Misurazione dell'attività enzimatica della lattasi in laboratorio

Sommario

L'attività enzimatica della lattasi è essenziale per la lavorazione catabolica del disaccaride lattosio. Qui, l'attività della lattasi trovata negli integratori alimentari è analizzata utilizzando un saggio colorimetrico. Questo fornisce agli studenti una piattaforma sperimentale per comprendere l'attività della lattasi ed enzima cinetica.

Abstract

Comprensione del funzionano di enzimi e concernenti questo esempi di vita reale, è fondamentale per una vasta gamma di corsi di laurea in scienze biologiche e biomediche. Questo facile da seguire protocollo è stato sviluppato per studenti del primo anno dello studente non laureato farmacia e fornisce un'introduzione entry-level di reazioni enzimatiche e procedure analitiche per l'analisi dell'enzima. L'enzima di scelta è la lattasi, come questo rappresenta un esempio di un enzima disponibile commercialmente rilevante per la pratica umana di malattia/farmaceutico. Lattasi è estratta da compresse integratore alimentare e valutata utilizzando un saggio colorimetrico basato su idrolisi di un substrato artificiale per la lattasi (orto-nitrofenolo -beta-D-galattopiranoside, ONPG). Rilascio di orto-nitrofenolo seguendo la scissione idrolitica di ONPG di lattasi è misurata da una variazione di assorbanza a 420 nm e l'effetto della temperatura sulla reazione enzimatica viene valutata effettuando la reazione sul ghiaccio, a temperatura ambiente e a 37 ° C. Analisi più avanzate può essere implementata usando questo protocollo valutando l'attività dell'enzima in condizioni diverse e utilizzando reagenti diversi.

Introduzione

Gli enzimi sono un tipo specializzato di proteine che agiscono come catalizzatori biologici per reazioni chimiche nel vivere organismi¹. L'azione degli enzimi è fondamentale per la vita, fornendo energia, smaltimento dei rifiuti e permettendo di organismi a funzionare. Enzimi di comprensione è, quindi, fondamentale per una piena comprensione della vita. Tale conoscenza è essenziale per un'ampia varietà di programmi di laurea universitari, che vanno dalle scienze mediche alla biologia. Mentre uno sfondo dettagliato dai principi di catalisi ai modelli teorici dell'attività enzimatica può essere fornito agli studenti mediante lezioni e materiale di lettura, le proprietà delle reazioni enzimatiche sono meglio compreso da mani su esperienza pratica di gli enzimi in azione come precedentemente dimostrato². Questo protocollo fornisce una semplice seguire il paradigma sperimentale per misurare l'attività dell'enzima in condizioni di laboratorio, utilizzando lattasi come esempio di un enzima con un'attività rilevante per la salute e la nutrizione umana.

La lattasi glicosidici idrolasi (EC 3.2.1.23/26) è un enzima di centrale importanza nutrizionale per mammiferi³. L'attività della lattasi è una proteina altamente conservata attraverso l'evoluzione e deriva dalla famiglia degli enzimi beta-galattosidasi — una famiglia presente da Escherichia coli attraverso a Homo sapiens (Figura 1, PDB 1JZ8)⁴. L'importanza critica della lattasi in un ambiente nutrizionale umano deriva dal suo ruolo nel permettere la ripartizione di lattosio nei suoi componenti costitutivi monosaccaride, che possono quindi essere utilizzati per generare energia nel corpo. Lattasi catalizza l'idrolisi del legame glicosidico nel disaccaride lattosio, rilasciando galattosio e glucosio (Figura 2)⁵. Questi monosaccaridi vengono quindi utilizzati principalmente per la produzione di adenosina trifosfato (ATP) attraverso il ciclo dell'acido citrico e fosforilazione ossidativa⁶. Durante lo sviluppo infantile e neonato, lattasi è altamente espressa nell'apparato digerente umano, lattosio ricevuto dal latte materno che di cui lattosio è il componente primario del carboidrato e una delle principali fonti di nutrizione durante i primi anni ⁷. l'importanza medica di lattasi è evidenziata da deficit congenito di lattasi (CLD), uno stato recessivo autosomal raro causato dalle mutazioni nel gene della lattasi (LCT) che codifica per l' enzima lattasi⁸. Neonati con CLD esibiscono l'attività della lattasi molto poco, quindi non possono essere alimentati con il latte materno, qualsiasi altro tipo di latte, o una formula contenente lattosio.

Durante l'infanzia, l'espressione della lattasi è normalmente ridotta; Tuttavia, questa riduzione dopo lo svezzamento varia geograficamente, con circa il 35% di adulti in tutto il mondo continua ad esprimere l' enzima⁹. Sostenuta espressione della lattasi, nota come persistenza di lattasi, consente alle persone di continuare a digerire il latte e derivati da una gamma di fonti. Al contrario, la perdita di espressione di lattasi può comportare l'intolleranza al lattosio, noto anche come adulto-tipo hypolactasia (ATH), risultanti da un'incapacità di scomporre il lattosio nell'intestino. ATH è caratterizzata da una build up di lattosio nel colon dopo ingestione di lattosio contenenti prodotti alimentari. Nel colon, il lattosio accumulato viene fermentato da fauna microbica dell'intestino, rilasciando gas tra cui l'idrogeno, metano e anidride carbonica. Gonfiore addominale, flatulenza aumentata, dolore, nausea, borborigmi (brontolio di stomaco)⁷e promuovere la produzione di questi gas in individui con deficit di enzima lattasi. Aumento dei livelli di lattosio nell'apparato digerente può anche portare alla perdita di feci.

Il controllo dell'espressione genica LCT è modulato da polimorfismi localizzati in introni del gene MCM6 nelle vicinanze. Gli individui con sostenuta espressione della lattasi trasportano polimorfismi che fungono da rinforzatori distali forti per LCT espressione genica, compensando così la normale regolazione della trascrizione di LCT durante lo svezzamento e di conseguenza sostenere l'espressione della lattasi in età adulta³. Polimorfismi di Enhancer sono stati suggeriti per sono stati selezionati positivamente dopo l'addomesticamento dei bovini e dei cammelli in Medio Oriente oltre cinquemila anni fa^9,10.

I sintomi che derivano da ATH possono essere gestiti riducendo l'assunzione di lattosio, ad esempio rimuovendo i latticini dalla dieta. Un approccio alternativo per ATH e l'approccio di scelta per CLD, è l'uso di integratori di lattasi, ampiamente disponibili in farmacia. Questi integratori forniscono lattasi isolata da una varietà di fonti, compresi i lieviti e batteri, in forma liquida o basati su pillola che può essere presa con o aggiunto al lattosio contenenti alimenti. Il supplemento sarà idrolizzare una percentuale del lattosio presente nel cibo ai prodotti glucosio e galattosio, così permettendo il loro assorbimento e accumulo di substrato di lattosio non digerito nell'intestino.

Basata sull'utilizzo di integratori di lattasi come aiuto dietetico, abbiamo sviluppato un esperimento di laboratorio di enzimologia semplice adatto per studenti primo anno biomedicali scienza o farmacia. Questo esperimento di laboratorio si avvale di integratori di lattasi commercialmente disponibili e usi orto-nitrofenolo -beta-D-galattopiranoside (ONPG) per fornire un punto di fine colorimetrico per la misurazione la scissione dei legami glicosidici di lattasi ( Figura 3)¹¹. ONPG agisce un substrato artificiale per la lattasi, che quando sottoposto a idrolisi da questo enzima produce D-galattosio e orto-nitrofenolo. Quest'ultimo prodotto ha un colore giallo, assorbendo la luce ad una lunghezza d'onda di 420 nm. Di quantificare eventuali modifiche di assorbanza a seguito di 420 nm l'esposizione di ONPG per lattasi, è possibile valutare l'attività di questo enzima. Questo esperimento di laboratorio fornisce una dimostrazione dell'attività enzimatica idrolasi. Costruendo in ulteriori repliche e svolgimento di analisi in condizioni diverse, è possibile incorporare più sofisticate analisi di cinetica enzimatica, fornendo un prezioso esempio di vita reale degli enzimi in azioni rilevanti per la salute umana.

Protocollo

Nota: Il protocollo qui sotto è stato sviluppato per essere tenuto nel corso di due ore (compreso il completamento di fogli di lavoro in classe) in un laboratorio didattico appositamente costruito. La procedura sperimentale sono stati deliberatamente messi insieme per escludere più dettagliata analisi della cinetica enzimatica (effettuato nel contesto di questo corso utilizzando i dati del modello); Tuttavia — come indicato nella discussione — il protocollo prevede un modello di analisi più avanzate, dipendendo dal livello di conseguimento di tempo, strutture e studente.

SICUREZZA: Questo pratico dovrebbe essere effettuato secondo le regole della buona chimica laboratorio pratica (GCLP) — dispositivi di protezione individuale, tra cui un camice da laboratorio fissato, guanti monouso e occhiali di sicurezza devono essere indossati tutte le volte in laboratorio .

1. Estrarre l'enzima

1. Schiacciare una compressa di lattasi, contenente 200 mg di enzima, una polvere anche utilizzando un mortaio e un pestello.
2. Posizionare la polvere risultante in una provetta da 15 mL etichettati "sospensione" e risospendere in 10 mL di 100 mM tamponato fosfato salino (PBS).
3. Vortex per 1 min massimizzare l'estrazione degli enzimi.
4. Trasferire 1 mL dalla sospensione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare per 1 min a 10.000 x g per particelle solide di sedimento.
5. Trasferire 500 µ l del surnatante in una provetta pulita 1,5 mL etichettata "Estratto di lattasi".

2. osservando la reazione colorimetrica

1. Posto 390 µ l di 100 mM PBS in una provetta da 1,5 mL etichettati "Quella A".
2. Aggiungere 100 µ l di soluzione ONPG 5mm e mescolare bene su Vortex.
   Attenzione: Questo pratico utilizza orto-nitrofenolo -beta-D-galattopiranoside (ONPG) come un sostituto per il lattosio. ONPG, essendo un composto fenolico, esso deve essere maneggiato con cautela. In caso di contatto con la pelle con ONPG, lavare immediatamente la pelle esposta. Tutte le cadute devono essere pulite immediatamente con carta assorbente per essere smaltiti nel flusso dei rifiuti appropriato.
3. Aggiungere 10 µ l di estratto in quella A tubo e mix bene su Vortex.
4. Osservare la miscela di reazione per 5 minuti e prendere nota di eventuali modifiche colorimetrici per la soluzione.

3. misurazione dell'attività enzimatica

1. Impostare due provette da 1,5 mL: uno etichettati "Reazione B", uno etichettati "controllo".
2. µ L 390 di 100mm PBS alla reazione tubo B, 400 µ l di 100 mM PBS per il tubo di controllo e quindi aggiungere 100 µ l di 5mm ONPG in ogni provetta.
3. Mescolare il contenuto nel Vortex.
4. Aggiungere 10 µ l di Estratto di lattasi nella provetta di reazione B, mescolare nel vortex e lasciare che la reazione di procedere per 1 min a temperatura ambiente.
5. Una volta trascorso 1 min, aggiungere 500 µ l di carbonato di sodio 1 M per entrambi i tubi per inibire l'enzima lattasi aumentando il pH, quindi terminare la reazione.
6. Trasferire 500 µ l da ciascuna provetta in cuvette spettrofotometro pulito e misurare l'assorbanza a 420 nm utilizzando lo spettrofotometro.
7. Nota la capacità di assorbimento per reazione B e campioni di controllo e quindi sottrarre il valore del controllo dal valore di reazione per derivare la variazione di assorbanza a causa di idrolisi di ONPG in presenza di enzima attivo.

4. effetto della temperatura sull'attività dell'enzima

1. Impostare controllo tre tubi e tre provette di reazione, come descritto nella sezione 3 ed etichettare questi "4 ° C", "Temperatura ambiente" e "37 ° C".
2. Dopo aggiunta di enzima estratto, incubare un tubo sul ghiaccio, uno a temperatura ambiente e uno a 37 ° C (in un bagno di acqua pre-riscaldata).
3. Consentire le reazioni di procedere per 1 min e quindi terminare la reazione aggiungendo 500 µ l di carbonato di sodio 1 M in ogni provetta.
4. Misurare l'assorbanza a 420 nm per ogni tubo come descritto nella sezione 3. Registrare i valori, sottraendo il valore di controllo dal valore di reazione in ogni caso.

Risultati

Risultati rappresentativi per la sezione 2 del protocollo sono mostrati in Figura 4A. La reazione di controllo, in assenza dell'enzima lattasi, rimane chiara, mentre la soluzione di reazione, contenente Estratto da the tablet di lattasi, diventa gialla come ONPG è idrolizzato rilasciando orto- nitrofenolo. Figura 4B Mostra quantificazione usando unità arbitrarie da sezione 4 del protocollo, seguente l'analisi dei campioni utilizzando lo spettrofotometro. Produzione di orto-nitrofenolo è minima quando la reazione viene incubata sul ghiaccio e massima quando la reazione è condotta a 37 ° C.

Figura 1 : Escherichia coli beta-galattosidasi. (A) struttura di cristallo di beta-galattosidasi da Escherichia coli, mostrando la struttura tetramerica del principio attivo complesso. (B) Allolactose (mostrato in rosso) associato al sito attivo della beta-galattosidasi. Immagini generate da PDB 1JZ8⁴. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Azione enzimatica della lattasi. Idrolisi del lattosio di lattasi per la produzione di beta-D-glucosio e beta-D-galattosio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Idrolisi di orto-nitrofenolo - beta -D-galattopiranoside. Idrolisi ONPG di lattasi per la produzione di beta-D-galattosio e orto-nitrofenolo (che è di colore giallo), che permette la stima dell'attività lattasica di misurazione dell'assorbanza a 420 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 4 : Idrolisi ONPG. Risultati rappresentativi di idrolisi ONPG, mostrando controllo e le provette (A) e dati rappresentativi dal punto 4 del protocollo registrato su fogli di lavoro in classe, risultati grezzo assorbanza in unità arbitrarie a 420 nm, rettificato per sfondo e a tre diverse temperature (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Condizione sperimentale	Variabili sperimentali
Temperatura	0 ° C, 10 ° C, 20 ° C, 30 ° C, 50 ° C
Concentrazione del substrato	0 mM, 1 mM, 5 mM, 10 mM ONPG
Inibizione competitiva	lattosio ONPG plus 0 mM, 1 mM, 5 mM o 10 mM 5 mM
Dipendenza dal tempo	0 s, 15 s, 30 s, 1 min, 5 min, 10 min, 20 min
Denaturazione al calore	Estratto di lattasi riscaldata a 100 ° C per 10 minuti prima del test

Tabella 1: potenziale estesa condizione sperimentale. Ha suggerito gli esperimenti estesi, da effettuarsi in triplice copia, indagando su aspetti specifici della lattasi Biologia.

Discussione

Una dettagliata conoscenza e comprensione degli enzimi, le reazioni enzimatiche e cinetica degli enzimi è necessaria per una vasta gamma di argomenti che abbracciano la biologia, la biomedicina e la farmacologia. Il protocollo descritto sopra utilizza lattasi come un esempio di un enzima rilevante per la salute umana per aver manifestato reazioni enzimatiche, fornendo competenze chiave che possono essere utilizzate in esperimenti di laboratorio più avanzati.

Questo protocollo è stato volutamente progettato per essere affidabile quanto possibili, permettendo agli studenti con poca o nessuna esperienza di laboratorio bagnato di produrre risultati interpretabili in un breve lasso di tempo. Nell'anno accademico 2014/2015 presso la facoltà di farmacia dell'Università di Reading, un totale di 144 studenti, organizzati in gruppi di 3, ha svolto l'esperimento "misurazione della lattasi", con tutti i gruppi in grado di rilevare un certo livello di attività enzimatica dal tablet di lattasi estratti.

Ci sono un numero di punti critici in questo protocollo. In primo luogo, è essenziale che l'estrazione iniziale è efficiente, consentendo di solubilizzazione di abbastanza enzima attivo per analisi successive. Nella nostra esperienza, primo anno gli studenti universitari possono farlo seguendo il protocollo come indicato; Tuttavia alcune indicazioni da manifestanti di laboratorio è stato richiesto a questo punto. Anche se sembrerebbe un punto evidente, un fattore chiave per il successo di questo protocollo è la capacità di misurare volumi, correttamente Etichettare provette e seguire attentamente le istruzioni. Mentre un certo livello di competenza può essere presupposto per molti studenti, attento monitoraggio e una chiara richiesta per gli studenti a chiedere assistenza nel caso in cui non sono sicuri di cosa fare successivamente fornisce la probabilità più grande di un test di successo.

Valutazione degli studenti può essere effettuata dalla classe foglio di lavoro (disponibile come materiale supplementare), chiedendo agli studenti di notare dati dagli esperimenti, commento sui loro risultati e link a informazioni/letture da materiale lezione, o da più dettagliata, dalla valutazione di classe con i dati del modello forniti consentendo analisi cinetiche essere tentato e valutati.

Il protocollo presentato qui è un semplice esempio di un analisi di attività della lattasi sotto condizioni di laboratorio di insegnamento, e c'è ampia possibilità di aumentare la complessità dell'esperimento per consentire analisi più avanzate. In particolare, il protocollo presentato viene fornita un'introduzione al concetto di cinetica enzimatica ma non consente l'analisi cinetica dei dati sperimentali. Come tale, vi consigliamo di visualizzare il protocollo descritto come un modello iniziale per le classi, con dettagli precisi adattati per soddisfare gli obiettivi specifici e talenti della coorte studente impresa gli esperimenti. Esempi di esperimenti estesi possono includere: ripetute misure a temperature diverse, utilizzando concentrazioni di substrato differenti per consentire analisi statistica, analisi cinetica dei dati (adatti per gli studenti di biochimica/Major), iniziando con diversi tablet differenti e consentendo agli studenti di valutare diverse attività dell'enzima in ciascuna (con l'aggiunta di control compresse, adatti per gli studenti/specializzandi di scienze forensi), valutando l'impatto della denaturazione al calore o svolgimento concorso esperimenti di aggiunta di lattosio o inibitori della lattasi (tabella 1). Un protocollo dettagliato per l'analisi cinetica di lattasi precedentemente è stato pubblicato¹².

Un importante punto di forza di questo protocollo è che esso combina un'introduzione di base alla cinetica di enzimologia ed enzima con un caso di studio reale di enzimologia in medicina. Questo rende questo laboratorio esperimento di particolare rilevanza per gli studenti di medicina, farmacia, scienze biomediche e argomenti correlati. Soprattutto, il fatto che c'è una grave condizione medica e un più diffuso problema dietetico associato con catabolismo del lattosio offre l'opportunità di raccogliere una vasta gamma di questioni mediche ed etiche con gli studenti. Questo potrebbe includere le questioni che circondano la prova genetica per condizioni mediche e associate discussioni relative alla terapia genica e counselling genetico, così come uso e vendita di medicinali integratori. Uno dei principali limiti è che il protocollo non consentono una stima precisa della concentrazione di enzimi, a causa del materiale di partenza utilizzato per l'estrazione. Una modifica per tenere conto di questo, tuttavia, sarebbe quella di utilizzare degli enzimi di grado reagente per il dosaggio. D'importanza, questo permetterebbe anche per un calcolo più preciso della cinetica per l'enzima lattasi.

In conclusione, analizzando l'attività della lattasi in un laboratorio di insegnamento ambiente fornisce una robusta, coinvolgente e interessante introduzione al campo della biologia di enzima per fase iniziale gli studenti universitari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Compressa di lattasi	Lamberts	8511-60
Soluzione salina tamponata con fosfato (in polvere)	Sigma	P3813	Disciolto in acqua deionizzata alla concentrazione finale di 100 mM
ONPG	Sigma	N1127	Disciolto in acqua deionizzata alla concentrazione finale di 5 mM
Carbonato di sodio	Sigma	451614	Disciolto in acqua deionizzata alla concentrazione finale di 1 M
Acqua deionizzata	NA	NA
Pestello e mortaio	Spettrofotometro VWR
	Jenway 6315
Pipette	Gilson
Provette da 15 mL	VWR
Provette da 1,5 mL	Eppendorf
Spettrofotometro	Cuvette Jenway
Vortex	Vortex genie 2
Centrifuga	Beckman
Secchiello per il ghiaccio	VWR
Bagnomaria	Thermo-Scientific
Bilance	Thermo-Scientific