L'obiettivo di questo protocollo è mostrare il protocollo per la riprogrammazione dei linfociti infiltranti il tumore del melanoma in cellule staminali pluripotenti indotte.
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Articolo metodologico
Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il tumore
In questo articolo
Sommario
Abstract
Trasferimento adottivo di ex vivo ampliato linfociti tumore-infiltranti autologhe (TIL) possono mediare le risposte durature e completi in sottogruppi significativi di pazienti con melanoma metastatico. I principali ostacoli di questo approccio sono la ridotta vitalità delle cellule T trasferiti, causate da accorciamento dei telomeri, e il numero limitato di TIL ottenuti da pazienti. Le cellule T Meno dissociati con telomeri lunghi sarebbe un sottoinsieme di cellule T ideale per la terapia delle cellule T adottiva, tuttavia, generando un gran numero di queste cellule T meno dissociati è problematico. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superata dalle cellule utilizzando indotte pluripotenti staminali (iPSCs) che l'auto-rinnovarsi, mantenere i telomeri pluripotenza, si sono allungati, e di fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Qui, vi presentiamo un protocollo per generare iPSCs utilizzando vettori di virus Sendai per la trasduzione di fattori di riprogrammazione in TIL. Questo protocollo generas completamente riprogrammati, cloni libero da vettori. Questi iPSCs TIL-derivati potrebbero essere in grado di generare cellule T-paziente e tumore-specifici meno dissociati per la terapia delle cellule T adottiva.
Introduzione
La tecnologia di riprogrammazione cellulare che permette la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante la sovraespressione di un insieme definito di fattori di trascrizione promette grandi sviluppi nel campo delle terapie a base di cellule 1,2. Queste iPSCs presentano caratteristiche trascrizionali ed epigenetici e hanno la capacità di auto-rinnovamento e pluripotenza, analogamente alle cellule staminali embrionali (ESC) 3-5. Notevoli progressi realizzati nella tecnologia di riprogrammazione negli ultimi dieci anni ci ha permesso di generare iPSCs umani anche da cellule terminalmente differenziate, come le cellule T <....
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Protocollo
NOTA: I pazienti devono dare il consenso informato a partecipare al Institutional Review Board e pluripotenti umane staminali Comitato cellulare ha approvato lo studio.
1. Isolamento e la coltura di TIL
- Ottenere materiale tumorale che non è necessario per la diagnosi istopatologica dal nucleo di appalto del servizio di patologia / tessuto. Posizionare 20-100 g di campioni tumorali in una provetta da 50 ml con 30 ml supporti tumorali raccolta (Tabella 1).
- Sezionare solido, fermo, tessuto normale del campione di tumore da aree necrotiche fragili e / o con sangue con le forbici. Dopo aver rimosso il tess....
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Risultati
La Figura 1 mostra la descrizione della procedura che coinvolge l'espansione iniziale del melanoma TIL con rhIL-2, che è seguita da attivazione con anti-CD3 / CD28 e trasferimento genico Oct3 / 4, Klf4, SOX2, e c-MYC per TIL per la generazione di iPSCs. Di solito, TIL sulla cultura con rhIL-2 cominciano a formarsi le sfere 21-28 giorni dopo l'inizio della cultura. A questo punto, TIL sono pronti per essere attivato con anti-CD3 / CD28. La figura 2A
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Discussione
Qui, abbiamo dimostrato un protocollo per la riprogrammazione TIL melanoma a iPSCs da trasduzione SEV-mediata dei quattro fattori di trascrizione Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questo approccio, utilizzando un sistema SeV per riprogrammare cellule T, offre il vantaggio di un metodo non integrare 7.
Uno studio precedente ha mostrato che un sistema riprogrammazione SeV era altamente efficiente e affidabile per riprogrammare fibroblasti non solo, ma anche le cellule T del sangue peri.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo la signora Deborah Postiff e la signora Jackline Barikdar del Tissue Procurement Core e la dottoressa Cindy DeLong del Pluripotent Stem Cell Core Laboratory dell'Università del Michigan per la sua assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato dai finanziamenti per l'avvio dell'Università del Michigan e dalle sovvenzioni della Central Surgical Association, dell'American College of Surgeons, della Melanoma Research Alliance e del NIH/NCI (1K08CA197966-01) a F. Ito.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| delicato MACS C Tubi | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| delicato Dissociatore MACS | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Kit di dissociazione tumorale, umano | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Tecnologie di vita | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Tubi conici per cntrifugi | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| siero AB umano | technologies | 34005100 | |
| L-glutammina (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoetanolo (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillina-Streptomicina | Tecnologie di vita | 15140-122 | |
| gentamicina | Tecnologie di vita | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Tecnologie di vita | 14040-133 | |
| umano ricombinante (rh) IL-2 | Aldesleuchina, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purificato NA/LE Topo Anti-Umano CD3 | BD | 555329 | |
| Purificato NA/LE Topo Anti-Umano CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetilcisteina | Cumberland Prodotti farmaceutici Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Piastre per colture tissutali Falcon (6 pozzetti) | Piastre | 353046 | |
| Falcon (24 pozzetti) | Corning | 353047 | |
| Vettore virale Sendai | DNAVEC | ||
| SNL Cellule feeder | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomicina C | SIGMA | M4287 | solubile in acqua (0,5 mg/ml) |
| gelatina | SIGMA | G1890 | |
| fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
Riferimenti
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibrobl....
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Ristampe e permessi
