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Articolo metodologico

Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da melanoma umano Linfociti infiltranti il ​​tumore

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DOI:

10.3791/54375

⸱

11 novembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Biochemistry II, Kanazawa Medical University, 3Center for Immunotherapy, Roswell Park Cancer Institute, 4DNAVEC Corporation, 5Department of Ophthalmology, Keio University School of Medicine, 6Department of Surgical Oncology, Roswell Park Cancer Institute

In questo articolo

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare il protocollo per la riprogrammazione dei linfociti infiltranti il tumore del melanoma in cellule staminali pluripotenti indotte.

Abstract

Trasferimento adottivo di ex vivo ampliato linfociti tumore-infiltranti autologhe (TIL) possono mediare le risposte durature e completi in sottogruppi significativi di pazienti con melanoma metastatico. I principali ostacoli di questo approccio sono la ridotta vitalità delle cellule T trasferiti, causate da accorciamento dei telomeri, e il numero limitato di TIL ottenuti da pazienti. Le cellule T Meno dissociati con telomeri lunghi sarebbe un sottoinsieme di cellule T ideale per la terapia delle cellule T adottiva, tuttavia, generando un gran numero di queste cellule T meno dissociati è problematico. Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superata dalle cellule utilizzando indotte pluripotenti staminali (iPSCs) che l'auto-rinnovarsi, mantenere i telomeri pluripotenza, si sono allungati, e di fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Qui, vi presentiamo un protocollo per generare iPSCs utilizzando vettori di virus Sendai per la trasduzione di fattori di riprogrammazione in TIL. Questo protocollo generas completamente riprogrammati, cloni libero da vettori. Questi iPSCs TIL-derivati ​​potrebbero essere in grado di generare cellule T-paziente e tumore-specifici meno dissociati per la terapia delle cellule T adottiva.

Introduzione

La tecnologia di riprogrammazione cellulare che permette la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) mediante la sovraespressione di un insieme definito di fattori di trascrizione promette grandi sviluppi nel campo delle terapie a base di cellule 1,2. Queste iPSCs presentano caratteristiche trascrizionali ed epigenetici e hanno la capacità di auto-rinnovamento e pluripotenza, analogamente alle cellule staminali embrionali (ESC) 3-5. Notevoli progressi realizzati nella tecnologia di riprogrammazione negli ultimi dieci anni ci ha permesso di generare iPSCs umani anche da cellule terminalmente differenziate, come le cellule T 6-8. IPSCs derivati dalle cellule T (TiPSCs) mantengono la stessa configurazione riarrangiato di recettore delle cellule T (TCR) geni catena come le celle originali T, che permette la rigenerazione delle cellule T antigene-specifiche da TiPSCs 9-11.

Quasi l'80% dei linfociti melanoma infiltranti (TIL) ottenuto da tumore di un paziente specificamente riconoscere tumore-antigeni associati aND mantenere la citotossicità contro le cellule tumorali originali 12. In particolare, l'espressione della morte cellulare programmata proteina-1 (PD-1) sul TIL è stato trovato per identificare il repertorio tumore-reattiva autologo, compresi mutato specifico neoantigene CD8 + linfociti 13. Trasferimento adottivo di ex-vivo TIL autologhe espanse in combinazione con regimi lymphodepleting di preparazione e somministrazione sistemica di Interleuchina-2 (IL-2) può causare sostanziale regressione del melanoma metastatico in sottogruppi di pazienti 14. Nonostante gli incoraggianti risultati in modelli preclinici e nei pazienti, scarsa sopravvivenza delle cellule T infuse e l'esistenza di percorsi immunosoppressivi sembrano compromettere il pieno potenziale della terapia con cellule T adottiva. Protocolli clinici attuali richiedono ampie ex vivo manipolazione di cellule T autologhe per ottenere grandi numeri. Il risultato è la generazione di cellule terminalmente differenziate T che hanno scarsa sopravvivenza, ridotto Prolla capacità iferative, e alti livelli di PD-1 15.

Questa limitazione della terapia con cellule T adottiva può essere teoricamente superato utilizzando iPSCs che possono fornire una fonte illimitata di cellule T autologhe per l'immunoterapia. Abbiamo recentemente riportato la riprogrammazione del melanoma TIL esprimere alti livelli di PD-1 dal virus di Sendai (SeV) trasduzione mediata dei quattro fattori di trascrizione, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc 16. Mentre vettori retrovirali richiedono l'integrazione in cromosomi di accoglienza per esprimere geni riprogrammazione, vettori Sev sono non-integrazione e sono poi eliminati dal citoplasma. La riprogrammazione efficienza è molto più alto con un sistema SeV rispetto lentivirus o retrovirus vettori 6-8. Inoltre, SeV possono specificatamente riprogrammare le cellule T nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC), mentre alcuni cloni IPSC generati da lentivirus o vettori retrovirali possono essere da lignaggi nonlymphoid 6-8. Qui, abbiamo dettagliole procedure implementate per l'isolamento e l'attivazione di melanoma umano TIL e per la generazione di iPSCs TIL derivati ​​utilizzando un sistema di riprogrammazione SeV.

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Protocollo

NOTA: I pazienti devono dare il consenso informato a partecipare al Institutional Review Board e pluripotenti umane staminali Comitato cellulare ha approvato lo studio.

1. Isolamento e la coltura di TIL

  1. Ottenere materiale tumorale che non è necessario per la diagnosi istopatologica dal nucleo di appalto del servizio di patologia / tessuto. Posizionare 20-100 g di campioni tumorali in una provetta da 50 ml con 30 ml supporti tumorali raccolta (Tabella 1).
  2. Sezionare solido, fermo, tessuto normale del campione di tumore da aree necrotiche fragili e / o con sangue con le forbici. Dopo aver rimosso il tessuto necrotico, utilizzare le forbici per sminuzzare il campione più piccolo possibile.
  3. Dissociare il campione tritato in una cella singola sospensione usando un dissociatore e tumore kit di dissociazione (umana) secondo le istruzioni del produttore. Filtrare la sospensione con un colino cella di 70 micron che è impostato su un tubo da 50 ml e lavare il filtro 2 volte con2 ml di RPMI 1640.
  4. Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzi di cellule T (Tabella 1).
  5. Preparare una soluzione sfumatura a due fasi come Ficoll (soluzione gradiente) in una provetta da 50 ml, con un gradino più basso di 10 ml di soluzione di pendenza 100% ed una fase di mezzo di 30 ml di soluzione di pendenza 75% diluito con fosfati di Dulbecco salina tamponata, senza calcio, senza magnesio (D-PBS (-)).
  6. Strato di sospensione cellulare (dal punto 1.4) sulla soluzione gradiente (dal punto 1.5). Centrifugare a 400 xg a 20 ° C per 45 min.
  7. Raccogliere il livello contenente le TIL arricchite all'interfaccia tra la soluzione di pendenza 100% e la soluzione pendenza 75% in una provetta da 50 ml. Diluire il livello della soluzione con i TIL arricchiti aggiungendo 20-30 ml di D-PBS (-).
  8. Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare il surnatante e risospendere la frazione TIL arricchita in 10 mldei mezzi di comunicazione delle cellule T.
  9. Culture la frazione (dal punto 1.8) con 2 ml di mezzi di cellule T e 6.000 UI / ml ricombinante umana (rh) IL-2 in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2.
  10. Modificare la metà della media su giorno 5 dopo la cultura iniziazione e ogni 2-3 giorni successivi.
  11. Dividere le celle con un rapporto di 1: 2 senza tripsinizzazione dopo dolcemente sospensione, raddoppiando il numero di pozzetti quando raggiunge 80-90% di confluenza. Aggiungere un volume metà (1 ml) di supporto delle cellule T freschi e rhIL-2 a 6.000 UI / ml.

2. Preparazione di Mitomicina-C-trattati SNL Feeder zolla delle cellule

  1. Culture cellule feeder BN in 10 ml di SNL supporti cella alimentatore (Tabella 1) su una gelatina rivestita 10 centimetri piatto 0,1% fino al 80-90% di confluenza (3-4 x 10 6 cellule) viene raggiunto.
  2. Aggiungere 310 ml di 0,4 mg / ml soluzione mitomicina C direttamente nel piatto di coltura cellulare alimentatore BN e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 2 ore e 15 min. Aspirare il supporto di unnd lavare le cellule due volte con 5 ml di D-PBS (-).
  3. Aggiungere 0,5 ml di 0,25% tripsina / 1 mM EDTA e incubare a temperatura ambiente per 1 min per dissociare le cellule. Aggiungere 4,5 ml di mezzi di cellule di alimentazione SNL per neutralizzare e risospendere le cellule in una sospensione singola.
  4. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml e centrifugare a 200 xg per 5 min. Aspirare media e contare le cellule con un emocitometro dopo la ri-sospensione in 10 ml di SNL mezzi cellule alimentatore.
  5. Piatto 1,5 x 10 6 cellule per pozzetto di cellule feeder SNL su un piatto 10 cm e incubare a 37 ° C, 5% CO 2. Utilizzare le cellule di alimentazione SNL entro 3 giorni.

3. Generazione di iPSCs Uso del virus di Sendai (SeV) Vector

  1. Raccogliere il TIL (dal punto 1.11) e attivare 5 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastriforme vincolato CD3 anti-umano (1 ug / ml) e mouse solubile CD28 anti-umano (5 mg / ml), con rhIL-2 (6.000 UI / ml) in 2 ml di mezzi di cellule T in una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 5 giorni.
  2. Raccogliere il TIL (dal punto 3.1) in un tubo da 15 ml con una pipetta e contare il numero di cellule con un emocitometro.
  3. Riattivare 1 x 10 5 cellule TIL con il mouse piastra-bound CD3 anti-umano (1 ug / ml) e topo solubile anti-human CD28 (5 mg / ml), con rhIL-2 (60 UI / ml) in 500 microlitri di mezzi di riprogrammazione (Tabella 1) per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Preparare 3 pozzi per l'infezione SeV: Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc (1 bene); infezione SeV (GFP: proteina fluorescente verde) (1 bene); e conta delle cellule (1 bene).
  4. Dopo 24 ore (dal punto 3.3), contare il numero di cellule con un emocitometro e determinare il volume di ogni virus per diversi (3-20) molteplicità di infezione (MOI). Rimuovere una serie di tubi vettore virus Sendai dal -80 ° C di stoccaggio. Scongelare i vettori Sev rapidamente in un bagno d'acqua (37 ° C) e disporli sul ghiaccio.
    Volume del virus (ml)= MOI (CIU / cella) x numero di cellule / titolo del virus (CIU / ml) × 10-3 (ml / ml)
  5. Aggiungere i volumi calcolati di ciascuno dei quattro tubi vettore virus Sendai che portavano singolarmente Oct3 / 4, SOX2, Klf4, e c-MYC aggiungendo una miscela di vettori SEV al 10-20 MOI in media, compresa attivato TIL.
  6. Per determinare l'efficienza di trasduzione, aggiungere i volumi calcolati di SEV-GFP in un pozzo di TIL attivati.
  7. Collocare la capsula (dal punto 3.5 e punto 3.6) in incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 per 24 ore. Dopo 24 ore, valutare l'efficienza di infezione con TIL infettati con SEV-GFP in microscopia a fluorescenza.
  8. Raccogliere le cellule (dal punto 3.5) in un tubo da 15 ml. Centrifugare a 200 xg a temperatura ambiente per 5 min.
  9. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di mezzi hESC con Primate ES cellulare medio e il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml).
  10. Trasferire la sospensione in un 10 centimetri piatto che CONTAins mitomicina-C-trattata cellule di alimentazione SNL in 10 ml di hESC supporti. Modificare i media hESC a giorni alterni fino a quando le colonie sono cresciuti.
  11. Intorno al giorno 18 al 21, rimuovere le cellule di alimentazione SNL intorno alle colonie sotto un microscopio con una punta di 10-microlitri nel banco pulito.
  12. Raschiare le colonie con una punta di 10-microlitri e trasferirli con una punta di 200 microlitri in 100 ml di iPSCs mezzi per pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Pipettare su e giù a 2-3 volte di rompere le colonie in piccoli grumi con una dimensione media di 50-100 micron.
  13. Trasferire i piccoli ciuffi in 6 pozzetti piastre di coltura dei tessuti con cellule di alimentazione SNL mitomicina-C-trattati (dal passaggio 2) in 2 ml per pozzetto di iPSCs supporti con il fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF, 4 ng / ml). Cambiare i media iPSCs ogni giorno.
  14. Trasferire le iPSCs a 6 pozzetti di coltura tissutale con cellule feeder BN mitomicina-C-trattati fresche con 1 mg / ml di collagenasi IV ogni 5-6 giorni. Preparare 2 pozzi per piatti di ogni clone per immunostaining.
  15. Determinare la completa riprogrammazione di ogni clone dalla colorazione immunoistochimica di marcatori pluripotenza (SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, TRA-1-81, e Oct3 / 4) 1.
    NOTA: Per ulteriori valutazione del potenziale pluripotenza, confermano che le linee IPSC completamente riprogrammate possono differenziarsi in tre foglietti embrionali da una formazione del corpo embrioide e saggio di differenziazione o di un saggio di formazione teratoma 16.
  16. Verificare che le linee IPSC completamente riprogrammati dimostrano un cariotipo normale analisi citogenetica.
  17. Per la formazione teratoma, iniettare una indifferenziata TIL derivato COPSI (1 x 10 6) sospensione in 100 ml di DMEM contenente 10% FCS nel tessuto sottocutaneo di 6-8 settimane topi NOD / SCID vecchi femminili. sezioni teratoma macchia con ematossilina ed eosina.

4. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per SSEA3, SSEA4, TRA1-60 e TRA1-81

  1. Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di 4% annuosoluzione raformaldehyde per 10 minuti. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte.
    NOTA: Fare attenzione quando si utilizza paraformaldeide perché è tossico.
  2. Pretrattare le iPSCs con tampone di bloccaggio (Tabella 1) per 30 minuti. Nel frattempo, diluire gli anticorpi primari (ratto anti-umano SSEA3, topo anti-umana SSEA4, topo anti-umano TRA1-60 e mouse TRA1-81 anti-umano) soluzione di capra siero 1:50 in 1,5% diluiti con PBS e TritonX -100 (volume totale: 1 ml).
  3. Rimuovere il tampone di bloccaggio (Tabella 1). Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Nel frattempo, diluire l'anticorpo secondario (IgG anti-topo e IgM o anti-topo IgM) 1:50 in 1,5% soluzione di capra siero.
  4. Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ciascuno per 5 min. Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito e incubare per 45 min a temperatura ambiente in una stanza buia.
  5. Rimuovere la soluzione di anticorpo secondario diluito e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs con microscopia a immunofluorescenza.

5. immunofluorescenza colorazione di iPSCs per Oct3 / 4

  1. Lavare iPSCs con 1 ml di PBS e fissare i iPSCs con 1 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% per 10 min. Rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare le iPSCs con PBS 3 volte.
  2. Aggiungere tampone di permeabilizzazione (Tabella 1) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Rimuovere il buffer di permeabilizzazione e aggiungere tampone di bloccaggio (Tabella 1).
  3. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. Nel frattempo, diluire l'anticorpo primario (del mouse Oct3 / 4 anti-umano) 1:50 in tampone di bloccaggio.
  4. Aggiungere la soluzione diluita anticorpo primario e incubare a 4 ° C durante la notte.
  5. Rimuovere la soluzione diluita anticorpo primario e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Nel frattempo, dilute l'anticorpo secondario (capra anti-topo IgG / IgM) 1: 100 in tampone di bloccaggio.
  6. Aggiungere la soluzione di anticorpo secondario diluito ed incubare a temperatura ambiente in una stanza buia per 45 min.
  7. Rimuovere la soluzione secondaria diluita e lavare i iPSCs con 1 ml di PBS 3 volte, ognuna per 5 min. Osservare le iPSCs al microscopio immunofluorescenza.

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Risultati

La Figura 1 mostra la descrizione della procedura che coinvolge l'espansione iniziale del melanoma TIL con rhIL-2, che è seguita da attivazione con anti-CD3 / CD28 e trasferimento genico Oct3 / 4, Klf4, SOX2, e c-MYC per TIL per la generazione di iPSCs. Di solito, TIL sulla cultura con rhIL-2 cominciano a formarsi le sfere 21-28 giorni dopo l'inizio della cultura. A questo punto, TIL sono pronti per essere attivato con anti-CD3 / CD28. La figura 2A

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Discussione

Qui, abbiamo dimostrato un protocollo per la riprogrammazione TIL melanoma a iPSCs da trasduzione SEV-mediata dei quattro fattori di trascrizione Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc. Questo approccio, utilizzando un sistema SeV per riprogrammare cellule T, offre il vantaggio di un metodo non integrare 7.

Uno studio precedente ha mostrato che un sistema riprogrammazione SeV era altamente efficiente e affidabile per riprogrammare fibroblasti non solo, ma anche le cellule T del sangue peri...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Ringraziamo la signora Deborah Postiff e la signora Jackline Barikdar del Tissue Procurement Core e la dottoressa Cindy DeLong del Pluripotent Stem Cell Core Laboratory dell'Università del Michigan per la sua assistenza tecnica. Questo studio è stato supportato dai finanziamenti per l'avvio dell'Università del Michigan e dalle sovvenzioni della Central Surgical Association, dell'American College of Surgeons, della Melanoma Research Alliance e del NIH/NCI (1K08CA197966-01) a F. Ito.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
delicato MACS C TubiMiltenyi Biotec130-093-237
delicato Dissociatore MACSMiltenyi Biotec130-093-235
Kit di dissociazione tumorale, umanoMiltenyi Biotec130-095-929
RPMI 1640Tecnologie di vita11875-093
Falcon 70 um Cell StrainerBD352350
BD Falcon 50ml Tubi conici per cntrifugiBD352070
IMDMLife technologies12440053
siero AB umanotechnologies34005100
L-glutammina (200mM)Life technologies25030-081
2-mercaptoetanolo (1000x, 55mM)Life technologies21985-023
Penicillina-Streptomicina Tecnologie di vita15140-122
gentamicinaTecnologie di vita15750-060
Ficoll-Paque PLUSGE17-1440-02
D-PBS (-)Tecnologie di vita14040-133
umano ricombinante (rh) IL-2Aldesleuchina, Prometheus Laboratories Inc.
Purificato NA/LE Topo Anti-Umano CD3BD555329
Purificato NA/LE Topo Anti-Umano CD28BD555725
X-VIVO 15Lonza04-418Q
FBSGibco26140-079
HEPESLife technologies15630-080
N-AcetilcisteinaCumberland Prodotti farmaceutici Inc.NDC 66220-207-30
Piastre per colture tissutali Falcon (6 pozzetti)Piastre353046
Falcon (24 pozzetti)Corning353047
Vettore virale SendaiDNAVEC
SNL Cellule feederCell Biolabs, IncCBA-316
mitomicina CSIGMAM4287solubile in acqua (0,5 mg/ml)
gelatinaSIGMAG1890
fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF)Life technologiesPHG0264
Life per colture tissutali Corning

Riferimenti

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