Articolo metodologico

Isolamento di cognate Complessi RNA-proteina da Cellule con eluizione oligonucleotidi-diretto

DOI:

10.3791/54391

⸱

16 gennaio 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive un approccio per isolare RNP affini selezionati formati in cellule eucariotiche tramite uno specifico arricchimento diretto da oligonucleotidi. Dimostriamo l'applicabilità di questo approccio isolando un RNP affine legato alla regione retrovirale 5' non tradotta che è composta da DHX9/RNA elicasi A.

Abstract

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Le particelle ribonucleoproteiche dirigono la biogenesi e la regolazione post-trascrizionale di tutti gli mRNA attraverso combinazioni distinte di proteine leganti l'RNA. Sono composti da elementi di RNA cis-agenti dipendenti dalla posizione e da combinazioni uniche di proteine leganti l'RNA. Definire la composizione di uno specifico RNP è essenziale per raggiungere una comprensione fondamentale della regolazione genica. L'isolamento di un RNP selezionato è simile a trovare un ago in un pagliaio. Qui, dimostriamo un approccio per isolare gli RNP associati alla regione 5' non tradotta di un mRNA selezionato in cellule asincrone e trasfettate. È stato dimostrato che questo RNP affine è necessario per la traduzione di virus selezionati e geni cellulari di risposta allo stress.

Il protocollo di co-precipitazione RNA-proteina dimostrato è adatto per l'analisi a valle di componenti proteici attraverso analisi proteomiche, immunoblots o opportuni saggi di identificazione biochimica. Questo protocollo sperimentale dimostra che l'elicasi A di DHX9/RNA è arricchita all'estremità 5' dell'RNA retrovirale affine e fornisce informazioni preliminari per l'identificazione della sua associazione con gli mRNA affini huR e junD associati allo stress cellulare.

Introduzione

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genica post-trascrizionale è regolato con precisione, cominciando con la trascrizione del DNA nel nucleo. Controllato da RNA vincolante proteine (RBPs), mRNA biogenesi e il metabolismo si verificano in particelle ribonucleoproteiche altamente dinamici (RNP), che associano e dissociano con un mRNA substrato precursore durante la progressione di RNA metabolismo 1-3. cambiamenti dinamici nella componenti RNP influenzano il destino post-trascrizionale di mRNA e di fornire la garanzia della qualità durante la lavorazione dei trascritti primari, i loro traffici nucleari e la localizzazione, la loro attività come modelli di mRNA per la traduzione, e l'eventuale fatturato di mRNA maturi.

Numerose proteine sono designati come RBPs in virtù dei loro domini ammino acido conservato, tra cui il motivo di riconoscimento RNA (RRM), l'RNA a doppio filamento dominio di legame (REA), e tratti di residui basici (ad esempio, arginina, lisina e glicina) 4. RBPs sono di routineisolato da strategie di immunoprecipitazione e sono proiettati per identificare i loro RNA cognate. Alcuni RBPs co-regolare pre-mRNA che sono funzionalmente correlati, designati come regulons RNA 5-8. Questi RBPs, i loro mRNA cognate, e talvolta non codificante RNA, formano RNP catalitici che variano in composizione; loro unicità è dovuta a varie combinazioni di fattori associati, nonché al temporale sequenza, posizione, e la durata delle loro interazioni 9.

RNA immunoprecipitazione (RIP) è una tecnica potente per isolare RNP dalle cellule e per identificare le trascrizioni associati con analisi di sequenza 10-13. Passando da candidato a Genome-wide screening è possibile attraverso RIP combinato con un'analisi microarray 14 o high-throughput sequencing (RNA-Seq) 15. Analogamente, proteine co-precipitazione possono essere identificate mediante spettrometria di massa, se sono sufficientemente abbondanti e separabili dal anticorpi co-precipitazione 16,17. Qui, ci rivolgiamo la metodologia per isolare i componenti RNP di una specifica RNA affine da cellule umane in coltura, anche se l'approccio è alterabile per lisati solubili di cellule vegetali, funghi, virus e batteri. Analisi a valle del materiale comprendono l'identificazione candidato e validazione mediante immunoblot, spettrometria di massa, saggio enzimatico biochimico, RT-qPCR, microarray, e RNA-Seq, come riassunto in Figura 1.

Dato il ruolo fondamentale della RNP nel controllare l'espressione genica a livello post-trascrizionale, alterazioni nell'espressione dei RBPs componenti o la loro accessibilità alle cognate RNA possono essere dannosi per la cellula e sono associati a diversi tipi di disturbi, malattie neurologiche 18. DHX9 / RNA elicasi A (RHA) è necessario per la traduzione di mRNA selezionati di origini cellulari e retrovirali 6. Questi RNA affini presentano strutturalmente affini elementi cis-agenti nel loro5 'UTR, che è designato come elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 19. Attività RHA-PCE è necessaria per la traduzione efficiente cap-dipendente di molti retrovirus, compreso l'HIV-1, e di geni regolatori crescita, tra Jund 6,20,21. Codificata da un gene essenziale (dhx9), RHA è essenziale per la proliferazione cellulare e la sua down-regolazione elimina la vitalità delle cellule 22. L'analisi molecolare di RHA-PCE RNP è un passo essenziale per comprendere il motivo per cui l'attività RHA-PCE è necessario controllare la proliferazione cellulare.

La caratterizzazione precisa dei componenti RNP RHA-PCE allo stato stazionario o su perturbazione fisiologica della cella richiede l'arricchimento selettivo e la cattura delle RNPs RHA-PCE in abbondanza sufficiente per l'analisi a valle. Qui, retrovirale PCEgag RNA è stato etichettato con 6 copie del cis-acting sito di legame RNA per la proteina di rivestimento MS2 (CP) all'interno della cornice di lettura aperta. La proteina di rivestimento MS2 è stato exogenously co-espresso con PCEgag RNA dal plasmide trasfezione per facilitare l'assemblaggio RNP in cellule in crescita. RNP contenenti la proteina di rivestimento MS2 con cognate MS2-tag PCEgag RNA sono stati immunoprecipitati dall'estratto cellulare e catturati su sfere magnetiche (Figura 2a). Per catturare selettivamente i componenti RNP legati alla PCE, l'RNP immobilizzato è stato incubato con un oligonucleotide complementare alle sequenze distali alla PCE, formando un ibrido RNA-DNA che è il substrato per l'attività RNasi H. Poiché PCE è posizionato in 'terminale 5' del 5 untranslated regione, l'oligonucleotide era complementare alle sequenze di RNA adiacenti al sito di inizio traduzione retrovirale (gag codone di inizio). RNase H scissione in prossimità della partenza gag codone rilasciato complesso UTR 5 'dalla RNP immobilizzata, che è stato raccolto come eluente. Successivamente, il campione è stato valutato mediante RT-PCR per confermare la cattura di PCEgag e SDS PAGE e immunoblotting per confermare la capture della proteina di rivestimento bersaglio MS2. Una convalida del legame RNA proteina PCE-associata, DHX9 / RNA elicasi A, è stata quindi eseguita.

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Protocollo

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Composizioni Buffer
Tampone di lavaggio:
50 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 mM NaCl
3 mM MgCl2
Basso sale Buffer:
20 mM Tris-HCl, pH 7.5
10 mM NaCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
1x inibitore della proteasi cocktail senza EDTA
RNase Out 5 ml / ml (inibitore RNasi)
Citoplasmatica Lysis Buffer:
0.2 M saccarosio
1,2% Triton X-100
NETn-150 tampone di lavaggio:
20 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 mmNaCl
0,5% NP-40
3 mM MgCl2
10% di glicerina
Binding Buffer:
10 mM HEPES pH 7,6
40 mM KCl
3 mM MgCl2
2 mM DTT
5% glicerolo

Tabella 2: composizioni Buffer.

1. Preparazione delle cellule e la matrice di affinità

  1. Culture una linea cellulare di interesse per sub-confluenza (80%) in un piatto 10 cm. Usare piatti 10 cm per immunoprecipitazione indipendenti (IP) di una proteina di rivestimento NLS-MS2 FLAG-tag. Eseguire l'IP utilizzando antisieri al tag FLAG-epitope. Nell'esprimere il MS2 proteina di rivestimento plasmide FLAG-tagged, trasfezione le cellule 24-48 ore in anticipo del raccolto 20.
    NOTA: Un particolare RNP può essere arricchito dal nucleare o citoplasmalisati ic o un preparato biochimicamente-frazionata, come frazioni di un gradiente di saccarosio. Si raccomanda di raccogliere il lisato da cellule non transfettate in parallelo ad istituire un controllo negativo aggiuntivo.
  2. Trasferimento 60 ml per IP di proteine ​​G tallone magnetico liquami in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga.
  3. Posizionare il tubo su un rack calamita per provette da microcentrifuga per separare le perline dalla soluzione di storage.
  4. Rimuovere la soluzione di archiviazione disegnando con attenzione in su con una micropipetta.
  5. Rimuovere il tubo dal rack magnete.
  6. Lavare ed equilibrare le perline con 600 microlitri (10 volte il volume usato di perline) di 1x tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 3 mM MgCl 2, e 150 mM NaCl) e end-over-end di rotazione per 3 min a temperatura ambiente.
  7. Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio.
  8. Aggiungere 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e immunoprecipitating anticorpi bandiera alle pr equilibratobiglie magnetiche otein G (secondo la quantità raccomandata dal produttore per un immunoprecipitazione) e ruotare end-over-end a temperatura ambiente per almeno 30 minuti per coniugare l'anticorpo immunoprecipitating. Utilizzare il corrispondente IgG isotipo come controllo negativo adatto anticorpi.
  9. Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline e rimuovere il surnatante.
  10. Rimuovere il tubo dal rack magnete e lavare le perline anticorpo coniugato con 10 volumi (600 microlitri) di tampone di lavaggio 1x e la rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questa operazione due volte.
  11. Posizionare il tubo sulla cremagliera magnete e rimuovere il tampone di lavaggio.

2. La raccolta della RNP

NOTA: Preparare le RNP durante il tempo di incubazione dopo passo 1.8.

  1. Rimuovere terreno di coltura dalle cellule mediante aspirazione e lavare le cellule due volte con 1-5 ml di 1x ghiacciata PBS (PBS). Utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere bagnato,cellule aderenti precedenti la raccolta per centrifugazione a 226 xg per 4 minuti a 4 ° C.
  2. Aggiungere 375 ml di ghiacciata, buffer di basso contenuto di sale (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 2 mM DTT; 1x proteasi-inibitore cocktail, senza EDTA e 5 ml / ml RNase Inhibitor) al pellet e consentire gonfiore ponendolo in ghiaccio per 5 min.
    NOTA: sarto il volume di tampone basso contenuto di sale in funzione delle dimensioni del pellet. Per 1,2 x 10 6 cellule da una piastra 10 cm 375 microlitri di tampone è sufficiente.
  3. Per raccogliere il lisato cellulare citoplasmatica, aggiungere 125 ml di tampone di lisi ghiacciata (0,2 M di saccarosio / 1,2% Triton X-100), e quindi eseguire 10 colpi con un omogeneizzatore Dounce che è stato pre-raffreddata in un secchiello del ghiaccio.
    NOTA: per raccogliere il estratto cellulare totale, tampone di lisi standard di RIPA è raccomandato per solubilizzare nucleoplasma / cromatina.
  4. Spin in una microcentrifuga alla massima velocità (16.000 xg) per 1 min; questo sarà chiaro il supernatante di detriti unnuclei ND.
  5. Trasferire il surnatante in una nuova provetta 1.7 ml che è stato sul ghiaccio. Determinare la concentrazione totale di proteine da una norma, metodo di laboratorio-preferito, come il Bradford Assay 23. Prenotare una aliquota di almeno il 10% per analisi Western blot, per essere usato come un controllo di input. Utilizzare il lisato cellulare raccolto immediatamente per immunoprecipitazione o conservarlo a -80 ° C per le analisi future.
    NOTA: Nella nostra esperienza, i campioni possono essere conservati e utilizzati alcuni mesi dopo per l'analisi immunoprecipitazione, senza un compromesso di integrità.

3. immunoprecipitazione

  1. Aggiungere il volume desiderato del lisato cellulare raccolto, in base alla concentrazione proteica determinata nel passo 2.5, all'obiettivo perline anticorpo-coniugato. Utilizzando tampone di lavaggio 1x, portare il volume totale a 600 microlitri e ruotare end-over-end per 90 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Questo periodo di tempo è sufficiente per generareun isolamento robusto ad alta affinità complessi RNP, riducendo al minimo legame non specifico. Diluire fonti RNP alternative, come frazioni di un gradiente di saccarosio, di almeno 1: 1 con tampone di lavaggio 1x, e poi incubare con complessi branello-anticorpo precedentemente preparato, come detto sopra.
  2. Dopo 90 min di incubazione, porre la provetta IP sulla cremagliera magnete per raccogliere le perline. Riserva la surnatante come flusso continuo.
    NOTA: Questo primo flusso continuo è un campione di controllo importante per misurare l'efficienza IP. Un saggio immunoenzimatico fornirà un'indicazione dell'efficienza IP, nonché la specificità delle interazioni indagate. Si consiglia di mantenere questo surnatante per l'analisi a valle.
  3. Lavare le, perline anticorpo-coniugato RNP-bound con 10 volumi (600 microlitri) di NETn-150 tampone di lavaggio ghiacciata (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 3 mM MgCl 2; 0,5% NP40; e 10% glicerolo) in rotazione per 3 minuti a temperatura ambiente. Ripetere il passaggio 3 volte.
    NOTA: Questo buffer differisce dal buffer di lisi e riduce effettivamente associazioni deboli o non specifici.
  4. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere i complessi RNP immobilizzate in 60 ml di 1x tampone ghiacciata vincolante (10 mM HEPES, pH 7,6; 40 mM KCl, 3 mM MgCl 2; 5% glicerolo e 2 mM DTT) e riserva del 10% delle perline complessi immobilizzati per Western blot e 20% per l'isolamento di RNA.

4. eluizione

  1. Regolare il volume residuo di 100 microlitri con 1x tampone di legame ghiacciato e riscaldare il tubo a 70 ° C per 3 min.
  2. Per isolare affini complessi RNA-proteina, aggiungere un ~ 30 nt DNA oligonucleotide complementare al confine 3 'la sequenza di RNA di interesse e incubare per 30 min a temperatura ambiente con delicata dondolo (100 nM di oligonucleotide è sufficiente).
    NOTA: L'oligonucleotide antisenso è ai residui nucleotidici adiacenti alla traduzione start-site del costrutto PCE utilizzato come example in questo protocollo. Appropriata complementarità sequenza viene fornito dalla ~ contenuto di GC del 40%. Progettare l'oligonucleotide antisenso per l'ibridazione efficiente alla regione minima complementare del RNA bersaglio.
  3. Aggiungere 5-10 unità di RNasi H al tubo ed incubare a temperatura ambiente per 1 ora per scindere l'RNA del RNA: DNA ibrido. Trasferire il surnatante in una provetta da 1,7 ml microcentrifuga sterili; questo campione contiene i complessi RNP catturati di interesse.
    NOTA: A seconda della accessibilità del RNA cognate, due o più cicli di trattamento RNase H possono essere utili per aumentare l'abbondanza campione per le analisi a valle.
  4. Utilizzare 20% dell'eluato in un Western blot per proteine ​​associate noti e 20% dell'eluato per l'isolamento di RNA seguita da RT qPCR. Il restante 60% può essere utilizzata per spettrometria di massa o per identificare componenti proteiche.
  5. Parallelamente, sottoporre una aliquota del lisato cellulare riservata all'isolamento RNA e analisi RT-PCR. Questo assessment fornisce un'indicazione della arricchimento di RNA all'interno di un complesso RNP.
    NOTA: Utilizzare la preparazione proteina isolata in un Western Blot di controllo per accertare che la scissione RNasi H è stato efficace nel liberare la RNP dal complesso immunuoprecipitated.

5. Analisi delle proteine ​​elettroforesi e Western Blot

  1. Oggetto circa il 10-20% del campione totale per SDS-PAGE e analisi immunoblot secondo il protocollo standard di laboratorio.
    NOTA: Questo passaggio serve per convalidare l'efficienza IP e la specificità prima dell'analisi RNA a valle. Può anche essere utilizzato per valutare la composizione proteica del complesso RNP isolato.

6. Raccolta del immunoprecipitato RNA

NOTA: isolamento di RNA può essere fatto con il metodo Trizol o seguendo il protocollo descritto.

  1. Risospendere la metà del campione totale in 750 ml di acido reagente guanidinio tiocianato e incubare a T ambienteemperature per 5 minuti prima di estrarre l'RNA dai complessi PCE-RNP catturati.
  2. Aggiungere 200 ml di cloroformio al tubo, agitare vigorosamente per 10 secondi, e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
  3. Dopo centrifugazione a 16.000 xg per 15 min a 4 ° C, raccogliere la fase acquosa nel tubo di nuovo e aggiungere un uguale volume di isopropanolo. Mescolare bene e incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min. Aggiungere 1 ml di blu glicole al campione e conservarlo a -20 ° C nel congelatore per la precipitazione o la trasformazione efficiente in una data futura.
  4. Centrifugare la provetta a 16.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante in modo da non disturbare il pellet di RNA; l'uso di un p-200 punta micropipetta è raccomandato per facilitare questo processo.
  5. Aggiungere 500 ml di etanolo al 75% per ogni provetta, vortex e centrifugare le provette a 16.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere accuratamente e scartare il surnatante come al punto 6.4. Aria-asciugare il pellet per 2-3 minuti e risospendere in 100 ml di acqua RNase-free.
    NOTA: Non prolungare il tempo gli air-asciuga pellet al fine di evitare un problema con la risospensione.
  6. Applicare 100 ml di campione di RNA a una colonna clean-up RNA. Elaborarlo utilizzando il protocollo del produttore. Eluire l'RNA in 30 ml di acqua RNase-free e conservare a -80 ° C per un massimo di 3 mesi.
    NOTA: Questo isolato l'RNA è adatto per l'analisi a valle mediante RT-PCR in tempo reale (qPCR), microarray, e RNA sequenziamento. A seconda della abbondanza del RNP e l'efficienza con cui viene isolato il RNP di interesse, la stessa lisato può essere sottoposto a due o più cicli di IP per generare RNA sufficiente applicabile per le analisi a valle.

7. RNA trascrizione inversa e l'amplificazione di cDNA mediante PCR

  1. Sottoporre il RNA isolato per trascrizione inversa da un primer casuale con un transcrittasi inversa di alta qualità (RT), secondo il manufale istruzioni del cturer.
  2. Per amplificare l'RNA di interesse, progettare un primer antisenso specifici geni all'interno della sequenza scissione RNase H. Utilizzare gli importi simili della oligonucleotide antisenso, un primer a caso, o di un primer oligo-dT (vedi Materiali Tavolo).
    NOTA: Il primer oligo-dT e mRNA poli-adenylated forniscono le reazioni positive di controllo per le reazioni di RT-PCR.
  3. Reserve 5% della reazione RT (1 ml) per un qPCR preparativa fatto in tandem con controllo negativo lisato IP e campioni di DNA positivo controllo per definire cutoff e produrre una curva standard. Se il valore CT del preparativo qPCR non rientra nella gamma della curva standard, diluire la reazione RT in consecutivi 1: 5 diluizioni e ripetere il punto 7.2.
    NOTA: Per una sequenza di RNA e la tecnica di spettrometria di massa, si prega di consultare il file metodo supplementare. Si prega di cliccare qui to visualizzare il file metodo supplementare. (Tasto destro del mouse per scaricare).

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Risultati

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Risultati RIP precedenti identificati RNA gag retrovirali e selezionati RNA cellulari che la co-precipitato con DHX9 / RHA, compreso l'HIV-1 6, Jund 6 e Hur (Fritz e Boris-Lawrie, inedito). Il retrovirale 5 'UTR è stata dimostrata a co-precipitato con DHX9 / RHA nel nucleo e di co-isolare nel citoplasma in poliribosomi. Si è univocamente definita come la CSI -acting elemento di controllo post-trascrizionale (PCE) 6. Per isolare PCEgag RNA-RHA com...

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Discussione

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L'isolamento RNP e la strategia di identificazione RNA cognate qui descritto è un mezzo selettivo di indagare una specifica interazione RNA-proteine ​​e di scoperta di proteine ​​candidate co-regolamentazione di un RNP specifica nelle cellule.

Il vantaggio di utilizzare oligonucleotide-diretto RNase H scissione per isolare RNP è la capacità di catturare e analizzare il modo specifico cis-agendo elemento RNA RNP oltre RNP eterogenei legati a valle con l'elemento RNA cis-agenti di inte...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano il supporto dal NIH P50GM103297, P30CA100730 e Comprehensive Cancer P01CA16058.

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Materiali

2

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Dynabeads Protein AInvitrogen10002D
Dynabeads Protein GInvitrogen10004D
Anticorpo anti-FLAGSigmaF3165
Anticorpo Anti-FLAGSigmaF7425
Anticorpo Anti-RHAVaxronPA-001
TRizol LS reagenteTecnologiadella vita10296-028
RNasi HAmbionAM2292
CloroformioFisher ScientificBP1145-1
IsopropanoloFisher ScientificBP26184
Colonna di pulizia RNaeasyQiagen74204
Trascrittasi inversa omniscriptQiagen205113
RNasi OutInvitrogen10777-019
Cocktail di inibitori della proteasiRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GliceroloFisher Scientific17904
Primer per esameri casualiInvitrogenN8080127
Primer Oligo-dTInvitrogen
Primer PCRIDTPrimer specifici per gene Amplificazione PCR
Oligonucleotide per scissione mediata da RNasi HIDTPrimer antisenso per RNA bersaglio
TripsinaTecnologia Gibco Life25300-054
Terreno di coltura tissutale DMEMTecnologia Gibco Life11965-092
Siero fetale bovinoTecnologia Gibco Life10082-147
Trisbase Fisher ScientificBP152-5
Cloruro di sodioFisher ScientificS642-212
Cloruro di magnesioFisher ScientificBP214
DTTFisher ScientificR0862
SaccarosioFisher ScientificBP220-212
Membrana in nitrocellulosaBio-Rad1620112
Supporto magneticoPortaprovette per microcentrifuga da 1,7 ml
CappaPer la coltura di tessuti animali
IncubatorePer la coltura di tessuti animali
gel proteicoSeparazione di campioni di proteine
ApparecchioTrasferimento di campioni di proteine
Pronto all'uso gel proteici (4-15%)Separazione del campione di proteine
CentrifugaPellet verso il basso il campione
RotatoreMescolare il campione da un capo all'altro
VorticeMescolare i campioni
AM5730G laminare COApparato su per il trasferimento di proteine da tavolo da tavolo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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