Articolo metodologico

Gestire le celle di Auditory HEI-OC1

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 settembre 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

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House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) è una delle poche linee cellulari uditive di topo attualmente disponibili per scopi di ricerca. Questo protocollo descrive come lavorare con le cellule HEI-OC1 per studiare gli effetti citotossici dei farmaci farmacologici e le proprietà funzionali delle proteine dell'orecchio interno.

Abstract

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HEI-OC1 è una delle poche linee cellulari uditive di topo disponibili per scopi di ricerca. Originariamente proposte come sistema in vitro per lo screening di farmaci ototossici, queste cellule sono state utilizzate per studiare le vie apoptotiche attivate da farmaci, l'autofagia, la senescenza, il meccanismo di protezione cellulare, le risposte infiammatorie, la differenziazione cellulare, gli effetti genetici ed epigenetici dei farmaci farmacologici, gli effetti dell'ipossia, lo stress ossidativo ed endoplasmatico del reticolo e l'espressione di canali e recettori molecolari. Tra gli altri importanti marcatori delle cellule ciliate cocleari, le cellule HEI-OC1 esprimono endogenamente la prestina, la proteina motore paradigmatica delle cellule ciliate esterne. Pertanto, possono essere molto utili per chiarire nuovi aspetti funzionali di questa importante proteina uditiva. Le cellule HEI-OC1 sono molto robuste e la loro coltura di solito non presenta grandi complicazioni. Tuttavia, richiedono alcune condizioni speciali come evitare l'uso di comuni cocktail antibatterici contenenti streptomicina o altri antibiotici, nonché l'incubazione a 33 °C per stimolare la proliferazione cellulare e l'incubazione a 39 °C per innescare la differenziazione cellulare. In questo articolo, descriviamo come coltivare le cellule HEI-OC1 e come utilizzarle in alcuni saggi tipici, come la proliferazione cellulare, la vitalità, la morte, l'autofagia e la senescenza, nonché come eseguire misure di patch-clamp e capacità non lineare.

Introduzione

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Casa Ear Institute-organo del Corti 1 (HEI-OC1), le cellule sono derivati ​​dal organo uditivo di un 1,2 topo transgenico. L'incubazione di una cella da questo topo transgenico a 33 ° C / 10% di CO 2 (condizioni permissive) induce l'espressione di un gene che innesca immortalare de-differenziazione e proliferazione accelerata; spostando le cellule a 39 ° C / 5% di CO 2 (condizioni non permissive) determina una diminuzione della proliferazione, differenziazione e, almeno nel caso di HEI-OC1, morte cellulare 2,3.

cellule HEI-OC1 sono stati clonati e caratterizzati nel nostro laboratorio oltre un decennio fa, e studi iniziali hanno indicato che essi esprimono specifici marcatori di cellule ciliate cocleari, come prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, ma anche i marcatori di supporto cellule come connessina 26 e recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-R) 2. Pertanto, è stato suggerito che HEI-OC1 potrebbe rappresentare un common progenitore per le cellule sensoriali e di sostegno dell'organo del Corti 2. Studi paralleli fornito una forte evidenza che archetipo farmaci ototossici come cisplatino, gentamicina e streptomicina indotto caspasi-3 attivazione in queste cellule, mentre i farmaci considerati non ototossici, come la penicillina, non 2,3. Pertanto, questa linea cellulare è stata proposta come un sistema in vitro per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella ototossicità e per lo screening del potenziale ototossicità o otoprotective di nuovi farmaci farmacologici. Si stima che le cellule HEI-OC1 sono stati utilizzati in più di centocinquanta studi pubblicati negli ultimi dieci anni.

Mentre guardando il potenziale effetto pro-apoptotico di diversi farmaci è stato l'obiettivo principale della maggior parte degli studi che coinvolgono questa linea cellulare, altri importanti processi cellulari come autofagia e senescenza hanno appena cominciato ad essere studiato in cellule HEI-OC1 4-7. iona recente studio condotto dal nostro laboratorio 8, abbiamo usato cellule HEI-OC1 per raccogliere un insieme completo di dati relativi a morte cellulare, la sopravvivenza, la proliferazione, senescenza e autofagia indotta da farmaci diversi farmacologici frequentemente utilizzate per la clinica. Abbiamo anche confrontato alcune delle risposte delle cellule HEI-OC1 con quelli da HEK-293 (cellule renali di embrioni umani) e HeLa (cellule epiteliali umane) che ricevono un trattamento identico. I nostri risultati indicano che le cellule HEI-OC1 rispondono alla ciascun farmaco in modo caratteristico, con una dose distintivo e sensibilità dipendente dal tempo per almeno uno dei meccanismi in esame. Abbiamo anche sottolineato che in studio che una corretta interpretazione dei risultati sperimentali richiederà l'esecuzione di studi paralleli con più di una tecnica 8.

In un altro studio abbiamo valutato l'uso di cellule HEI-OC1 per valutare la risposta funzionale di prestin, la proteina del motore delle cellule ciliate esterne cocleari (OHC) 9 . Abbiamo riportato citometria a flusso e studi di microscopia confocale a scansione laser sul modello di espressione prestin, così come non lineare capacità (NLC) e gli studi di bloccaggio delle cellule-patch di intere cellule HEI-OC1 coltivate a permissiva (P-HEI-OC1) e non permissive (NP-HEI-OC1) condizioni. I nostri risultati indicano che sia espressione prestin e la membrana plasmatica aumento complessivo di localizzazione in un modo dipendente dal tempo in cellule NP-HEI-OC1. È interessante notare, abbiamo anche scoperto che l'aumento di localizzazione prestin a livello della membrana plasmatica delle cellule NP-HEI-OC1 correlata con una diminuzione di Na + K + ATPasi, che translocated dalla membrana plasmatica al citoplasma, senza cambiamenti significativi nell'espressione cellulare totale. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule P-HEI-OC1 hanno un NLC robusta associata Prestin funzione motoria, che è diminuito quando la densità delle molecole Prestin presenti a livello della membrana plasmatica è aumentata. Complessivamente, questi risultati sostengono fortemente l'utilità della HEI-OC1 le cellule per indagare le proteine ​​uditive.

In questo articolo il video viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1, perché è comodo da usare cellule in crescita in condizioni permissive (P-HEI-OC1) per gli studi di citotossicità, come valutare il meccanismo / s della citotossicità indotta da farmaci e come per eseguire studi elettrofisiologici (ad esempio, patch-clamp, capacità non lineare (NLC)) per indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del OHC cocleari.

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Protocollo

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Cultura 1. cellulare

Nota: Tutti i protocolli di coltura cellulare devono essere eseguite utilizzando appropriate tecniche di coltura cellulare (per riferimento vedere i primi 3 capitoli di biologia cellulare: un manuale di laboratorio, Volume I 10). cellule HEI-OC1 non richiedono alcuna ulteriore rivestimento o il trattamento dei piatti di coltura cellulare per la corretta aderenza e la crescita. Molto importante: non utilizzare piatti bicchieri a fini di coltura cellulare; il fenotipo e la risposta biologica delle cellule ai farmaci farmacologici cambieranno (G Kalinec & F Kalinec, inedito); piatti tradizionali di coltura cellulare di plastica sono raccomandati (vedi Tabella dei materiali / attrezzature). Prestare particolare attenzione alle tecniche asettiche per evitare contaminazioni, ma mai usare antibiotici (ad esempio, ampicillina o streptomicina) con cellule HEI-OC1. Se necessario, utilizzare anfotericina B. Mentre le cellule HeLa e HEK-293 sono state usate come controllo in studi precedenti con HEI-OC1 8, qualsiasi altra linea cellulare potrebbeessere accettabile per questo scopo.

  1. Rianimazione di cellule congelate HEI-OC1
    Nota: Questo protocollo può essere utilizzato anche con altre linee cellulari della stessa topo transgenico sviluppato nel nostro laboratorio, quali OC-k3, da organo di Corti 11,12 e SV-k1, dal stria vascularis 13,14.
    1. Rimuovere una fiala di cellule HEI-OC1 crioconservati da N liquido 2, e metterlo in un bagno d'acqua a 37 ° C. Immergere solo la metà inferiore della fiala, e lasciarlo scongelare fino solo una piccola quantità di ghiaccio rimane nella fiala. Pulire l'esterno del flaconcino con il 70% di alcol.
    2. Pipettare le cellule dal flaconcino e fornire l'intero volume (~ 1,5 x 10 5 cellule / ml) lentamente, goccia a goccia, in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di un mezzo di crescita pre-riscaldato, come Modified mezzo di Eagle Dulbecco ( DMEM), integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS).
    3. Rimuovere DMSO mediante centrifugazione del tubo a 300-500 xg per 5 minuti, scartando tegli surnatante e ri-sospensione le cellule in 9 ml di terreno di coltura fresco (DMEM + 10% FBS). Disaggregare ciuffi o fogli di cellule dal flusso e riflusso delle cellule sospese, dalla pipetta al mezzo e viceversa, da tre a quattro volte con la punta della pipetta toccare il fondo della provetta.
    4. Posizionare il volume totale di cellule sospese in terreno di crescita in mm diametro 100 non trattati, piatti di plastica coltura cellulare.
    5. Incubare le cellule a 33 ° C con il 10% di CO 2 (condizioni permissive).
  2. Sottocultura di cellule HEI-OC1
    Nota: Prima di confluenza (~ 80%) le cellule devono essere portati in sospensione e sub-coltivate per impedire la cultura morire. Questo protocollo può essere utilizzato anche con altre linee cellulari sviluppate nel nostro laboratorio dallo stesso animale transgenico, come OC-k3, da organo di Corti 11,12 e SV-k1, dal stria vascularis 13,14.
    1. Rimuovere vecchi media e lavare le cellule con 2 ml di PBS.
    2. Coprire il monostrato cellulare con una soluzione di 0,25% tripsina, utilizzando 1 ml ogni 25 cm 2 di superficie. Per passare alla fase successiva più del 40% delle cellule deve essere staccato. Esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito e, se necessario, "slap o toccare" i piatti della cultura delicatamente per rilasciare eventuali cellule attaccate rimanenti.
      Nota: fare attenzione a come tripsinizzazione per lunghi periodi può causare la morte delle cellule; non è sufficiente e le cellule trasferito sarà insufficiente per gli studi previsti.
    3. Risospendere le cellule, seguendo la procedura descritta al punto 1.1.3, e trasferirli in una provetta conica da 15 ml.
    4. Centrifugare per 5 min a 300-500 xg, scartare il medium, raccogliere le cellule con terreno di coltura fresco e seme in almeno quattro da 100 mm di diametro piatti di coltura cellulare. Il numero di cellule per piatto dipenderà dalla quantità di cellule recuperate. Incubare le cellule a 33 ° C con il 10% di CO 2 (P-HEI-OC1) e dividere nuovamente il numero di volte necessariogli esperimenti in programma o per la generazione di un nuovo magazzino.
    5. Per magazzino preparazione, sostituire 100 piatti mm di diametro di 250-550 ml fiasche di coltura cellulare; per gli esperimenti, i piatti più piccoli o piatti multi-pozzi possono essere più adeguato.
    6. Per la differenziazione, incubare cellule HEI-OC1 a condizioni permissive fino a raggiungere ~ 80% di confluenza; quindi spostare i piatti a 39 ° C con 5% di CO 2 (NP-HEI-OC1) per 2 o 3 settimane.
      Nota: Le cellule saranno progressivamente smettere di proliferare e morire. Cambiare la media ogni altro giorno per rimuovere le cellule morte. A seconda del numero iniziale di cellule, di solito dopo ~ 4 settimane altri celle saranno disponibili per gli esperimenti. Differenziazione inizia non appena le cellule sono posti in condizioni NP, ma non tutte le cellule differenziare allo stesso passo. È importante sottolineare che, Prestin aumenta l'espressione e la localizzazione di membrana durante il processo di differenziazione (vedi Rappresentante dei risultati, figura 4), ​​fornendo una qualitativae un'indicazione quantitativa del livello di differenziazione.

2. Drug citotossicità Studies

Nota: le cellule HEI-OC1 coltivati ​​in condizioni permissive (P-HEI-OC1) sono raccomandate per questi studi (vedi Risultati rappresentativi, Figura 1).

  1. La vitalità cellulare (MTT Assay)
    1. Raccogliere le cellule P-HEI-OC1 seguendo la procedura descritta al punto 1.2 e le considero sia con un contatore di cellule automatica o emocitometro. Regolare la concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml.
    2. Seed le cellule su piastre da 96 pozzetti a fondo piatto chiare (100 pl per pozzetto), incubare una notte per il fissaggio al substrato, e poi trattare con i farmaci di interesse. Non dimenticare di includere gli spazi e le cellule trattate non (controllo)!
    3. Dopo il trattamento farmacologico (di solito 24 o 48 ore a 33 ° C), eseguire il test MTT seguendo il protocollo del produttore. In generale, I protocolli per questo test sono le seguenti operazioni:
      1. Aggiungere 10 ml di reagente MTT in ogni pozzetto.
      2. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 a 4 ore fino a quando porpora è visibile, e quindi aggiungere 100 ml di MTT Detergente reagente ad ogni pozzetto. Non agitare la piastra.
      3. Coprire la piastra e lasciare al buio per 2 a 4 ore a 37 ° C.
      4. Utilizzare un lettore di piastre micropiastre per misurare l'assorbanza a 570 nm di ogni pozzetto, compresi gli spazi vuoti (terreno di coltura da solo). Normalizzare i dati utilizzando la OD media in cellule di controllo al 100% della vitalità.
  2. Caspase 3/7 attivazione del test
    Nota: le cellule HEI-OC1 coltivati ​​in condizioni permissive (P-HEI-OC1) sono raccomandati per questi studi.
    1. Raccogliere le cellule HEI-OC1 seguendo la procedura descritta al punto 1.2 e le considero sia con un contatore di cellule automatica o un emocitometro. Regolare la concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml.
    2. Seme le cellule su white pareti piastre a 96 pozzetti (100 ml per pozzetto), incubare una notte per il fissaggio al substrato, e poi trattare con i farmaci di interesse. Non dimenticare di includere gli spazi e le cellule trattate non (controllo)!
    3. Dopo trattamento farmacologico (di solito 24 o 48 ore a 33 ° C), l'esecuzione del test caspasi seguente protocollo del rispettivo produttore. In generale, i protocolli per questo test sono le seguenti operazioni:
      1. Preparare i reagenti, mescolare bene, e permettere loro di equilibrare a temperatura ambiente.
      2. Rimuovere le cellule dal termostato e consentire le piastre equilibrare a temperatura ambiente.
      3. Aggiungere l'importo indicato di reagente in ogni pozzetto, facendo attenzione ad evitare la contaminazione incrociata non toccando pozzetti contenenti campioni diversi con gli stessi puntali delle pipette.
      4. Coprire la piastra e miscelare per 30 secondi utilizzando un agitatore per piastra a 300-500 giri al minuto.
      5. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un periodo di almeno 30 min. determinvia e il periodo di incubazione ottimale empiricamente. Se la temperatura ambiente varia utilizzare un incubatore a temperatura costante, perché le fluttuazioni di temperatura incideranno lettura luminescenza.
      6. Misurare luminescenza in ciascun pozzetto, e normalizzare i valori utilizzando luminescenza media in cellule di controllo al 100% di attivazione delle caspasi.
  3. La divisione cellulare (proliferazione)
    1. Raccogliere le cellule HEI-OC1 seguendo la procedura descritta al punto 1.2 e le considero sia con un contatore di cellule automatica o un emocitometro. Regolare la concentrazione di 2,0 x 10 5 cellule / ml.
    2. Seed le cellule su piastre da 96 pozzetti a fondo piatto chiare (100 pl per pozzetto), incubare una notte a condizioni permissive per il fissaggio al substrato, e poi trattare con i farmaci di interesse. Non dimenticare di includere gli spazi e le cellule trattate non (controllo)!
    3. Un'ora dopo il trattamento, aggiungere a ciascun pozzetto 1 ml di preparato BrdU 100x (5-Bromo-2'-deoxyuricenare soluzione), e restituire le piastre per l'incubatore a 33 ° C.
    4. Dopo 12, 24 e 48 ore, rimuovere il terreno esistente da corrispondenti piastre e lavare bene una volta con PBS.
    5. Eseguire il dosaggio proliferazione cellulare seguendo il protocollo del produttore. In generale, i protocolli per questo test sono le seguenti operazioni:
      1. Preparare i reagenti, compresi fissaggio / soluzione denaturazione, tampone di lavaggio, soluzione di rilevazione anticorpo primario, soluzione di rilevazione anticorpo secondario, e la soluzione di BrdU come indicato nel protocollo del produttore.
      2. Aggiungere la soluzione di fissaggio / denaturazione in ciascun pozzetto, nelle quantità indicate nel protocollo del produttore, e mantenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
      3. Rimuovere il / soluzione denaturazione di fissaggio e aggiungere l'anticorpo primario alla concentrazione indicata nel protocollo del produttore. Mantenere la piastra a temperatura ambiente per 1 ora.
      4. Rimuovere la soluzione con la formica primariaiBody, lavare la piastra 3 volte con tampone di lavaggio, e quindi aggiungere l'anticorpo secondario alla concentrazione indicata nel protocollo del produttore. Mantenere la piastra con l'anticorpo secondario a temperatura ambiente per 30 min.
      5. Rimuovere la soluzione con l'anticorpo secondario, lavare la piastra 3 volte con tampone di lavaggio, e aggiungere il substrato. Dopo 10 min di incubazione a temperatura ambiente, aggiungere la soluzione STOP. Fate attenzione: Controllare il cambiamento di colore; se la soluzione diventa molto scuro, fermare la reazione prima del tempo di sviluppo standard di 10 min.
      6. Leggere l'assorbanza a 450 nm entro 30 minuti dall'aggiunta della soluzione di stop.
  4. citotossicità
    Nota: le cellule HEI-OC1 coltivati ​​in condizioni permissive (P-HEI-OC1) sono raccomandati per questi studi.
    1. Incubare a condizioni permissive, di solito per 24-48 ore, le cellule HEI-OC1 in terreno di coltura cellulare da solo (controllo) o media più i farmaci di interesse.
    2. Alla fine del trattamento, Lavare le cellule tre volte con PBS, e staccare usando 1 ml ogni 25 cm 2 di superficie di una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per 3 min.
    3. Dopo aver staccato, raccogliere e agglomerare le cellule per centrifugazione a 3.000 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante, e macchiare le cellule per 15 minuti al buio con il reagente incluso nel test di citotossicità.
    4. Determinare il numero di cellule vive HEI-OC1 mediante citometria di flusso come indicato dal produttore del citometro a flusso.
  5. senescenza
    1. Incubare a condizioni permissive, di solito per 24-48 ore, le cellule HEI-OC1 in terreno di coltura cellulare da solo (controllo) o media più i farmaci di interesse.
    2. Determinare il numero di cellule positive senescenza associate beta-galattosidasi mediante citometria a flusso con il protocollo descritto da Debacq-Chainiaux et al. 15 o un altro metodo conosciuto per fornire risultati attendibili. Una breve protocollo per citometria a flusso è il seguente:
      1. Al termine dei trattamenti sperimentali, lavare le cellule tre volte con PBS e poi incubare con 100 nM bafilomicina A1 nel terreno di coltura per 1 ora a condizioni permissive.
      2. Aggiungere C12FDG ad una concentrazione finale di 33 pM ~, e continuare incubando le cellule per 1-2 ore.
      3. Lavare le cellule due volte con PBS, raccolto utilizzando 1 ml ogni 25 cm 2 di superficie di una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per 3 min, e li pellet per centrifugazione a 3000 xg per 5 min.
      4. Risospendere le cellule in PBS freddo e determinare il numero di cellule HEI-OC1 positivi mediante citometria di flusso, come indicato dal costruttore del citometro a flusso.
  6. L'autofagia
    1. Raccogliere le cellule HEI-OC1 controllo e fame (privi di siero per 48 ore) seguendo la procedura descritta al punto 1.2, e li elaborano per Western Blot seguenti protocolli standard. In generale, i protocolli per Western blot hanno il seguente stEPS:
      1. Seme cellule HEI-OC1 a 6 pozzetti ad una concentrazione di 1,0 x 10 5 cellule / ml. Dopo 24 e / o 48 ore, lavare le cellule con PBS ghiacciato.
      2. Lyse con 200 ml di TNESV tampone (1% NP40, 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 2mM EDTA, 1 mM Na 3 VO 4) con cocktail di inibitori delle proteasi e 1 mm PMSF per 5 minuti in ghiaccio.
      3. Raccogliere le cellule (raschiando il fondo di ciascun pozzetto), trasferimento in provette da microcentrifuga e centrifugare a 16.800 xg per 5 minuti a 4 ° C.
      4. Raccogliere il surnatante e quantificare la concentrazione di proteine ​​utilizzando il BCA Assay.
      5. Aggiungere loading buffer 5x e 1 mM DTT a ciascun campione e far bollire per 5 minuti per denaturare le proteine.
      6. Eseguire i campioni utilizzando SDS-PAGE su un gel 4-12%, e il trasferimento alle membrane PVDF.
      7. Bloccare le membrane con 5% nonfat latte in polvere in TBS-T con 0,1% Tween 20 per 60 minuti a RT.
      8. Incubare le membrane notte a 4 ° C con ant primariaibodies.
      9. Il giorno dopo, lavare le membrane a lungo con TBS-T, e incubare con anticorpi IgG secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) (1: 1.500) per 1 ora.
      10. Rilevare immunoreattività con un sistema di rilevazione chemiluminescenza (ECL). Normalizzare i livelli di espressione di proteine ​​utilizzando GAPDH (1: 2.000 in TBS-T con in 10% senza grassi latte in polvere) di serie.
    2. Nelle Western blots studiare l'espressione di almeno due diversi marcatori di autofagia come Beclin-1 e LC3B (di solito a 1: 1000 diluizione in TBS-T con 2,5% BSA). Non dimenticate di guardare per un controllo di espressione della proteina come GAPDH o actina.
    3. Valutare l'espressione della proteina di interesse mediante densitometria utilizzando uno scanner Blot digitale o software per computer, come pubblico dominio NIH immagine o ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/).

3. Esperimenti di elettrofisiologia con le cellule HEI-OC1

  1. celle harvesting
    Nota: usare le cellule in crescita in 100 mm di diametro piatti della cultura al 50% -80% di confluenza. Tripsina, Accutase, soluzione priva di enzimi, o p hosphate- b uffered s Aline + e thylene d iamine t Etra un acido CETIC (PBS-EDTA) può essere utilizzato per il sollevamento delle cellule senza effetti significativi sul numero e la qualità dei gigaseals . In alcuni casi, tuttavia, il trattamento tripsina rende le cellule più fragili. In questi casi, permettono alle cellule di recuperare per circa 30 minuti prima di iniziare gli esperimenti.
    1. Lavare le cellule due volte con 10 ml di PBS senza Ca 2+ e Mg 2+.
    2. Aggiungere 2 ml di una soluzione distaccatore privo di enzima, come soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica, e incubare i piatti per 3 min a 37 ° C con 5% di CO 2.
    3. Utilizzare un microscopio invertito per controllare il distacco delle cellule. Se necessario, spostare il cell la cultura piatto per staccare più celle, ma farlo con delicatezza.
      Nota: Non agitare il piatto.
    4. Aggiungere 10 ml di DMEM + 10% FBS e pipetta le cellule delicatamente su e giù cinque volte con una pipetta da 10 ml.
    5. Guarda le cellule al microscopio. Se> 80% delle cellule sono già separata (single), non sono necessarie ulteriori pipettaggio. Se le cellule sono ancora in cluster, ripetere la pipettando gentilmente fino a più di 80% di cellule sono singole.
    6. Posizionare i ~ 10 ml di cellule sospese in un tubo da 15 ml, centrifugare per 2 min a 100 xg, e scartare il surnatante.
    7. Utilizzare ~ 200 ml di soluzione di registrazione esterno (media L-15 di Leibovitz regolato a 305-310 mOsm con acqua distillata) per risospendere le cellule. Un controllo ottico delle celle dovrebbe mostrare molti, singole cellule rotonde con bordi lisci membrana.
  2. Patch-clamp e Misure NLC
    1. Eseguire patch-clamp e le misure di voltaggio-dipendenti non lineare capacità (NLC) utilizzando unamplificatori dequate e software, così come le tecniche elettrofisiologiche standard. Come uso soluzione interna (intrapipette) 150 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 0.1 mM EGTA, 2 mM ATP-Mg, 0,1 mM GTP-Na, e 10 mm HEPES; aggiustare il pH a 7,2 con Tris.
    2. Sotto il microscopio, selezionare una singola, cellula sana, con tondo e bordi lisci membrana. Fissare la punta della pipetta di vetro alla superficie delle cellule e verificare la resistenza della membrana. Questo dovrebbe essere di circa 3-6 megaohm, corrispondente ad un diametro interno (ID) della punta della pipetta di ~ 2 micron.
    3. Premere delicatamente la punta micropipetta contro la membrana plasmatica delle cellule e quindi applicare il vuoto. Una porzione della membrana cellulare sarà aspirata nella pipetta, generando una resistenza elettrica dell'ordine di 10 - 100 gigaOhms (gigaseal).
    4. Stabilire la condizione di tutta la cellula interrompendo la membrana plasmatica con impulsi di aspirazione.
    5. Utilizzare cellule che non esprimono prestin, come HEK-293, come controllo 9.
      Nota: le risposte attuali devono essere filtrati a 5 kHz, e le correzioni fatte per gli effetti della resistenza serie residua. Tutto raccolta dei dati e la maggior parte delle analisi possono essere eseguite utilizzando il software di solito in dotazione con gli amplificatori lock-in. Funzione di capacità può essere montata la derivata prima di una funzione di Boltzmann due stati relativa carica non lineare alla tensione della membrana 16.

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Risultati

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In un paio di pubblicazioni recenti abbiamo riportato una serie completa di studi volti a valutare la risposta delle cellule HEI-OC1 a diversi farmaci farmacologici comunemente usati, nonché indagare la funzione prestin 8,9. In questi studi abbiamo fatto uso di tutti i protocolli descritti nelle sezioni precedenti.

Uno dei risultati di questi studi precedenti era che le cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni non pe...

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Discussione

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In questo rapporto viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1 e li usiamo per valutare i meccanismi di citotossicità indotta da farmaci e di indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del cocleare OHC. Le modalità tecniche, tuttavia, sono abbastanza generali da essere facilmente adattato ai diversi studi.

Tutti i protocolli descritti richiedono il corretto uso di tecniche di coltura cellulare consolidate 10. Come con qualsiasi altra linea cellula...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse esistenti o potenziali.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01-DC010146 e R01-DC010397. Il suo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HEI-OC1TUTTI I KIT DI ANALISI, LE ATTREZZATURE 
Cabina di sicurezza biologica di classe IIL'azienda BakerSterilgard IIIE LE AZIENDE INDICATE NELLA
Centrifuga refrigerataEppendorf5810RPRECEDENTI 2 COLONNE SONO SOLO
Microscopio invertitoZeissAxiovert 25ESEMPI, E QUALSIASI ALTRO PRODOTTO SIMILE
BAGNOMARIAStovallHWB115POTREBBE ESSERE UTILIZZATO.
Contatore di celluleNexcelomCellometro Auto T4
Due (2) incubatori di cellule, uno a 33 gradi; C/10% CO2 e altro a 39 gradi C/5% CO2Forma Scientific3110
Piastre per colture cellulari, PS, 100 mm x 20 mm con prese d'ariaGreinier Bio-One664-160
Piastre per colture cellulari, PS,  60 mm x 15 mm con prese d'aria Greiner Bio-One628160
Cellstar fiasche per colture tissutali 250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar fiasche per colture tissutali 550 mlGreiner Bio-One660-175
Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti, con coperchio-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Piastra per colture tissutali, 96 pozzetti, fondo piatto con coperchioBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 pozzetti, bianco, fondo trasparenteGreiner Bio-One655098
50 ml Tubo conico in polipropilene con tappo CellstarsBecton Dickinson 352070
Provette coniche in polipropilene da 15 ml con tappo-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7,4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Siero fetale bovino (FBS) HycloneSH10073.1
L-15 Medium di Leibovitz, senza rosso fenoloGibco/Invitrogen21083-027
Tripsina, 0,25% Life Technologies25200-056
Kit di test di proliferazione cellulare TACS MTTTrevigen4890-25-K
Kit di test Caspasi-Glo 3/7Promega G8091 
Kit per il test di proliferazione cellulare BrdU Cell Signaling6813
Soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica Sigma-AldrichC5789
Kit per il test di citotossicità verde Cell-ToxPromega  G8741 
Strumento FACSAriaIII BD Bioscienze  FACSAriaIIICon eccitazione a 488 nm (laser blu)
Scanner digitale per blotLI-CORC-DiGit
Unità di elettroforesi e blottingHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Lettore di piastre con software Soft Max Pro 5.2Molecular DevicesSpectraMax 5
Amplificatore patch-clampHEKAEPC-10
Estrattore per la preparazione elettrodi patchSutter InstrumentsP-97
Cellule A

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Coltura cellulareSaggio di proliferazioneSaggio di vitalitPatch clampCapacitanza non lineareEspressione della prestinaCitometria a flussoIncubazione a temperatura controllataDifferenziamento cellulare

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