Specie determinazione e la quantificazione in miscele Utilizzando MRM Spettrometria di massa dei peptidi applicata per l'autenticazione a base di carne

Sommario

Presentiamo un protocollo per identificare e quantificare i componenti in miscele di specie che possiedono proteine simili. La spettrometria di massa rileva i peptidi per l'identificazione e fornisce una quantificazione relativa in base ai rapporti delle aree di picco. Come strumento alimentare per il rilevamento delle frodi, il metodo può rilevare l'1% di cavallo nella carne bovina.

Abstract

Descriviamo un semplice protocollo per identificare e quantificare i due componenti in miscele binarie di specie che possiedono una o più proteine simili. Al centro del metodo c'è l'identificazione di "proteine corrispondenti" nelle specie di interesse, in altre parole proteine che sono nominalmente le stesse ma possiedono differenze di sequenza specie-specifiche. Quando sottoposte a proteolisi, le proteine corrispondenti daranno origine ad alcuni peptidi che sono altrettanto simili ma con varianti specie-specifiche. Si tratta di "peptidi corrispondenti". I peptidi specie-specifici possono essere utilizzati come marcatori per la determinazione delle specie, mentre le coppie di peptidi corrispondenti consentono la quantificazione relativa di due specie in una miscela. I peptidi vengono rilevati utilizzando la spettrometria di massa per il monitoraggio delle reazioni multiple (MRM), una tecnica altamente specifica che consente la determinazione delle specie basata sui peptidi anche in sistemi complessi. Inoltre, il rapporto tra le aree di picco dell'MRM derivanti dai peptidi corrispondenti supporta la quantificazione relativa. Poiché le proteine e i peptidi corrispondenti si comporteranno, in linea di massima, in modo simile sia nel trattamento che nell'estrazione sperimentale e nella preparazione del campione, la quantificazione relativa dovrebbe rimanere relativamente robusta. Inoltre, questo approccio non necessita degli standard e delle calibrazioni richieste dai metodi di quantificazione assoluta. Il protocollo è descritto nel contesto delle carni rosse, che hanno proteine corrispondenti convenienti sotto forma delle rispettive mioglobine. Questa applicazione è rilevante per il rilevamento delle frodi alimentari: il metodo è in grado di rilevare l'1% di peso per peso di carne equina nella carne bovina. La quantificazione relativa delle proteine corrispondenti, peptide corrispondente (CPCP) utilizzando i rapporti dell'area di picco MRM fornisce buone stime della composizione peso-peso di una miscela di cavallo e manzo.

Introduzione

Lo scandalo europeo della carne equina del 2013, in cui è stata trovata carne equina non dichiarata in un certo numero di prodotti a base di carne bovina dei supermercati¹, evidenzia la necessità di metodi di test in grado di rilevare e misurare le frodi alimentari nella carne. Sono state esplorate diverse tecnologie, in particolare il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e i metodi basati sul DNA². Un percorso alternativo, basato sulla spettrometria di massa, prende di mira peptidi specie-specifici che a loro volta derivano da proteine specie-specifiche. Qui descriviamo uno di questi approcci basati sui peptidi che offre sia l'identificazione che la quantificazione relativa delle specie adulteranti in una miscela di carne³.

Il protocollo è inquadrato nel contesto delle carni rosse e del desiderio di determinare la presenza di una nell'altra al livello dell'1% in peso, il livello considerato da alcuni come rappresentante l'adulterazione alimentare fraudolenta in contrapposizione alla contaminazione⁴. Il metodo si basa in primo luogo sull'identificazione di una proteina che è nominalmente "la stessa" in tutte le carni bersaglio. La mioglobina, la proteina responsabile del colore rosso della carne, è un buon candidato poiché è abbondante, relativamente tollerante al calore e solubile in acqua, ed è stata utilizzata per la determinazione delle specie di carne in precedenza^5,6. Le mioglobine per il manzo (Bos Taurus), il maiale (Sus scrofa), il cavallo (Equus caballus) e l'agnello (Ovis aries)³, per esempio, sono nominalmente le stesse, come richiesto, ma le loro sequenze non sono identiche. Tali gruppi di proteine "simili ma diverse", come queste quattro mioglobine, possono essere convenientemente descritti come "proteine corrispondenti". Le differenze di sequenza in queste quattro mioglobine sono specie-specifiche: ad esempio, le proteine complete della mioglobina per la carne bovina e quella equina, rispettivamente P02192 e P68082, comprendono ciascuna 154 amminoacidi con 18 differenze di sequenza tra i due. Sottoposte a proteolisi con tripsina, queste proteine producono due serie di peptidi, alcuni dei quali identici e altri che mostrano una o più differenze amminoacidiche specie-specifiche: le proteine corrispondenti danno quindi origine ai peptidi corrispondenti.

L'approccio CPCP, quindi, cerca innanzitutto di identificare le proteine di due o più specie in cui queste proteine mostrano varianti di sequenza specie-specifiche limitate. Queste sono proteine corrispondenti. Dopo la proteolisi, le proteine corrispondenti danno origine a peptidi, alcuni dei quali mostrano varianti di sequenza specie-specifiche ereditate dalla proteina madre. Questi sono peptidi corrispondenti. L'approccio CPCP può essere utilizzato per confrontare i livelli di due proteine corrispondenti in un campione di specie miste monitorando i livelli dei peptidi corrispondenti.

La tecnologia naturale per la rilevazione di peptidi noti è la spettrometria di massa per il monitoraggio delle reazioni multiple, o MRM-MS⁷. I peptidi specie-specifici producono ioni precursori che, insieme ai loro ioni frammento di spettrometria di massa, possono essere facilmente dettagliati in anticipo da strumenti software. Questi elenchi vengono quindi utilizzati per istruire lo spettrometro di massa a registrare solo specifiche coppie di ioni precursore e frammento, chiamate transizioni. Un particolare peptide bersaglio è quindi identificato non solo dal suo tempo di ritenzione nella cromatografia che precede lo spettrometro di massa, ma anche da un insieme di transizioni che condividono uno ione precursore comune. Si tratta di un mezzo altamente selettivo per rilevare peptidi noti che fa un uso efficiente della risorsa dello spettrometro di massa.

Altri autori hanno utilizzato la spettrometria di massa per testare l'adulterazione della carne tramite marcatori peptidici, ma da proteine disparate^8-14. L'utilizzo dello schema CPCP (Proteins, Corresponding Peptides) corrispondenti, tuttavia, consente di ottimizzare le condizioni sperimentali, aiutando l'identificazione delle specie nella miscela da transizioni specie-specifiche note. Inoltre, le proteine e i peptidi corrispondenti si comportano generalmente in modo simile nelle fasi di estrazione, proteolisi e rilevamento. Poiché le aree di picco di transizione sono quantitative e riproducibili, i rapporti delle aree di picco derivanti da coppie di peptidi corrispondenti di specie diverse forniscono una stima diretta delle quantità relative di due carni in una miscela. Al contrario, i percorsi di quantificazione più tradizionali sfruttano calibrazioni basate su materiali di riferimento per stabilire la quantificazione assoluta^14,15.

Sebbene il protocollo sia delineato nel contesto della mioglobina e della carne, le proteine diverse dalla mioglobina potrebbero essere utilizzate per l'identificazione e la quantificazione relativa tramite la strategia CPCP nelle miscele di carne, anche se potenzialmente con modifiche al protocollo. Inoltre, la strategia è applicabile anche a miscele binarie di altre specie che condividono una o più proteine corrispondenti.

Il punto di partenza per il protocollo è la mioglobina purificata 'di riferimento', che per alcune specie può essere acquistata ma che per altre deve essere preparata mediante cromatografia convenzionale ad esclusione dimensionale. La procedura per la preparazione della mioglobina di riferimento non è inclusa nel protocollo, ma è descritta altrove³. Gli strumenti software¹⁶ vengono utilizzati per elencare i peptidi candidati e le transizioni derivanti dalle mioglobine di interesse. Ogni mioglobina di riferimento viene sottoposta a proteolisi e i peptidi risultanti vengono analizzati mediante cromatografia liquida, spettrometria di massa tandem a ionizzazione elettrospray (LC-ESI-MS/MS) per scoprire quali ioni precursori e transizioni candidati sono più utili e per determinare i tempi di ritenzione dei peptidi corrispondenti. Il risultato di questa fase è un elenco rivisto di peptidi bersaglio con le loro transizioni, adatto per la determinazione delle specie, e un elenco di coppie di CPCP, adatte per la quantificazione relativa. Per testare le carni vere, vengono preparate estrazioni di campioni e poi sottoposte a proteolisi per generare peptidi sia dalla mioglobina che da altre proteine estranee. I peptidi a base di mioglobina vengono quindi monitorati mediante LC-ESI-MS/MS in base alle transizioni elencate. Le specie presenti in una miscela sono identificate dai picchi di transizione associati ai peptidi marcatori. Le stime delle quantità relative di due carni in una miscela binaria sono calcolate utilizzando i rapporti delle aree di picco di transizione. Una serie di miscele di prova di coppie di carni consentirà di controllare e calibrare il rapporto tra le aree di picco per una data coppia di transizioni rispetto alle miscele effettive.

Protocollo

1. La proteolisi e analisi di riferimento mioglobine

1. La proteolisi di mioglobina di riferimento
   1. Preparare soluzioni dei mioglobine riferimento purificati (range 0,2-0,5 mg / ml a 25 mM bicarbonato di ammonio) ^3.
   2. Trasferire 1 ml aliquote di ciascun campione a 2 ml provette da centrifuga.
   3. Termicamente denaturare le proteine ​​estratte dal riscaldamento del campione in un blocco caldo a 95 ° C per 30 min. Raffreddare il campione per circa 15 minuti fino a raggiungere la temperatura ambiente. Aggiungere 30 mg di urea (concentrazione finale 0,5 M) per migliorare la digestione, poi mescolare.
2. proteolisi Tryptic
   1. Preparare una soluzione di 1 mg / ml di tripsina in 25 mM di bicarbonato di ammonio e memorizzare sul ghiaccio come richiesto. Aggiungere un volume sufficiente di tripsina tale che l'attività enzimatica finale è 420 BAEE (benzoil-L-arginina N- etil estere cloridrato) unità / mg di proteina estratta, quindi mescolare vortexando gentilmente e lasciare proteolyze notte a 37 ° C.
   2. Effettuare sodio dodecil solfato SDS-PAGE (SDS-PAGE) ¹⁷ per dimostrare la completezza della proteolisi.
3. Dissalazione del campione post-proteolisi
   1. Diluire il campione 1: 2 v: v con acqua.
   2. Attiva una polimerica in fase inversa (RP) Cartuccia riempito con materiale RP 30 mg aggiungendo 1 ml di metanolo, quindi equilibrare la cartuccia mediante aggiunta di acido formico 1 ml di 1%.
   3. Caricare il campione attraverso la cartuccia per gravità.
   4. Lavare con 1 ml di acido formico al 5% metanolo / 1% a gravità.
   5. Eluire i peptidi con 1 ml di acetonitrile / acqua (90:10 v: v; 0,1% di acido formico) sotto gravità in 2 ml microprovette preriempite con 5 ml dimetilsolfossido (DMSO).
   6. Rimuovere il solvente sotto vuoto a 50 ° C usando un evaporatore centrifugo per 120 min, poi riprendere il residuo in 250 microlitri acetonitrile / acqua (3:97 v: v; 0,1% di acido formico).
   7. Trasferimentola soluzione ad un basso volume di trasporto del campione flaconcino.
      Nota: I campioni possono essere conservati a 4 ° C fino al momento HPLC-MS (LC / MS) analisi.
4. Generazione di liste di transizione per MRM
   1. Individuare le sequenze di mioglobina per le carni diverse dal database UniProt.
   2. Inserire le sequenze mioglobina nell'area di rigore 'target' del software di previsione peptide e di transizione (ad esempio, Skyline). Se necessario, passare il mouse sopra un peptide per rivelare la sua lista frammento.
   3. Clicca su 'Impostazioni' e selezionare 'Peptide Impostazioni'. Input le preferenze per la digestione (cioè, tripsina) e il numero di divisioni perse (0). Inserire la selezione richiesta per ulteriori parametri, in particolare, la lunghezza peptide (6 - 25), esclusioni N-terminali (0) e assume modifiche aminoacidi (nessuno).
   4. Clicca su 'Impostazioni' e selezionare 'Impostazioni transizione ". Selezionare le preferenze peril tipo di strumento utilizzato per l'analisi LC / MS.
   5. Clicca su 'Export' e selezionare 'Lista di transizione' per creare un foglio di calcolo contenente le transizioni MRM generati e parametri.
5. Analisi per LC / MS
   1. Impostare un sistema di gradiente binario (acqua (A) e acetonitrile (B), ciascuna con 0,1% acido formico v: v) cromatografo liquida ad alte prestazioni (HPLC) con campionatore automatico, C18 colonna nucleo guscio HPLC (10 cm x 2.1 mm , 2.6 micron granulometria) collegato ad uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo operante a elettrospray positivo con rilevamento MRM.
   2. Nel software di raccolta dati (ad esempio, Analyst), selezionare 'File' e 'Nuovo' e cliccare su 'acquisizione Metodo' nel box pop-up poi cliccare su 'OK'.
      Nota: Si apre il metodo editor di strumento, che contiene un elenco dei dispositivi collegati che consentiranno la messa a punto di un nuovo metodo / MS LC.
   3. Clicca su 'pompa binaria' e ionput il valore della portata (300 ml / min) ed i tempi gradiente nella tabella, stabilendo un profilo gradiente binario del 3% B a 30% B oltre 22 min, aumentando al 100% B a 23 min per 5 min wash out prima di tornare alle condizioni iniziali e riequilibrio per un ulteriore 6 min.
   4. Clicca su 'Autocampionatore' e inserire il volume di iniezione (5 ml). Abilitare il 'Ago ciclo di lavaggio' e inserire il 'Wash Time' (30 sec) e selezionare 'Flush Port'.
   5. Clicca su 'controller colonna termostatato' e nella 'colonna forno Properties' impostare la 'temperatura di sinistra' e 'destro temperatura' (40 ° C).
   6. Clicca su 'spettrometro di massa' e poi clicca su 'Modifica parametri' di entrare nelle condizioni di gas di origine. Selezionare il 'Tipo di scansione' come 'MRM (MRM)' e la 'polarità' come 'positivo'. Vai a 'Sintesi Periodo' e inserire il 'Durata Time', il tempo totale per la LC analisi di und equilibrazione (35 min).
   7. Nella tabella fare clic destro e selezionare 'Declustering Potential (DP)' e 'Collision Energia (CP)' per aggiungere queste colonne alla tabella. Inserisci il Q1, Q3, Tempo (msec), ID, valori DP e CE per tutte le transizioni, per una singola specie di carne, create nella lista di transizione (vedi punto 1.4.5).
      Nota: Tempo (msec) si riferisce al tempo di sosta, il tempo lo spettrometro di massa spende scansione di ogni transizione, la somma non deve superare 3 sec.
   8. Salvare il file metodo di acquisizione (file di estensione .dam).
      Nota: I passaggi 1.5.2 - 1.5.8 devono essere ripetute per ogni specie di carne. Questo creerà un unico file il metodo per ogni specie di carne in modalità a schermo, in preparazione per l'analisi di seguito.
   9. Nel software di raccolta dati, clicca su 'Acquire' e selezionare 'Equilibrare'. Nel dialogo che si apre, selezionare la richiesta metodo dell'acquisizione per iniziare l'equilibrio dello strumento.
   10. Mettere le fiale campione in arack nel campionatore automatico.
   11. Clicca su 'File' e selezionare 'Nuovo' poi 'Acquisizione Batch'. Nella scheda 'Sample' selezionare 'Aggiungi Set' poi 'Aggiungi Campioni'. Inserire il numero di campioni da analizzare e fare clic su 'OK'. Nella casella 'Acquisizione' selezionare il file metodo che verrà utilizzato per l'analisi dal menu a discesa.
   12. Nella tabella, selezionare 'Codice Piatto' e selezionare la configurazione del vassoio appropriato dal menu a discesa. Click sinistro nel 'Codice Targa' intestazione di colonna quindi fare clic destro e selezionare 'Fill Down'. In 'Vial Position' inserire la posizione di ogni campione nel campionatore automatico nelle righe.
   13. In 'File di dati' immettere il nome del file per l'acquisizione, fare clic poi a sinistra nell'intestazione della colonna seguito dal tasto destro del mouse e selezionare 'Fill Down'. In 'Sample Name' inserire l'identità di ciascuno dei campioni da analizzare. Salvare come file di acquisizione batch (file di postaXTension .dab).
   14. Fare clic sulla scheda 'Invia' quindi evidenziare i campioni che devono essere analizzati in LC / MS. Clicca su 'Invia'. Clicca su 'Acquire' e 'iniziare a campione' per iniziare l'analisi.
       Nota: Ogni metodo acquisizione scansione per le transizioni MRM tutta l'intera lunghezza del cromatografo per una singola specie di carne. Impostazioni Spettrometro di massa per l'acquisizione MRM variano in base al tipo di strumento e peptidi.
   15. Visualizzare i file di dati generati utilizzando il software di visualizzazione dei dati. Clicca su XIC (ioni estratti) e nel menu a tendina evidenziare tutti i frammenti (valori Q3) per un singolo precursore (Q1). Un nuovo riquadro si aprirà che mostra solo le transizioni selezionati.
   16. Registrare il tempo di ritenzione (R _t) di gruppi di transizioni simultanee poiché questi corrispondono ad un singolo peptide.
   17. Ripetere i due passaggi precedenti per ogni insieme di transizioni per assegnare i picchi ai rispettivi peptidi per ciascundelle specie di carne.
   18. Registrare i peptidi marcatori che sono adatti per fornire l'identificazione delle specie (ad esempio, peptide HPGDFGADAQGAMTK, precursore m / z = 752, R _t = 12.0 min, per il cavallo), insieme con i loro tempi di ritenzione, e scrivere che formano coppie adatte relativa quantificazione corrispondente .
       Nota: Ad esempio, il peptide marcatore cavallo (precursore m / z = 752) ha un corrispondente peptide manzo, HPSDFGADAQAAMSK (precursore m / z = 767, R _t = 13,2 min).
   19. Al fine di creare un unico metodo dinamico che abbraccia tutte le specie di carne, nel software di visualizzazione dati, per ogni specie di carne in volta, aprire i dati XIC transizione per ogni precursore (assegnato a un particolare peptide 1.5.8).
   20. Zoom sul cluster picco al tempo di ritenzione selezionato sinistro del mouse e trascinando il cursore sotto il cluster. Identificare le transizioni più intense (facendo clic destro sull'etichetta picco).
   21. registrare manualmente le transizionie tempi di ritenzione in un foglio di calcolo.
   22. Per inserire i parametri come un nuovo metodo dinamico sul software LC / MS, clicca su 'spettrometro di massa' e poi clicca su 'Modifica parametri' per inserire le condizioni di gas di origine. Selezionare il 'Tipo di scansione' come 'MRM (MRM)' e la 'polarità' come 'positivo'.
   23. Vai a 'Sintesi Periodo' e inserire il tempo di durata (impostato come il tempo totale per l'analisi LC e equilibrio). Nella tabella fare clic destro e selezionare 'Declustering Potential (DP)' e 'Collision Energia (CP)' per aggiungere queste colonne alla tabella.
       Nota: La colonna 'Tempo' ora si riferisce al tempo di ritenzione atteso (min) per ogni transizione.
   24. Nella sezione 'Modifica Parametri' del software di raccolta dati / MS LC, selezionare la casella 'Scheduled MRM'. Inserire il Q1, Q3, Tempo (min), ID, valori DP e CE per le transizioni create nel foglio di calcolo (1.5.21) e salvare il metodo di acquisizione (file l'estensione .dam).
       Nota: Questo metodo riduce in genere il numero di MRM transizioni al 4 più intensa per ogni peptide e scansiona solo attraverso la finestra di tempo di ritenzione per ogni picco peptide, dando maggiore sensibilità e qualità dei dati. Un metodo 'dinamica' è un metodo 'di ritenzione guidata tempo a finestre', a volte chiamato la programmazione.

2. preparazione e l'analisi di campioni di calibrazione

1. Estrazione di miscele a base di carne
   1. L'utilizzo di carne precedentemente congelato poi macinato in polvere, preparare una serie di miscele a base di carne pesando rispettive quantità di carne (massa totale di circa 300 mg) in tubi di plastica per centrifuga 15 ml.
   2. Aggiungere 4 ml di tampone di estrazione (0.15 cloruro di potassio M + 0,15 M tampone fosfato a pH 6,5). Vortex per 30 sec. Estrarre su un agitatore laboratorio a temperatura ambiente per 2 ore a 250 cicli / min.
      Nota: Cicli / min si riferisce ad un moto oscillatorio.
   3. Trasferire 2 ml diestrarre in una provetta 2 ml. Centrifugare per 5 minuti a 4 ° C a 17000 x g.
   4. Trasferimento 200 aliquote microlitri della surnatante (riservando una piccola quantità per il dosaggio delle proteine, vedere 2.2) in 2 ml provette da centrifuga e asciugare con un evaporatore centrifugo (programma di pre-set: 50 ° C, senza ventilazione e 120 minuti di durata).
2. dosaggio delle proteine
   1. Trasferimento 7 aliquote microlitri della surnatante riservata (vedi 2.1.4), in triplice copia nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
   2. Trasferimento 7 aliquote microlitri di una serie di standard di proteine ​​in triplice copia, nell'intervallo 0 - 1,0 mg / ml di albumina di siero bovino (BSA), alla stessa piastra da 96 pozzetti.
   3. Aggiungere 200 ml di Coomassie più saggio di proteine ​​reagenti in ciascun pozzetto.
   4. confrontare visivamente il colore dei pozzetti del campione con gli standard di proteine ​​per controllare i campioni sono nella gamma degli standard di calibrazione. Se necessario, ripetere con il campione diluito in modo che diventi in gamma.
   5. Lasciare la piastra a ste per 3 min.
   6. Burst eventuali bolle che si sono formate con un ago ipodermico.
   7. Analizzare la piastra sul lettore di piastre utilizzando un protocollo endpoint standard ad una lunghezza d'onda di 595 nm.
   8. Determinare la concentrazione di proteine ​​dei campioni utilizzando i dati di calibrazione dagli standard di proteine.
      Nota: Questa operazione è necessaria per il calcolo della quantità di tripsina utilizzato nel trittico digest.
3. La proteolisi di miscele a base di carne
   1. Riprendere il residuo essiccato dal punto 2.1.4 in 1 ml di 25 mM soluzione di bicarbonato di ammonio. Mescolare bene su un rotamixer.
   2. Seguire il protocollo dal punto 1.1.3 a 1.3.7.
4. Analisi per LC / MS
   1. Impostare la LC / MS come in precedenza (punto 1.5.1).
   2. Creare un nuovo lotto di acquisizione come descritto in precedenza (punti 1.5.9 - 1.5.14), selezionando il metodo di acquisizione creato il passo alla 1.5.24 che utilizza un LC dinamica / MS metodo che unisce tutte le specie di carne, e di acquisire i dati per le Digescampioni di carne TED.
   3. Visualizzare la piena cromatogramma nel software di visualizzazione dati. Visualizzare la XIC per ogni transizione impostata a sua volta. Visivamente confermare ogni cluster contiene il numero richiesto di picchi a campana al tempo di ritenzione atteso, confermando così l'esistenza del peptide selezionato.
   4. Eseguire la quantificazione utilizzando i dati di visualizzazione del software per integrare le aree dei picchi per ciascuna delle transizioni di interesse facendo doppio clic su 'Build metodo di quantificazione' nella barra di navigazione.
   5. Nel riquadro 'Select Sample' selezionare il 'file di dati' e il 'campione' da analizzare per generare una tabella 'Analiti'.
   6. Fare clic sulla scheda 'integrazione' per visualizzare la prima delle transizioni (analiti) da integrare.
   7. Clicca sul box 'Analita' per visualizzare l'elenco a discesa delle transizioni verso il basso. Selezionare ogni transizione a sua volta, per visualizzare e confermare visivamente il picco corretto sia selezionato per l'integrazione. per modificare o forzare l'integrazione, click sinistro e trascinare il cursore sopra il picco di destinazione (questo sarà evidenziato in verde). Fare clic sul pulsante 'Seleziona picco' e cliccare su 'Applica'.
   8. Salvare il lavoro come file di metodo (.qmf).
      Nota: Questo crea un file di metodo di quantificazione per il successivo calcolo delle aree dei picchi del campione.
   9. Fare doppio clic su 'Quantificazione Wizard' nella barra di navigazione. Nella finestra 'Select campioni' creare 'Quantificazione Set' selezionando un unico 'file di dati', poi uno o più "campioni disponibili. Selezionare 'Next' per visualizzare 'Selezionare Impostazioni e Query' scatola. Lascia con le impostazioni predefinite, selezionare 'Avanti' per visualizzare 'Selezionare il metodo'. Dal menu a tendina 'Metodo' selezionare il file 'integrazione Metodo' creata al punto 2.4.8, quindi selezionare 'Fine'.
      Nota: Questo crea un 'Risultati Table', tra cui transizione aree dei picchi derivanti da miscele a base di carne.
   10. Salvare il 'Risultati Table' (file di estensione .rdb), l'esportazione come file di testo (.txt) e aprirlo in foglio di calcolo per esaminare i dati.
   11. grafici trama della percentuale (da transizione area del picco) di uno di carne in un altro contro la percentuale misurata (w / w) delle due carni per MRM selezionato per transizioni selezionati corrispondenti peptidi, concentrandosi su quei casi in cui i due frammenti contengono la stesso numero di amminoacidi come contato dall'estremità C-terminale.
       Nota: i frammenti identici con siti di frammentazione identici danno risultati ottimali.
   12. Esaminare le trame da 2.4.11 sopra. Sia visivamente, o utilizzando uno strumento linea di tendenza nel pacchetto tracciato, identificare un gruppo di trame che sono sia lineari e di gradiente simile. Utilizzare uno o più di questi CPCP più frammenti combinazioni per la calibrazione in campioni di carne reale.
       Nota: Una trama che mostra un gradiente insolito può indicare o peptide o soppressione frammento con conseguente riduzione stre segnalength. trame non lineari possono indicare poveri rilevamento di picco o altri problemi.

3. I campioni di carne

1. Estrazione di proteine ​​da campioni di carne di destinazione
   1. Se del caso, le accise estraneo materiale non a base di carne dal campione con una spatola. Ad esempio, raschiare via sugo e la pasta da una lasagna freddo.
   2. Pesare 20 g di carne in un becher di metallo.
   3. Aggiungere 100 ml di cloruro di 0,15 M di potassio / 0,15 M di potassio tampone monofosfato a pH 6,5.
   4. Estrarre i proteine ​​miscelando la carne in un omogeneizzatore ad alta velocità per 1 min.
   5. Seguire il protocollo a partire dal punto 2.1.4 - 2.3.2.
2. Analisi dei campioni LC / MS
   1. Ripetere il passaggio 2.4.2 per acquisire i dati utilizzando il metodo / MS LC dinamica.
   2. Identificare i peptidi di ogni mioglobina carne come eseguito nella fase 2.4.3.
   3. Per la quantificazione, utilizzare il software di quantificazione per integrare le aree di picco per ogni transizione di interesse,come indicato al punto 2.4.9.
   4. Per l'identificazione delle specie in una miscela, registrare questi peptidi marcatori soddisfare criteri concordati per i numeri di transizioni e di segnalare al rumore per le transizioni.
   5. Per la quantificazione, uso integrato le aree di transizione di punta, come concordato dal punto 2.4.12 e, con percentuale in transizione area del picco, calcolare la percentuale di mioglobina dai due specie nella miscela.
   6. Utilizzare preventiva conoscenza dalla letteratura ¹⁸ della mioglobina probabili nelle carni per stimare le quantità relative w / w di due carni presenti nel campione.

Risultati

In un singolo esperimento MRM dinamico-mode ogni transizione programmata è registrata separatamente (come rivelatore conteggi per secondo, CPS) su una finestra di tempo di ritenzione specificato. Pertanto, da tutti i dati raccolti in un esperimento, l'intensità di picco per ogni transizione possono essere estratte singolarmente. Poi l'unico segnale finito è per la finestra temporale di conservazione indicato per tale transizione. Fuori della finestra, il segnale è zero per definizione. Il segnale per qualsiasi transizione, per esempio, 752 → 1269 da cavallo (peptide monoisotopico massa 1,501.66 daltons, precursore ione m / z 751.84 daltons, quota state = 2, frammento ione y ¹³⁾ ha tipicamente competere soltanto con rumore di misura e non da altri picchi di transizione che potrebbero forse essere da altre specie. L'uscita è quindi un insieme di picchi pulite, uno per la transizione, in un tempo di ritenzione comune per tali transizioni condividono uno ione precursore comune.

Figura 1 mostra l'uscita per il set di quattro transizioni 752 → (1269, 706, 248, 1366) per una miscela di 1% w / w cavallo nel settore delle carni. Dal momento che i quattro passaggi visualizzati sono associati con il cavallo, e sono assenti in campioni di puro manzo, agnello o maiale, questi picchi significano la presenza di cavallo. In base a criteri di robustezza, un insieme di due o più transizioni ciascun superiore qualche segnale specificato al livello di rumore stabilisce identificazione. Questa figura si stabilisce quindi la presenza di cavallo nella miscela di 1% w / w cavallo carni.

Occasionalmente, viene rilevata una singola transizione isolato. Questo indica una corrispondenza possibilità di precursori di ioni e un singolo frammento, possibilmente da una proteina estranea, con quelli previsti dal sistema e programmata nello spettrometro di massa. La natura singolare del picco e la sua presenza in un tempo di ritenzione inaspettato, è il SIgnature di una transizione accidentali che può essere ignorato.

L'area sotto ciascun picco transizione può essere calcolato individualmente. Sulla base di un frammento adatto, il rapporto di cavallo per aree di picco di transizione manzo, per esempio, 752 → 1269 (cavallo) a 767 → 1299 (manzo), sarà proporzionale al rapporto di carni reali nella miscela. Figura 2 mostra una appezzamento di percentuale in area di picco per questi due transizioni rispetto al peso percentuale per peso di cavallo in una miscela di cavallo con carne di manzo. Se le aree dei picchi percentuale transizione corrispondono il peso percentuale per peso di carne allora la pendenza è 1. La pendenza di questa trama è 1.03, indicando che, per queste transizioni e pair CPCP, le aree di transizione picchi danno una misura affidabile dei relativi importi dei due carni in miscela. Se la carne di cavallo nel campione era due volte più ricchi di mioglobina come manzo poi, con altri fattori invariata, la pendenza della linea sarebbe maggiore di uno.

Figura 1. intensità MRM di transizione in funzione del tempo di ritenzione per 1% w / w cavallo nel settore delle carni. Le transizioni sono 752 → (1269, 706, 248, 1366), mostrato in arancio, nero, blu e verde, rispettivamente. Il peptide marcatore è HPGDFGADAQGAMTK. I quattro frammenti di transizione possono essere denotati y ^13, y ^7, y ² e y ^14, rispettivamente, dove y ⁿ indica il conteggio in aminoacidi n dall'estremità peptide C-terminale. Il segnale di rumore che varia dai 23 ai 53 sui quattro transizioni. Una linea rossa ulteriore denota la transizione 752 → 1269 per 0% di cavallo, 100% carne bovina per il confronto. Viene visualizzata solo la regione non-zero del tempo di ritenzione. Questa cifra è stata modificata da Watson et al. ^3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Terreno di cavallo nel settore delle carni, come percento in peso per il peso, rispetto a cavallo nel settore delle carni come percentuale di transizione area del picco. La trama utilizza la coppia di peptidi di manzo (767) e cavallo (752) e la y ¹³ frammento di ioni per entrambi. Se A denota area del picco allora l'ordinata è 100 A _H / (A + _H A _B). La pendenza della retta di regressione (R ² = 0,99) è 1.03. Questa cifra è stata modificata da Watson et al. ^3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

La scelta di un adatto proteina bersaglio è importante. Una buona proteina bersaglio ha bisogno di avere corrispondenti forme in specie di interesse, sufficiente variazione di sequenza specie-dipendente, specificità di specie, ed esistono in quantità accessibili all'interno degli organismi. Per valutare le miscele che hanno subito la lavorazione (per esempio, trattamento termico), una proteina avente una sequenza relativamente immune a che l'elaborazione è desiderabile. La mioglobina è un buon candidato per carni rosse, tra cui carni rosse cotte, ma non è l'unica possibilità. Una volta che la proteina bersaglio è deciso, la parte più critica del protocollo è la proteolisi di proteine. Una proteina diversa dalla mioglobina può ben chiedere un protocollo proteolisi alternativa.

Il protocollo, come descritto include un segmento sulla base di riferimento purificata proteine. Questo mira a scoprire finestre temporali di conservazione e adatti ioni precursori e frammenti. Questo segmento è molto utile, ma non indispensabile.

Anche se corrispondenti coppie di peptidi di due specie di interesse possono essere incluso anche senza esperienza, a volte è il caso che una differenza sequenza ha conseguenze drammatiche sul profilo digestione. Ad esempio, la coppia peptide VLGFHG (manzo) e ELGFQG (cavallo) danno un risultato quantificazione anomala (manifesta come gradiente inferiore a quella della Figura 2). Questo perché quest'ultimo peptide deriva da una fenditura KE relativamente soppressa, provocando un sotto-stima del livello di cavallo nella miscela. Corrispondenti peptidi che iniziano con differenti aminoacidi sono quindi meglio evitare. Spesso i frammenti di due peptidi corrispondenti sono sequenze di amminoacidi identici e sono ben educati, ma questo non è sempre il caso e deve essere controllato durante lo sviluppo del metodo. l'identificazione delle specie è molto meno sensibile a questi problemi rispetto relativa quantificazione.

Il protocollo è stato dimostrato per quattro carni rosses ^3. Specie carne aggiuntivi possono essere inclusi, anche se la qualità della forma del picco transizione può deteriorarsi se troppe peptidi marcatori co-eluire, riducendo il tempo di permanenza e alla fine degradare stime quantificazione relativa. strumentazione migliorata, già disponibili, migliorerà questo. Un problema correlato è che non tutte le carni hanno diverse mioglobine. Ad esempio, cavallo, asino e mioglobine zebra sono identici e quindi a rigor di termini il metodo è solo in grado di rilevare a cavallo o asino o di zebra nel settore delle carni. In alcuni casi, anche se mioglobine non sono identici, alcuni peptidi chiave possono essere. Per esempio, alcuni agnello mioglobina derivato peptidi marcatori appaiono anche in capra.

Una complicazione di fronte a questo e qualsiasi altro metodo di quantificazione a base di proteine ​​è che il livello di proteina deve essere assunta costante in tutte le specie se i livelli di proteine ​​o peptidi sono di equiparare banalmente a livelli di carni in una miscela. Per mioglobina e quattro rossi mmangia questo non è universalmente vero. I livelli in generale sono specie dipendenti, con carne di maiale che espongono il livello più basso dei quattro. Inoltre, il livello mioglobina varia con carne tagliata ed età degli animali. Quindi, anche se i rapporti delle aree dei picchi di transizione mappa in modo affidabile a rapporti di mioglobina, la mappatura al rapporto di carni effettivamente è un disegno stima su ipotesi relative probabili fonti di carni nella miscela.

L'approccio descritto in questo lavoro differisce in vari modi da altri contributi pubblicati. Un percorso più tipico è quello di utilizzare metodi di proteomica per identificare i vari disparate peptidi marcatore Specie-dipendente, nel qual caso i marcatori per le diverse specie possiedono alcuna relazione particolare uno con l'altro ^8-12,14,19. Al contrario, abbiamo selezionato proteine ​​comuni a tutte le specie di interesse fino a specie dipendenti dalla sequenza varianti ^3. Oltre ad essere al centro della nostra strategia quantificazione relativa, ciò ha il vantaggio che il campionestrategie di preparazione possono essere ottimizzati. Inoltre, tali proteine ​​corrispondenti possono essere tenuti a comportarsi in modo simile, ad esempio, per l'estrazione e nella lavorazione commerciale di campioni come cucinare o conserve. l'identificazione delle specie allora normalmente procede tramite il rilevamento di peptidi marcatori disparati, mentre nell'approccio CPCP ricavato identificazione delle specie tramite il rilevamento di peptidi strettamente correlati che possiedono in genere uno o due differenze di sequenza. Infine, la quantificazione delle proteine ​​per stimare la percentuale in peso di una specie in un'altra potrebbe convenzionalmente procedere tramite quantificazione assoluta di ciascuna proteina basata separatamente su standard noti ^7,14,15. Tuttavia con il metodo CPCP vi è alcuna necessità di metodi di calibrazione. Invece, i livelli relativi sono stimati confrontando punti di forza delle due peptidi corrispondenti delle due specie di segnale, bypassando la fase di misura assoluta del tutto. Dal momento che l'obiettivo finale è una percentuale in peso di una specie in another, una quantificazione relativa, allora il CPCP è sia più diretto e più semplice di confronto tra due misurazioni assolute di quantificazione. Queste caratteristiche si traducono in tempi brevi sperimentali, previsti in circa due ore utilizzando i protocolli raffinati, rendendo la tecnica utile come strumento di sorveglianza rapida nel regno di rilevamento delle frodi alimentari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Database Uniprot	www.uniprot.org		Database liberamente accessibile di sequenze proteiche
Skyline software	www.skyline.gs.washington.edu		Software gratuito da scaricare che consente la creazione di metodi mirati per studi proteomici, peptidi e frammenti pronostico
Bicarbonato di ammonio	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Regno Unito www.sigmaaldrich.com	O9830
Metanolo, grado HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Regno Unito www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitrile, grado HPLC	Fisher Scientific, Loughoborough, Regno Unito www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Regno Unito www.sigmaaldrich.com	U5378
Tripsina (da pancreas bovino trattato con TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Regno Unito www.sigmaaldrich.com	T1426
Acido formico	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Regno Unito www.sigmaaldrich.com	F0507
Reagente per il dosaggio delle proteine Coomassie Plus	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Protein standard	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Regno Unito www.sigmaaldrich.com	P0914
Omogeneizzatore Ultra Turrax T25	Fisher Scientific, Loughoborough, Regno Unito www. fisher.co.uk	13190693
Edmund and Buhler KS10 agitatore
Heraeus Fresco 17 Centrifuga	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Centrifuga sottovuoto RC 1022	Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u cartucce polimeriche in fase inversa 60 mg/3 ml	provette Phenomenex, Macclesfield, Regno Unito	8B-S100-UBJ
4000 QTrap spettrometro di massa a triplo quadrupolo	AB Sciex, Warrington, Regno Unito Sistema LC a
1200	Agilent, Stockport, Regno Unito
XB Colonna capillare a fase inversa XB C18 (100 mm x 2,1 mm, 2,6 &;	Phenomenex, Macclesfield, Regno Unito www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 software	AB Sciex, Warrington, Regno Unito www.sciex.com		Acquisizione e analisi dei dati QTrap, inclusa l'integrazione dell'area di picco
Fiale