldamento e mezzi di raffreddamento, ad esempio, vapore e acqua fredda, nonché una portata volumetrica strettamente controllato atto a geometria scambiatore di calore e proprietà dei media, ad esempio., la capacità termica specifica. Questo articolo mostra come tutti i tre metodi possono essere usati per la precipitazione indotta dal calore degli operatori sanitari tabacco e HCPs vegetali in genere. L'istituzione e il funzionamento di EACMetodo h in un ambiente di laboratorio può essere utilizzato per valutare la loro idoneità per processi su larga scala. La sfida principale è quello di individuare modelli in scala-down adeguati e condizioni di funzionamento per ogni operazione che assomigliano i dispositivi e le condizioni utilizzate durante la produzione processo di scala. I dati qui presentati si riferiscono ad esperimenti condotti con piante di tabacco transgeniche che esprimono la malaria candidato vaccino Vax8 e proteina fluorescente DsRed 16, ma il metodo è stato applicato con successo anche a N. piante benthamiana esprimere transitoriamente altre proteine ​​biofarmaceutiche 21.

Un design-di-esperimenti (DOE) si avvicinano 22 può facilitare lo sviluppo di processo, e flocculanti 23 può anche essere utile in questo contesto, come descritto in precedenza 8. La differenza principale tra la scottatura, serbatoi riscaldati e scambiatori di calore è che sbiancamento viene applicata alle foglie intatte nelle prime fasi del processo mentre l'otlei sono applicati a estratti vegetali (Figura 1).

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Figura 1:. Processo Schema di flusso che illustra la realizzazione di tre diversi metodi per il tabacco HCP calore Precipitazioni Il materiale vegetale è lavato ed omogeneizzato prima chiarificazione e purificazione. L'attrezzatura per il passo scottatura (rosso) può essere facilmente aggiunto al macchinario esistente. Al contrario, utilizzando un recipiente agitato (arancione) e, soprattutto, uno scambiatore di calore (blu) richiede uno o più dispositivi e tubi aggiuntivi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Protocollo

1. Coltivare le piante di tabacco

  1. Lavare ogni blocco lana minerale con 1 a 2 L di acqua deionizzata e quindi con 1 L di 0,1% [w / v] Soluzione di concime. Mettere un seme di tabacco in ogni blocco lana minerale e delicatamente a filo con 0,25 L di soluzione fertilizzante senza lavare via il seme 16.
  2. Coltivare le piante di tabacco per 7 settimane in una serra con il 70% di umidità relativa, 16 hr fotoperiodo (180 mmol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) e un regime di temperatura 25/22 ° C luce / buio.
  3. Raccolto tutte le foglie, tranne le quattro foglie cotiledone, che si trovano alla base del fusto della pianta.

2. Opzionale: Heat precipitazione con Blanching

NOTA: Eseguire le operazioni descritte nei passaggi 2,1-2,12 allo scopo di precipitare operatori sanitari di tabacco da scottatura. Salta l'intera sezione 2, se saranno precipitati gli operatori sanitariin un recipiente riscaldato (sezione 4) o utilizzando uno scambiatore di calore (sezione 5).

  1. Mettere da parte 50 g di materiale vegetale ed effettuare l'estrazione senza scottatura (sezione 3). Prelevare un campione di questo estratto come controllo interno durante la successiva analisi (sezione 7).
  2. Impostare un bagno di 8-L volume di lavoro di acqua, ad esempio, 50 x 40 x 40 cm, in un secchio polistirolo espanso termicamente isolato o simili. Montare il termostato regolabile in bagno d'acqua per il controllo della temperatura successiva (passo 2,7).
  3. Trasferire l'intero gruppo su un piatto ancoretta magnetica e mettere un ancoretta magnetica nel bagno d'acqua. Assicurarsi che il campo magnetico è abbastanza forte per ruotare l'ancoretta.
  4. Circondano la ancoretta con almeno quattro mattonelle di supporto su cui un cestello in polipropilene (passo 2,6) sarà posto in seguito durante la procedura di sbiancamento. Assicurarsi che le piastrelle di supporto sono realizzati in un materiale non magnetico (per esempio, lega di acciaio inossidabile contenente nichel) e chesono superiori alla ancoretta (Figura 2).
  5. Aggiungere 8 L di acqua deionizzata per bagnomaria.
    NOTA:. Utilizzando un buffer, per esempio, 50 mM sodio fosfato (pH 7,5), in grado di migliorare le rese di proteine ​​bersaglio, se basse precipitazioni pH è un problema.
  6. Inserire un cesto cm polipropilene 23 x 23 x 23 sulle piastrelle di supporto e assicurarsi che il cestello non interferisce con la rotazione ancoretta e che sia completamente immerso nel liquido. Se necessario, aggiungere altra acqua / buffer fino a quando il cestello è completamente sommerso, quindi rimuovere di nuovo il canestro.
    ATTENZIONE: Tutte le successive fasi fino a 2.12 comportano la manipolazione di liquido caldo. Indossare dispositivi di protezione adeguati compresi i guanti isolati termicamente.
  7. Utilizzare il termostato regolabile per portare bagnomaria a 70 ° C (o la temperatura desiderata per gli esperimenti). Attendere almeno 15 minuti dopo la temperatura desiderata viene raggiunta per garantire l'intero complesso ha raggiunto un thermal equilibrio.
  8. Preparare 150 g aliquote dalle foglie di tabacco raccolte. Mettere un'aliquota nel cestello evitando compressione irreversibile e danni alle foglie, ad esempio, per strappo. Evitare di riempire eccessivamente il cesto con materiale vegetale o densità della quest'ultima.
  9. Con attenzione ma subito immergere il cestello nel liquido caldo e posizionarlo sulle piastrelle di supporto. Posizionare un blocco di acciaio inox sulla parte superiore del cestello per prevenire il galleggiamento.
  10. Incubare le foglie per 5 minuti nel fluido scottatura, o selezionare un tempo atto a soddisfare il disegno sperimentale. Monitorare la temperatura del liquido durante l'intero periodo di incubazione.
  11. Rimuovere con cautela il cestello dal fluido sbiancamento e far scarico liquido residuo dalle foglie per 30 sec. Poi prendere la pianta lascia fuori del paniere, trasferirli al frullatore e iniziare subito l'estrazione (sezione 3).
    NOTA: Le piante possono essere conservati per lunghi periodi di tempo dopo imbianchimento e prima dell'inizio di the di estrazione, ad esempio, più di 30 min in ghiaccio o congelati a -20 ° C per diverse settimane è stato testato con successo. Tuttavia, la stabilità del prodotto può diminuire con l'aumentare i tempi di conservazione e, quindi, si raccomanda l'elaborazione immediata.
  12. Ripetere i passaggi 2,8-2,11 con materiale di foglia fresca fino a quando l'intera biomassa raccolta viene elaborato.

3. Proteine ​​estrazione dalle foglie di tabacco

ATTENZIONE: I prossimi passi coinvolgere un frullatore con lame rotanti. Non lavorare nel secchio frullatore mentre è montato sul motore frullatore.

  1. Mettere 150 g (massa umida) di raccolta (passo 1.3) o scottati (passo 2.11) lascia nel frullatore e aggiungere 450 ml di tampone di estrazione (50 mm sodio fosfato, 500 mm di cloruro di sodio, 10 mM di sodio disolfito, pH 8,0).
    NOTA: La composizione tampone di estrazione dipende proteina da estrarre e può quindi richiedere una regolazione, ad esempio, l'uso di un altro pH o buffer componente quale Trè.
  2. Omogeneizzare le foglie per 3 x 30 impulsi sec con 30 secondi intervallati pause. Assicurarsi che le foglie sono omogeneizzati e non intasare il secchio frullatore. Fermare il frullatore e sollevare le foglie per evitare intasamenti, se necessario, e poi continuare l'omogeneizzazione.
  3. Prelevare un campione 1 ml di ciascun estratto che viene prodotto per la successiva analisi (sezione 7). Se il materiale vegetale s'imbianca, procedere alla sezione 6. Altrimenti continuare con precipitazione di calore in un recipiente (sezione 4) o scambiatore di calore (sezione 5), a seconda del metodo sperimentale selezionato.

4. Opzionale: Temperatura Precipitazione in un vaso mescolato

NOTA: Il comportamento delle operazioni descritte nei capitoli da 4.2 a 4.11, al fine di precipitare operatori sanitari del tabacco in un recipiente agitato. Salta l'intera sezione 4, se gli operatori sanitari sono stati precipitati da scottatura (sezione 2) o sarà precipitato utilizzando uno scambiatore di calore (sezione 5).

  1. Impostare due 8-L acqua volume di lavoroterme, ad esempio, 50 x 40 x 40 cm, in polistirolo isolato termicamente o simile. Nel primo bagno, montare il termostato regolabile per il controllo della temperatura successiva (passo 4.6). Nel secondo, aggiungere 5 L di acqua deionizzata e 2 kg di ghiaccio per raffreddamento successivo (passo 4.9).
  2. Trasferire il primo bagno di acqua su una piastra di agitazione magnetica, e posizionare il recipiente in acciaio inox 2-L nel bagno d'acqua tale che il centro del serbatoio è allineato al centro della piastra di agitazione.
  3. Posizionare un ancoretta magnetica nel recipiente di acciaio inox. Assicurarsi che il campo magnetico è abbastanza forte per ruotare l'ancoretta.
  4. Riempire la vasca con acqua deionizzata per 5 cm sotto il bordo superiore del contenitore in acciaio inossidabile. Poi riempire il vaso con tampone di estrazione. Mettere un coperchio polistirene espanso sulla nave.
    ATTENZIONE: Tutte le successive fasi fino a 4,9 comportano la manipolazione di liquido caldo. Indossare dispositivi di protezione adeguati tra cui ins termicamenteGuanti ulated.
  5. Inserire un termometro nel recipiente di acciaio inossidabile attraverso un foro adattandosi nel coperchio polistirolo espanso. Impostare la temperatura del bagno di acqua a 78 ° C e incubare l'intero gruppo per 15 minuti per raggiungere l'equilibrio termico. Assicurarsi che la temperatura nel serbatoio è di 70 ° C, circa 8 ° C inferiore alla soglia del bagnomaria.
  6. Se la temperatura nel recipiente di acciaio inossidabile differisce da 70 ° C, regolare la temperatura del bagno di acqua di conseguenza e lasciare che il sistema stabilizzi per altri 15 min. Ripetere questo passaggio finché la temperatura nel serbatoio è di 70 ° C o come richiesto per l'esperimento, e svuotare il contenitore in acciaio inossidabile.
  7. Versare 300 ml di estratto (passo 3.2) nel recipiente di acciaio inossidabile, mentre è ancora in bagnomaria e avviare un timer. Mescolare l'estratto a 150 rpm ed incubare per 5 min. Assicurarsi che l'estratto raggiunge una temperatura di 70 ° C per almeno 2 min durante questo periodo di incubazione.
  8. Rimuovere il bagno di acqua calda dal agitatore magnetico, estrarre il contenitore in acciaio inox e metterlo nel secchio di ghiaccio freddo. Posizionare quest'ultimo sul agitatore magnetico e rimuovere il coperchio polistirolo espanso.
  9. Assicurarsi che l'omogeneizzato pianta è ben agitata a 150 rpm, posizionare il termometro nell'estratto e incubare fino a raggiungere una temperatura di 20 ° C oppure la temperatura specificata dal disegno sperimentale.
  10. Ripetere i passaggi 4,7-4,9 per tutte le aliquote. Prelevare un campione 1 ml di ciascuna calore precipitato estratto una volta raggiunta la temperatura finale, quindi procedere con la sezione 6.

5. Opzionale: precipitazioni di calore in uno scambiatore di calore

NOTA: Il comportamento delle operazioni descritte nei capitoli 5.2 a 5.12 allo scopo di precipitare operatori sanitari tabacco utilizzando uno scambiatore di calore. Salta l'intera sezione 5, se gli operatori sanitari sono stati precipitati da scottatura (sezione 2) o in un recipiente riscaldato (sezione 4).

  1. Impostare due volumi di lavoro 8-Lbagni di acqua, ad esempio, 50 x 40 x 40 cm, in secchi in schiuma di polistirene termicamente isolati o simili. Nel primo bagno, montare il termostato regolabile per il controllo della temperatura successiva (passo 5.3). Nel secondo, aggiungere 5 L di acqua deionizzata e 2 kg di ghiaccio per raffreddamento successivo (passo 5.10).
    ATTENZIONE: Tutte le successive fasi fino a 5,9 comportano la manipolazione di liquido caldo. Indossare dispositivi di protezione adeguati compresi i guanti isolati termicamente.
  2. Riempire il primo bagno d'acqua con 8 L acqua deionizzata. Impostare la temperatura di 74,5 ° C mediante il termostato. Incubare il gruppo per 15 minuti per raggiungere l'equilibrio termico.
  3. Preparare un serbatoio di stoccaggio isolata mettendo un bicchiere di plastica da 0,5 L in un bicchiere di plastica 1-L e colmare le lacune con cotone idrofilo. In alternativa, utilizzare un contenitore isolato termicamente dedicato con un volume di lavoro di 0,5-L.
  4. Collegare lo scambiatore di calore alla pompa peristaltica ad una estremità e ad un tubo di scarico sul otheR finire con L / S 24 tubi. Inserire entrambe tubo termina con un termometro nel recipiente di accumulo coibentato e riempirlo con 300 ml di tampone di estrazione (figura 2).
  5. Posizionare lo scambiatore di calore nel bagno di acqua calda e avvia la pompa peristaltica ad una velocità di 300 ml min -1. Assicurarsi che la temperatura risultante nel recipiente è di 70 ° C, circa 4,5 ° C al di sotto del set point del bagno d'acqua, dopo 3 min.
  6. Se la temperatura nel recipiente-isolata differisce da 70 ° C, regolare la temperatura del bagno di acqua di conseguenza e lasciare che il sistema stabilizzi per altri 15 min. Ripetere questo passaggio finché la temperatura del tampone di estrazione aumenta da ambiente a 70 ° C in meno di 3 minuti, o pari a quella necessaria per l'esperimento, e svuotare il recipiente di acciaio inossidabile.
  7. Scartare il tampone di estrazione dalla nave isolata e preparare aliquote di 300 ml di estratto vegetale. Riempire il serbatoio coibentato con un'aliquota.
  8. Pompa l'estratto vegetale (punto 3.3) attraverso lo scambiatore di calore a 300 ml min -1 per 5 min. Assicurarsi che la temperatura estratto è 70 ° C dopo 3 min, o uguale alla temperatura definita nel disegno sperimentale.
  9. Dopo 5 min, posizionare lo scambiatore di calore in bagno d'acqua ghiacciata mentre l'estratto è ancora pompato. Incubare in questa impostazione finché la temperatura raggiunge esattamente 20 ° C, o la temperatura definita nel disegno sperimentale.
  10. Rimuovere il tubo di aspirazione collegato alla pompa peristaltica dal recipiente isolato e continuare a pompare a raccogliere estratto residuo impianto termico precipitato all'interno dello scambiatore di calore. Poi fermare la pompa.
  11. Ripetere i passaggi 5,7-5,10 per tutte le aliquote. Prelevare un campione da 1 ml di ciascun estratto calore precipitato una volta raggiunta la temperatura finale, quindi passare sugli estratti per filtrazione a sacco (punto 6).
    NOTA: Dopo un primo ciclo passaggi attraverso 5.7 a 5.10 non ci sarà alcun tampone di estrazione pergettare nella fase 5.7.

6. Borsa filtrazione della Estratto di piante

  1. Montare un filtro a sacco nel cesto di supporto corrispondente che viene inserito nel corpo del filtro e fornisce supporto meccanico per il materiale filtrante flessibile. Collocare un recipiente 1-L sotto il canestro e applicare le aliquote estratto (sezione 3.3, 4.10 o 5.11 a seconda del trattamento termico selezionato) al sacchetto ad una velocità di 150 ml min -1.
  2. Dopo filtrazione, misurare la torbidità di una diluizione 1:10 del filtrato in tampone di estrazione usando il torbidimetro.
  3. Prelevare un campione 1 ml ed elaborare il filtrato sacchetto come definito nel disegno sperimentale, ad esempio, filtrazione di profondità e cromatografia 7,10.

Analisi 7. Campione

  1. Misurare la quantità di proteine ​​totali solubili (TSP) utilizzando il metodo Bradford 24,25.
    1. In triplice copia, pipettare 2,5 ml di ogni campione nei singoli pozzetti di unapiastra a 96 pozzetti. Include otto albumina sierica bovina (BSA) norme in triplice copia che coprono la gamma di 0 - 2.000 mcg ml -1.
    2. Aggiungere 200 ml di reagente di Bradford in ogni pozzetto e mescolare accuratamente pipettando su e giù, ma abbastanza delicatamente per evitare la formazione di bolle.
    3. Incubare per 10 minuti a 22 ° C e misurare l'assorbanza a 595 nm in uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione TSP nei campioni sulla base di una curva standard per i punti di riferimento BSA.
  2. Quantificare Vax8 dalla risonanza plasmonica di superficie spettroscopia 26.
    1. Setup strumento risonanza plasmonica superficiale con 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) tampone di corsa (10 mM HEPES, 3 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 1,500 mM cloruro di sodio, 0,05% v / v polisorbato 20, pH 7,4) e montare un chip di superficie destrano carbossimetilato nel dispositivo. Utilizzare la funzione primaria per lavare il sistema e avviare un ciclo manuale con una portata di 30min -1 microlitri su celle di flusso 1 e 2. Iniettare 30 mM cloruro di idrogeno due volte per 60 secondi con 60 secondi di iniezione intervallati di idrossido di sodio 25 mM.
    2. Preparare 200 ml di una 500 mcg ml -1 mAb 5,2 soluzione in acetato di sodio 10 mM (pH 4,0). Scongelare-etil-1 3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide cloridrato (EDC) e flaconi N -hydroxysuccinimide (NHS) e centrifugare a 16.000 xg per 1 min. Mescolare 70 ml di EDC con 70 ml di NHS e trasferire in una fiala di plastica da 7 mm.
    3. Attivare la superficie del chip superficie destrano carbossimetilata iniettando la miscela EDC / NHS sulle celle di flusso 1 e 2 per 10 minuti con una portata di 10 min microlitri -1.
    4. Impostare il percorso di flusso di fluire cella 2 soltanto. Coppia mAb 5.2 iniettando per 15 minuti ad una velocità di 10 ml min -1.
    5. Passare il percorso di flusso di fluire celle 1 e 2 e iniettare etanolammina per 7 minuti ad una velocità di 5 ml min -1 per disattivare la superficie. Tgallina iniettare acido cloridrico 30 mM due volte per 60 secondi con 60 secondi di iniezione intervallati di 25 mM sodio idrossido.
    6. Iniettare i campioni e MSP1 - 19 standard ad una velocità di 30 ml min -1 per 180 sec. Assicurarsi che la concentrazione Vax8 è 50 - 1000 ng ml -1. Preparare pre-diluizioni in soluzione salina tamponata HEPES contenente EDTA e polisorbato 20 (HBSEP) se necessario.
    7. Sottrarre il segnale di picco della cella di flusso 1 da quello della cella di flusso 2 e utilizzare la differenza per calcolare la concentrazione Vax8 in campioni sulla base del segnale del MSP 1 - iniezione 19 con una concentrazione di proteina nota di 500 ng ml -1.
    8. Rigenerare la superficie del chip dopo ogni campione o MSP 1 - 19 iniezione dall'esposizione a 30 mM di cloruro di idrogeno per 60 sec ad una portata di 30 ml min -1.
  3. Quantificare DsRed mediante spettrometria a fluorescenza
    1. In triplice copia, pipette 50 ml di ogni campione nelle singole pozzetti di una nera semi-arEA piastra a 96 pozzetti. Include sei standard DsRed che coprono la gamma 0 - 225 mcg ml -1.
    2. Misurare la fluorescenza in duplicato utilizzando un 530 ± 30 nm filtro di eccitazione ed un filtro di emissione 590 ± 35 nm in uno spettrofotometro. Calcolare la concentrazione DsRed nei campioni sulla base di una curva standard attraverso i punti di riferimento DsRed.
  4. Determinazione delle distribuzioni di dimensione delle particelle
    1. Lavare una cuvetta con 1 ml di isopropanolo e poi con 2 ml di acqua deionizzata per rimuovere le particelle di polvere. Pipettare 850 ml di campione nella cuvetta.
    2. Posizionare la cuvetta del potenziale e delle particelle analizzatore di dimensione zeta. Aprire il "Software" e iniziare una misurazione manuale con "proteine", come il materiale e "PBS" come il disperdente. Selezionare una temperatura di 25 ° C e un tempo di equilibrazione di 180 sec.
    3. Scegliere la cella "DTS0012" e misurare in 173 ° backscatter. Controllare il funct "auto"ione per la durata della misura e selezionare tre misurazioni senza ritardo intervallati.
    4. Analizzare la granulometria profilo di distribuzione picco volta completata la misurazione selezionando le tre misure del campione nella vista esperimento. Scegliere la scheda "Volume PSD".

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Risultati

La precipitazione di calore delle proteine ​​della cellula ospite tabacco da scottatura
La procedura di sbiancamento descritto nella sezione 2. è stato utilizzato con successo per far precipitare operatori sanitari da foglie di tabacco con 70 ° C, la riduzione del TSP del 96 ± 1% (n = 3), mentre il recupero fino al 51% della proteina bersaglio Vax8, aumentando così la sua purezza dal 0,1% al 1,2% prima della separazione cromatografica 16. Era anche possibile re...

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Discussione

I tre metodi per la precipitazione di calore sopra descritti possono rimuovere efficacemente operatori sanitari tabacco prima di ogni fase di purificazione cromatografica 16,17. Esse completano altre strategie che mirano ad aumentare la purezza iniziale del prodotto, ad esempio, guttazione 29, rhizosecretion 30 o centrifuga estrazione 31,32, che sono tutti limitati alle proteine ​​secrete. Tuttavia, i metodi di calore a base possono essere usati solo in modo significa...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes e Veronique Beiß per aver fornito i semi di tabacco transgenico e Ibrahim Al Amedi per aver coltivato le piante di tabacco. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Richard M. Twyman per l'assistenza editoriale e Güven Edgü per aver fornito il riferimento MSP1-19. Questo lavoro è stato finanziato in parte dall'European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', proposta numero 269110, dalla Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) e dai programmi interni Fraunhofer-Gesellschaft nell'ambito della sovvenzione n. Attira 125-600164.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Torbidimetro portatile 2100PHach4650000Kit
di accoppiamento per amminaGE HealthcareBR100050 Kit di accoppiamento truciolo SPR
Cestello per autoclaveNalgene6917-0230Cestello per scottatura delle foglie
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01Dispositivo SPR
Analizzatore di Bio Cellule BCA 003 R& D con 3D ORMSequipn.a.Analizzatoregranulometrico
BlenderWaring800EGBlender
BP-410Furh2632410001Filtro a maniche
Centrifuga 5415DEppendorf5424 000.410Centrifuga
Provetta da centrifuga 15 mlLabomedic2017106Provetta di reazione
Provetta da centrifuga 50 ml autoportanteLabomedic1110504Tubo di reazione
CM5 chipGE HealthcareBR100012 Chip per misure SPR
Cuvetta 10 x 10 x 45Sarsted67.754Cuvetta per Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.SoftwareDoE
Fosfato disodicoCarl Roth GmbH 4984,3 Componente multimediale
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Fertilizzante
Forma -86C ULT congelatoreThermoFisher88400
CongelatoreSerra n.a.n.a.Perla coltivazione di piante
Grodan Rockwool Cubi 10 x 10 cmGrodan102446Rockwool block
Scambiatore di calore a due circuiti (4,8 m di lunghezza)n.a. (design personalizzato)n.a.Calore scambiatore
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Componente multimediale
K200P 60DPall5302303Strato filtrante di profondità
KS50P 60DPallB12486Strato filtrante di profondità
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Termostato bagnomaria
L/S 24MasterflexSN-06508-24Tubo
mAb 5.2Tipo americano Collezione di coltureHB-9148Vax8 anticorpo specifico
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Pompa peristaltica
MiraclothLabomedic475855-1RTessuto filtrante
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pHmetro / conduttimetro
Osram bianco freddo 36 WOsram4930440Sorgente luminosa
PhytotronIlka Zelln.a.Percoltivazione di piante
Disolfito di sodioCarl Roth GmbH8554.1Componente del supporto
Cloruro di sodioCarl Roth GmbHP029.2Componente del supporto
Recipiente in acciaio inossidabile; 0,7 kg 2,0 L; altezza 180 mm; diametro 120 mmn.a. (design personalizzato)n.a.Contenitoreper la precipitazione del calore
Synergy HTBioTekSIAFRTLettore di piastre a fluorescenza e spettrometria
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Alloggiamento del filtro
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS Misurazione della distribuzione granulometrica
Zetasizer Software v7.11Malvernn.a.Softwareper il funzionamento del dispositivo Zetasizer Nano ZS
del torbidimetro la

Riferimenti

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