Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

Summary

Questo rapporto descrive un protocollo CUBIC per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare pattern di espressione delle proteine, le cellule proliferanti, e sebociti alla risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati.

Abstract

La pelle è essenziale per la nostra sopravvivenza. Lo strato epidermico esterno è costituito dell'epidermide interfollicolare, che è un epitelio squamoso stratificato che copre la maggior parte del nostro corpo, e appendici epidermiche, come i follicoli piliferi e delle ghiandole sudoripare. L'epidermide subisce rigenerazione per tutta la vita e in risposta al danno. Ciò è reso possibile dal K14-esprimendo popolazioni staminali / progenitrici di cellule basali epidermiche che sono strettamente regolati da molteplici meccanismi regolatori attivi all'interno dell'epidermide e tra epidermide e derma. Questo articolo descrive un metodo semplice per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare modelli di espressione della proteina K14, Ki67 etichettato cellule proliferanti, Nile Red etichettato sebociti, e l'etichettatura nucleare DAPI ad una risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata e la quantificazione di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati. Il protocollo è CUBIC °e miglior metodo disponibile ad oggi per indagare le interazioni molecolari e cellulari in piena biopsie cutanee spessore ad una risoluzione di singola cellula.

Introduction

La pelle è essenziale per la nostra sopravvivenza. Si compone di tre strati principali l'epidermide esterni, il derma e l'ipoderma. L'epidermide è un tessuto altamente rigenerativa. Si tratta di un epitelio stratificato squamoso, composta prevalentemente da cheratinociti. Cheratinociti sono nati nello strato basale, e si muovono verso l'alto attraverso gli strati soprabasali differenziando, e alla fine sono versate nello strato corneo esterno circa un mese dopo la loro nascita. L'epidermide sviluppa una serie di appendici compresi i follicoli piliferi e delle ghiandole sebacee. I follicoli piliferi rigenerano anche in modo ciclico per tutta la vita ^1. La capacità rigenerativa dell'epidermide è consentito dalla presenza di cellule staminali e progenitrici che si trovano nello strato basale dell'epidermide interfollicolare e follicolo pilifero ^2.

Molte vie di segnalazione sono stati implicati nello sviluppo epidermico e rigenerazione. Alcuni di questi si verificano all'internosolo l'epidermide, come il percorso Hedgehog. Altri eventi di segnalazione avvengono tra derma e dell'epidermide ^3. Ad esempio, i segnali Wnt dal derma si pensa siano importanti per lo sviluppo del follicolo pilifero, e sono secreti dalla papilla dermica al momento della comparsa di anagen per attivare follicolo pilifero rigonfiamento la proliferazione delle cellule staminali / progenitrici e la crescita follicolo pilifero ^4. E 'importante capire i meccanismi cellulari e molecolari che controllano lo sviluppo e la rigenerazione epidermica per capire meglio come essi possono essere disturbati in malattie della pelle rigenerativo come il cancro della pelle.

Questo articolo descrive un Lear C, U nobstructed B pioggia I cocktail Maging e analisi omputational (cubi) protocollo ^5-7 C per chiarire interi preparati pelle di montaggio, e visualizzare modelli di espressione proteica in 3 dimensioni a risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Il metodo CUBIC prevede l'immersione di pelletessuto in due cocktail chimici amminoalcol-based. Queste soluzioni regolare gli indici di rifrazione del campione di pelle, lasciando il tessuto trasparente e le proteine ​​intatte, permettendo immunolocalizzazione con risoluzione di singola cellula.

Usando questo protocollo cubi, il basale e proliferanti popolazioni cheratinociti nell'epidermide interfollicolare e nel follicolo del capello sono stati ripreso in pieno biopsie cutanee spessore di tipo selvatico topo utilizzando anti-Keratin14 (K14) e anticorpi anti-Ki67. Le ghiandole sebacee in biopsie cutanee di tipo selvatico sono stati visualizzati con Nile Red colorazione. Infine, le popolazioni di cheratinociti basali di tipo selvatico e iperplastici biopsie cutanee YAP2-5SA-ΔC sono stati confrontati ^8.

Questo protocollo permette CUBIC valutazione visiva di espressione della proteina in pieno biopsie cutanee spessore con risoluzione singola cella, ed è uno strumento importante per apprezzare l'anatomia epidermica e difetti morfologici nella pelle di organismi geneticamente modificatitopi, e di indagare i meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo epidermico e la rigenerazione.

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida del Comitato Cura e etico degli animali (ACEC) all'UNSW l'Australia sotto approvato protocollo ACEC 13 / 64B.

1. Preparazione del Transparent mouse tessuto cutaneo

Nota: Tutti i topi utilizzati in questo studio erano su un C57BL / 6 background genetico

1. Raccolta del tessuto cutaneo del mouse.
   1. Umanamente eutanasia i topi da dislocazione cervicale.
   2. Rimuovere con attenzione i peli dalla zona della pelle in questione con un trimmer facendo attenzione a non ferire la pelle.
   3. Lavare la pelle a decontaminare con il 70% di etanolo in tampone fosfato (PBS).
   4. Sollevare pelle del collo dorsale con una pinza e fare un'incisione con le forbici.
   5. Sezionare una grande area di pelle dorsale mouse (circa 1,5 x 4 cm).
   6. Appiattire pelle derma rivolto verso il basso su una carta da filtro, e annotare l'orientamento antero-posteriore del campione.
   7. Tricarta da filtro m attorno alla pelle sezionato, e mettere in un tubo da 15 ml piena di preparati al momento 4% paraformaldeide soluzione (PFA) in PBS.
   8. Fix per 1 ora a temperatura ambiente, o una notte in frigorifero a 4 ° C.
   9. Lavare 2 x 5 minuti in PBS in una provetta da 15 ml.
      Nota: Le seguenti (1.1.10 - 1.1.12) sono passaggi facoltativi per la conservazione a lungo termine dei tessuti.
   10. Disidratare pelle sezionato in PBS con l'aumentare della concentrazione di etanolo (25%, 50% 70%) in una provetta da 15 ml durante operazioni di lavaggio 1-hr a temperatura ambiente.
   11. Conservare disidratate in etanolo al 70% in PBS in una provetta da 15 ml a 4 ° C fino all'utilizzo.
   12. 4 ore prima di compensazione, reidratare tessuto cutaneo in PBS con una minore concentrazione di etanolo (70%, 50%, 25%, 0%) in una provetta da 15 ml durante operazioni di lavaggio 1-hr a temperatura ambiente.
2. Cancellazione delle biopsie cutanee del mouse
   1. Preparare la soluzione CUBIC1 compensazione sciogliendo 3,85 g di urea e 3,85 g N, N, N ', N'-tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina in 5,38 ml di acqua distillata in un riscaldatore impostato a 60 - 70 ° C. Utilizzare un agitatore caldo.
   2. Aggiungere 2,31 g di polietilene glicole mono-p-isooctylphenyl etere / Triton X-100 alla soluzione una volta che è chiaro ed è raffreddata a temperatura ambiente.
   3. Tagliare il mouse pelle con una lama di rasoio affilata in biopsie di dimensioni di circa 0,2 x 0,5 cm, e immergere in 5 ml di soluzione CUBIC1 compensazione in una provetta da 15 ml. Per ottimizzare la visualizzazione dei follicoli piliferi, verificare che il lato più lungo della biopsia viene tagliato lungo la direzione antero-posteriore del campione.
   4. Collocare su una piattaforma rotante in un fornetto a 37 ° C.
   5. Cambiare la soluzione compensazione dopo 7 giorni. Preparare la soluzione CUBIC1 fresco prima dell'uso.
   6. Controllare la trasparenza del tessuto dopo 7 giorni. Se necessario, lasciare biopsie in soluzione compensazione CUBIC1 finché il tessuto è completamente trasparente.
   7. Una volta che la biopsia della pelle è trasparente,rimuovere la soluzione CUBIC1, e aggiungere 4 ml di 1 × PBS per lavare il tessuto 4 volte per 6 ore a 37 ° C.
   8. Lavare il tessuto cutaneo nel 20% w / v di saccarosio in PBS in una provetta da 15 ml per 4 ore a 37 ° C.
   9. Congelare il tessuto nel mezzo di montaggio composto ottimali di taglio temperatura (OCT) in un tubo da 15 ml durante la notte in un congelatore C -80 °.
      Nota: Questo passaggio aumenta la permeabilità della biopsia per la penetrazione degli anticorpi nei passaggi successivi.

2. Immunofluorescenza

1. Scongelare il tessuto da 1.2.9) a temperatura ambiente per 2-3 ore.
2. tessuto di lavaggio nel tubo da 15 ml con 5 ml di PBS per 8 ore a temperatura ambiente per rimuovere ottobre Compound.
3. biopsie trasferire in un tubo 2 ml, e incubare il tessuto in 1 ml di coniglio anti-Keratin14 o coniglio anticorpo anti-Ki67, sia diluito 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) per 3 giorni su un agitatore a 37 ° C forno.
4. biopsie trasferimento in una provetta 15 ml, unnd lavare tessuti 4 volte per 6 ore in 5 ml di PBST su un agitatore in forno a 37 °.
5. biopsie trasferimento in un tubo di 2 ml, aggiungere 1 ml anti-coniglio Alexa594 anticorpo secondario diluito 1: 100 in PBST e incubare 3 giorni su un agitatore in un forno a 37 ° C.
6. biopsie trasferimento in un tubo da 15 ml, e lavare tessuti 4 volte per 6 ore in 5 ml di PBST su un agitatore in un forno a 37 ° C.
7. biopsie trasferimento in un tubo di 2 ml, aggiungere 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) soluzione nucleare di contrasto (1: 1.000) in PBST e incubare una notte su un agitatore in un forno a 37 ° C.
8. Rimuovere la soluzione di contrasto DAPI, e aggiungere 1 ml di PBST al tubo 2 ml per lavare il tessuto 4 volte per 6 ore su un agitatore in un forno a 37 ° C.
   Nota: Passaggio facoltativo: Le biopsie possono essere conservate al buio in 1x PBS con sodio azide 0,02% per almeno 3 settimane.

3. Nile Red colorazione

1. Sciogliere in polvere Nilo Red in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione finale di 1 mg / ml
2. Aggiungere 1 ml soluzione Nilo Red a 1 ml di PBS per una concentrazione finale di 1 mg / ml.
3. Scongelare tessuto da 1.2.9) a temperatura ambiente per 2 - 3 ore, e lavare con 5 ml di PBS per 8 ore a temperatura ambiente.
4. Trasferire biopsie ad un tubo 2 ml, e immergere il tessuto in 1 ml di soluzione colorante Nilo Red per 2,5 ore a temperatura ambiente.
5. Lavare le biopsie della pelle nella provetta 2 ml con 1 ml PBST 4 volte per 30 minuti a temperatura ambiente.
6. Rimuovere la soluzione PBST dal tubo 2 ml, aggiungere 1 ml di soluzione DAPI nucleare di contrasto (1: 1.000) in PBST e incubare una notte a temperatura ambiente.
7. Rimuovere la soluzione di contrasto DAPI, e aggiungere 1 ml di PBST nel tubo 2 ml per lavare il tessuto cutaneo 4 volte per 6 ore a temperatura ambiente.
   Nota: Passaggio facoltativo: Le biopsie possono essere conservate al buio in 1x PBS con sodio azide 0,02% per almeno 3 settimane.

4. Imaging

1. Preparare la soluzione CUBIC2 compensazione, che contiene 50% (W / v) di saccarosio, 25% (w / v) di urea, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- nitrilotrietanolo, e 0,1% (v / v) Triton X-100.
2. Incubare il tessuto cutaneo in 1 ml di soluzione CUBIC2 in una provetta 2 ml su un agitatore per 24 ore in un forno a 37 ° C. Questo passaggio uniformare l'indice di rifrazione del tessuto.
3. Controllare la chiarezza del tessuto. Una volta che è chiaro, orientabilità dell'intera biopsia cutanea (0,2 x 0,5 cm) sul suo lato più lungo su un vetrino di vetro, in modo tale che la direzione della lunghezza dei follicoli piliferi è parallelo alla superficie coprioggetto (# 1 24 x 60 mm)
   Nota: Passaggio facoltativo: biopsie colorate con anticorpo possono essere memorizzati in soluzione CUBIC2 per circa 7 giorni. biopsie Nile Red-macchiati possono essere memorizzati in soluzione soltanto CUBIC2 per un massimo di 1 giorno, e dovrebbe essere ripreso al più presto possibile.
4. Preparare camera di imaging (Figura 1)
   Nota: materiali di consumo necessari per la preparazione della camera di imaging sono: blu tack, plastilina o simili, e 2 coprioggetto (24 x 50 mm) (FIGURA 1A).
   1. Preparare due sottili strisce di virata blu (diametro di circa 1 mm x 2 cm), e due lamelle (Figura 1B).
   2. Mettere strisce dell'aderenza blu su un vetrino, lasciando abbastanza spazio per la pelle biopsia (Figura 1C). 4.4.3)
   3. Posizionare biopsia cutanea tra strisce sul vetrino in una goccia di soluzione CUBIC2 (Figura 1C).
   4. Coprire biopsia cutanea con il secondo vetrino (Figura 1D).
5. Posizionare la camera di imaging con la biopsia cutanea montato sul palco di un microscopio confocale e spostare il tessuto nel percorso di luce.
6. Eseguire la scansione del campione utilizzando una sorgente di luce alogena e mercurio o filtri epifluorescenza standard (ad es, DAPI / GFP / CY3 / CY5) per identificare le regioni fluorescente macchiati di interesse.
7. Aree di immagine di interesse utilizzando un obiettivo 10X e 20X (NA 0,75) e le tecniche standard di imaging confocale a fluorescenza (ad es., Con DAcampioni PI macchiato illuminano con un laser 405 nm e raccolgono il segnale di fluorescenza tra 425-475 nm, e con Alexa Fluor 594 o campioni Nile Red-macchiati illuminano con un laser 561 nm e raccolgono il segnale di fluorescenza tra 570-620 nm).
8. Generare immagini Z-pile di ogni regione di interesse utilizzando Z-stack software di acquisizione immagini al microscopio (ad es., Utilizzando elementi NIS software di imaging 4.13 come descritto di seguito).
   1. Assicurarsi potenza del laser ottimale e PMT HV / Offset impostazioni sono state selezionate per la raccolta del campione di fluorescenza.
   2. Aprire la barra degli strumenti "ND Acquisition" da "Controlli di acquisizione".
   3. Selezionare la scheda "Configurazione serie Z" (assicurare tutte le altre schede sono deselezionato).
   4. Durante la scansione in tempo reale, si concentrano per la parte superiore del campione e premere il pulsante "Top".
   5. Focus di fondo del campione e premere il tasto "basso".
   6. Ingresso dimensione richiesta passo (o premere il tasto ottimizzato dimensione del passo).
   7. Press la "Esegui ora".
   8. Salva risultanti Z-stack come individuo Tiff pile di immagini (1 fluorocromo per immagine Z-stack).
9. Usa immagine Z-stack per ricostruire le regioni volume 3D di interesse utilizzando il software di analisi 3D (ad es., Utilizzando Imaris x64 7.2.3 come descritto di seguito).
   1. Avviare il software di analisi.
   2. Scegliere il pulsante "Surpass" nella barra degli strumenti per la generazione di volume 3D.
   3. Aprire prima Z-stack immagine a colori (ad es., DAPI).
   4. Utilizzare lo strumento 'aggiungi canale' per aggiungere canali di colori aggiuntivi, un canale per ogni fluorocromo. Così un campione contenente sia DAPI e Alexa Fluor 594 fluorocromi richiederà due canali.
   5. Utilizzare lo strumento "Proprietà Immagine" per impostare le dimensioni corrette pixel (voxel) (XYZ), determinato in 4,7 sopra.
   6. Utilizzare lo strumento "Regolazione Display" per modificare i colori di canale, se necessario (ad esempio, impostare il canale DAPI al blu, Alexa Fluor 594 canale rosso).
   7. per Posizione il volume 3D nella finestra dell'immagine, utilizzare il mouse del computer per fare clic e trascinare il volume, come richiesto.
   8. Utilizzare lo strumento "Snapshot" nella barra degli strumenti per generare i colpi di schermo dell'immagine 3D.
   9. Utilizzare lo strumento "Animazione" nella barra degli strumenti per generare i film di rotazione 3D campione.

Results

Tutto spessore dorsali biopsie cutanee di topi di tipo selvatico adulti sono stati chiariti, macchiato con un anticorpo vincolante marcatore dei cheratinociti basali Keratin14 (K14), e nuclei sono stati di contrasto con soluzione colorante DAPI (Figura 2 e Movie 1).

Nuclei DAPI-positivi erano visibili in tutto il campione (Figura 2A, C), e K14 colorazione era visibile esclusivamente nello strato basale massiccio cellule dell'epidermide inter...

Discussion

I meccanismi regolatori che controllano lo sviluppo della pelle e l'omeostasi sono più comunemente studiate in 2D utilizzando il sezionamento del tessuto e la colorazione istologica o l'etichettatura con anticorpi, che consente solo un apprezzamento limitato di morfologia della pelle, le popolazioni di cellule o di espressione della proteina. Sono stati sviluppati numerosi metodi per migliorare la visualizzazione della organizzazione spaziale delle cellule e proteine ​​a risoluzione singola cellula in 3 dimensio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6418
Etanolo 96% (non denaturato)	Fornitura chimica	UN1170
Nile Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina	Merck Millipore	821940
Polietilenglicole mono-p-isoottilfenil etere	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
Temperatura di taglio ottimale (OCT)	Composto Tissue-Tek	4583
anticorpo anti-cheratina14 Anticorpo	Covance	PRB-155P
anti-Ki67	Abcam	ab16667
Asino anti-coniglio Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich	D2650
Urea	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-nitrilotriteanolo	Merck Millipore	137002
Microscopio confocale	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Microscopio
cruZer6 Face Trimmer	Braun	Braun cruZer6 Face
Sodium azide	Sigma-Aldrich