Articolo metodologico

Gestire le celle di Auditory HEI-OC1

DOI:

10.3791/54425

⸱

3 settembre 2016

 ,  ,  , 
1Head and Neck Surgery, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

In questo articolo

Sommario

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House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) è una delle poche linee cellulari uditive di topo attualmente disponibili per scopi di ricerca. Questo protocollo descrive come lavorare con le cellule HEI-OC1 per studiare gli effetti citotossici dei farmaci farmacologici e le proprietà funzionali delle proteine dell'orecchio interno.

Abstract

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HEI-OC1 è una delle poche linee cellulari uditive di topo disponibili per scopi di ricerca. Originariamente proposte come sistema in vitro per lo screening di farmaci ototossici, queste cellule sono state utilizzate per studiare le vie apoptotiche attivate da farmaci, l'autofagia, la senescenza, il meccanismo di protezione cellulare, le risposte infiammatorie, la differenziazione cellulare, gli effetti genetici ed epigenetici dei farmaci farmacologici, gli effetti dell'ipossia, lo stress ossidativo ed endoplasmatico del reticolo e l'espressione di canali e recettori molecolari. Tra gli altri importanti marcatori delle cellule ciliate cocleari, le cellule HEI-OC1 esprimono endogenamente la prestina, la proteina motore paradigmatica delle cellule ciliate esterne. Pertanto, possono essere molto utili per chiarire nuovi aspetti funzionali di questa importante proteina uditiva. Le cellule HEI-OC1 sono molto robuste e la loro coltura di solito non presenta grandi complicazioni. Tuttavia, richiedono alcune condizioni speciali come evitare l'uso di comuni cocktail antibatterici contenenti streptomicina o altri antibiotici, nonché l'incubazione a 33 °C per stimolare la proliferazione cellulare e l'incubazione a 39 °C per innescare la differenziazione cellulare. In questo articolo, descriviamo come coltivare le cellule HEI-OC1 e come utilizzarle in alcuni saggi tipici, come la proliferazione cellulare, la vitalità, la morte, l'autofagia e la senescenza, nonché come eseguire misure di patch-clamp e capacità non lineare.

Introduzione

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Casa Ear Institute-organo del Corti 1 (HEI-OC1), le cellule sono derivati ​​dal organo uditivo di un 1,2 topo transgenico. L'incubazione di una cella da questo topo transgenico a 33 ° C / 10% di CO 2 (condizioni permissive) induce l'espressione di un gene che innesca immortalare de-differenziazione e proliferazione accelerata; spostando le cellule a 39 ° C / 5% di CO 2 (condizioni non permissive) determina una diminuzione della proliferazione, differenziazione e, almeno nel caso di HEI-OC1, morte cellulare 2,3.

cellule HEI-OC1 sono stati clonati e caratterizzati nel nostro laboratorio ol....

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Protocollo

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Cultura 1. cellulare

Nota: Tutti i protocolli di coltura cellulare devono essere eseguite utilizzando appropriate tecniche di coltura cellulare (per riferimento vedere i primi 3 capitoli di biologia cellulare: un manuale di laboratorio, Volume I 10). cellule HEI-OC1 non richiedono alcuna ulteriore rivestimento o il trattamento dei piatti di coltura cellulare per la corretta aderenza e la crescita. Molto importante: non utilizzare piatti bicchieri a fini di coltura cellulare; il fenotipo e la risposta biologica delle cellule ai farmaci farmacologici cambieranno (G Kalinec & F Kalinec, inedito); piatti tradizionali di coltura cellu....

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Risultati

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In un paio di pubblicazioni recenti abbiamo riportato una serie completa di studi volti a valutare la risposta delle cellule HEI-OC1 a diversi farmaci farmacologici comunemente usati, nonché indagare la funzione prestin 8,9. In questi studi abbiamo fatto uso di tutti i protocolli descritti nelle sezioni precedenti.

Uno dei risultati di questi studi precedenti era che le cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni non pe.......

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Discussione

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In questo rapporto viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1 e li usiamo per valutare i meccanismi di citotossicità indotta da farmaci e di indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del cocleare OHC. Le modalità tecniche, tuttavia, sono abbastanza generali da essere facilmente adattato ai diversi studi.

Tutti i protocolli descritti richiedono il corretto uso di tecniche di coltura cellulare consolidate 10. Come con qualsiasi altra linea cellula.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse esistenti o potenziali.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01-DC010146 e R01-DC010397. Il suo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
HEI-OC1TUTTI I KIT DI ANALISI, LE ATTREZZATURE 
Cabina di sicurezza biologica di classe IIL'azienda BakerSterilgard IIIE LE AZIENDE INDICATE NELLA
Centrifuga refrigerataEppendorf5810RPRECEDENTI 2 COLONNE SONO SOLO
Microscopio invertitoZeissAxiovert 25ESEMPI, E QUALSIASI ALTRO PRODOTTO SIMILE
BAGNOMARIAStovallHWB115POTREBBE ESSERE UTILIZZATO.
Contatore di celluleNexcelomCellometro Auto T4
Due (2) incubatori di cellule, uno a 33 gradi; C/10% CO2 e altro a 39 gradi C/5% CO2Forma Scientific3110
Piastre per colture cellulari, PS, 100 mm x 20 mm con prese d'ariaGreinier Bio-One664-160
Piastre per colture cellulari, PS,  60 mm x 15 mm con prese d'aria Greiner Bio-One628160
Cellstar fiasche per colture tissutali 250 mlGreiner Bio-One658-175
Cellstar fiasche per colture tissutali 550 mlGreiner Bio-One660-175
Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti, con coperchio-CellstarGreiner Bio-One657-160
Microtest Piastra per colture tissutali, 96 pozzetti, fondo piatto con coperchioBecton Dickinson353072
Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 pozzetti, bianco, fondo trasparenteGreiner Bio-One655098
50 ml Tubo conico in polipropilene con tappo CellstarsBecton Dickinson 352070
Provette coniche in polipropilene da 15 ml con tappo-CellstarsGreiner Bio-One188-271
PBS pH 7,4 (1x) Life Technologies10010-023
Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)Life Technologies11965-084
Siero fetale bovino (FBS) HycloneSH10073.1
L-15 Medium di Leibovitz, senza rosso fenoloGibco/Invitrogen21083-027
Tripsina, 0,25% Life Technologies25200-056
Kit di test di proliferazione cellulare TACS MTTTrevigen4890-25-K
Kit di test Caspasi-Glo 3/7Promega G8091 
Kit per il test di proliferazione cellulare BrdU Cell Signaling6813
Soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica Sigma-AldrichC5789
Kit per il test di citotossicità verde Cell-ToxPromega  G8741 
Strumento FACSAriaIII BD Bioscienze  FACSAriaIIICon eccitazione a 488 nm (laser blu)
Scanner digitale per blotLI-CORC-DiGit
Unità di elettroforesi e blottingHoeferSE300 miniVE
Spectra Max 5 Lettore di piastre con software Soft Max Pro 5.2Molecular DevicesSpectraMax 5
Amplificatore patch-clampHEKAEPC-10
Estrattore per la preparazione elettrodi patchSutter InstrumentsP-97
Cellule A

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
  2. Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....

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