Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount

Summary

Questo rapporto descrive un protocollo CUBIC per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare pattern di espressione delle proteine, le cellule proliferanti, e sebociti alla risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati.

Abstract

La pelle è essenziale per la nostra sopravvivenza. Lo strato epidermico esterno è costituito dell'epidermide interfollicolare, che è un epitelio squamoso stratificato che copre la maggior parte del nostro corpo, e appendici epidermiche, come i follicoli piliferi e delle ghiandole sudoripare. L'epidermide subisce rigenerazione per tutta la vita e in risposta al danno. Ciò è reso possibile dal K14-esprimendo popolazioni staminali / progenitrici di cellule basali epidermiche che sono strettamente regolati da molteplici meccanismi regolatori attivi all'interno dell'epidermide e tra epidermide e derma. Questo articolo descrive un metodo semplice per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare modelli di espressione della proteina K14, Ki67 etichettato cellule proliferanti, Nile Red etichettato sebociti, e l'etichettatura nucleare DAPI ad una risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata e la quantificazione di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati. Il protocollo è CUBIC °e miglior metodo disponibile ad oggi per indagare le interazioni molecolari e cellulari in piena biopsie cutanee spessore ad una risoluzione di singola cellula.

Introduction

La pelle è essenziale per la nostra sopravvivenza. Si compone di tre strati principali l'epidermide esterni, il derma e l'ipoderma. L'epidermide è un tessuto altamente rigenerativa. Si tratta di un epitelio stratificato squamoso, composta prevalentemente da cheratinociti. Cheratinociti sono nati nello strato basale, e si muovono verso l'alto attraverso gli strati soprabasali differenziando, e alla fine sono versate nello strato corneo esterno circa un mese dopo la loro nascita. L'epidermide sviluppa una serie di appendici compresi i follicoli piliferi e delle ghiandole sebacee. I follicoli piliferi rigenerano anche in modo ciclico per tutta la vit....

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali seguono le linee guida del Comitato Cura e etico degli animali (ACEC) all'UNSW l'Australia sotto approvato protocollo ACEC 13 / 64B.

1. Preparazione del Transparent mouse tessuto cutaneo

Nota: Tutti i topi utilizzati in questo studio erano su un C57BL / 6 background genetico

1. Raccolta del tessuto cutaneo del mouse.
   1. Umanamente eutanasia i topi da dislocazione cervicale.
   2. Rimuovere con attenzione i peli dalla zona della pelle in questione con un trimmer facendo attenzione a non ferire la pelle.
   3. ....

Results

Tutto spessore dorsali biopsie cutanee di topi di tipo selvatico adulti sono stati chiariti, macchiato con un anticorpo vincolante marcatore dei cheratinociti basali Keratin14 (K14), e nuclei sono stati di contrasto con soluzione colorante DAPI (Figura 2 e Movie 1).

Nuclei DAPI-positivi erano visibili in tutto il campione (Figura 2A, C), e K14 colorazione era visibile esclusivamente nello strato basale massiccio cellule dell'epidermide inter.......

Discussion

I meccanismi regolatori che controllano lo sviluppo della pelle e l'omeostasi sono più comunemente studiate in 2D utilizzando il sezionamento del tessuto e la colorazione istologica o l'etichettatura con anticorpi, che consente solo un apprezzamento limitato di morfologia della pelle, le popolazioni di cellule o di espressione della proteina. Sono stati sviluppati numerosi metodi per migliorare la visualizzazione della organizzazione spaziale delle cellule e proteine ​​a risoluzione singola cellula in 3 dimensio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6418
Etanolo 96% (non denaturato)	Fornitura chimica	UN1170
Nile Red	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -tetrakis (2-idrossipropil) etilendiammina	Merck Millipore	821940
Polietilenglicole mono-p-isoottilfenil etere	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
Temperatura di taglio ottimale (OCT)	Composto Tissue-Tek	4583
anticorpo anti-cheratina14 Anticorpo	Covance	PRB-155P
anti-Ki67	Abcam	ab16667
Asino anti-coniglio Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimetilsolfossido	Sigma-Aldrich	D2650
Urea	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-nitrilotriteanolo	Merck Millipore	137002
Microscopio confocale	Nikon Instruments Inc	Nikon A1 - Microscopio
cruZer6 Face Trimmer	Braun	Braun cruZer6 Face
Sodium azide	Sigma-Aldrich