Articolo metodologico

Trapianto nel Mouse Pad ovarico Fat

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DOI:

10.3791/54444

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7 settembre 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un test trapianto pad moda ovarico adatto per studi di epiteli normali e trasformate del tratto riproduttivo femminile. Il cuscinetto adiposo del mouse consente il trapianto di grandi frammenti di tessuto, è facilmente accessibile per la chirurgia e di imaging, e fornisce l'ambiente nativo più favorevole per i tessuti di origine mulleriano.

Abstract

I saggi di trapianto ortotopico nei topi sono preziosi per gli studi sulla rigenerazione cellulare e la trasformazione neoplastica. Gli approcci comuni per il trapianto ortotopico di epiteli della superficie ovarica e delle tube includono la somministrazione intraperitoneale e intrabursale di cellule. I rispettivi limiti di questi metodi includono una posizione mal definita delle cellule iniettate e un volume di spazio limitato. Inoltre, sono poco adatti per la conservazione strutturale a lungo termine degli organi trapiantati. Per affrontare queste sfide, abbiamo sviluppato un approccio alternativo, che si basa sull'introduzione di cellule e frammenti di tessuto nel cuscinetto adiposo del topo. Il cuscinetto adiposo ovarico di topo si trova nelle immediate vicinanze dell'ovaio e della tuba uterina (noto anche come ovidotto, tuba di Falloppio) e fornisce un microambiente familiare per le cellule e i tessuti di questi organi. Nel nostro approccio, le cellule di topo e umane marcate con fluorescenza e i frammenti della tuba uterina vengono innestati utilizzando un intervento chirurgico di incisione dorsale minimamente traumatico. Le cellule trapiantate e le loro escrescenze si trovano facilmente nel cuscinetto adiposo ovarico per oltre 40 giorni. Il trapianto a lungo termine dell'intera tuba uterina consente la corretta conservazione di tutti i principali componenti tissutali e non provoca effetti collaterali avversi, come fibrosi e infiammazione. Il nostro approccio dovrebbe essere applicabile in modo univoco per rispondere a importanti questioni biologiche come il differenziamento, il potenziale rigenerativo e neoplastico di specifiche popolazioni cellulari. Inoltre, dovrebbe essere adatto per studi sui fattori microambientali nel normale sviluppo e nel cancro.

Introduzione

saggi di trapianto, che comportano l'introduzione di cellule e tessuti in specifici siti corporei nei topi, rappresentano un approccio essenziale per studi di rigenerazione dei tessuti e carcinogenesi. trapianti ortotopico di cellule, cioè, il loro posizionamento in un ambiente nativo, sono particolarmente importanti per la caratterizzazione delle cellule staminali adulte. L'esistenza di cellule staminali mammarie è stato suggerito dal trapianto di frammenti della ghiandola mammaria epiteliali mammarie in cuscinetti di grasso senza ghiandole di topi 1. Saggi di attecchimento a topo umanizzato grasso pad 2 sono stati usati per ricapitolare lo sviluppo rigenerativo potenzialità e normale della mammella primario cellule epiteliali umane. Inoltre, trapianti di diluizione seriali e limitanti di tipi di cellule fenotipicamente distinte nel cuscinetto di grasso mammaria eliminato sono stati cruciali per testare la capacità di auto-rinnovamento e la differenziazione multilineare delle cellule staminali mammarie 3-5. saggi di trapianto in combinatione con la traccia lignaggio genetico fornito prove della cella di origine nella carcinogenesi mammaria 5. Trapianti di rene capsula sono comunemente usati per testare le proprietà delle cellule staminali putativo della prostata 6. Il trapianto ortotopico di topo normale e neoplastica e organoidi pancreatico umano ha rivelato geni e percorsi alterati nella progressione del cancro 7. L'importanza dell'ambiente nativo è stata sostenuta anche dalla dimostrazione di diverse rigenerazione dopo engraftments delle ghiandole sudoripare in diverse località, quali cuscinetti di grasso mammarie, cuscinetti di grasso spalla, e la pelle di nuovo 8.

La cavità peritoneale e la borsa ovarica di solito vengono utilizzati come luoghi per il trapianto ortotopico di cellule epiteliali del tratto riproduttivo femminile 9-12. Entrambi questi metodi hanno una serie di limitazioni. iniezione intraperitoneale di cellule porta alla loro implantologia in diverse aree della cavità peritoneale, così complicating monitorare la crescita cellulare. Inoltre, le variazioni del microambiente, come ad esempio il grado di vascolarizzazione, innervazione e la rappresentazione delle cellule immunitarie, possono essere molto significativo in diverse aree della cavità peritoneale. La borsa ovarica ha un volume molto limitato, consentendo iniezione di non più di 10 ml di liquido. Ciò limita notevolmente la quantità di cellule che può essere somministrata. Inoltre, le iniezioni nella borsa ovarica può essere molto tecnicamente impegnativo e la procedura richiede una notevole quantità di tempo.

Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sfruttato le proprietà ovarici cuscinetto adiposo. Il cuscinetto adiposo ovarico mouse è dotato di una grande dimensione, è adiacente l'ovaio e il tubo uterino, ed è facilmente raggiungibile da un intervento chirurgico. E 'stato riportato che trofoblasto equina può essere trapiantato nel mouse pad grasso ovarico 13. Tuttavia i dettagli di questo metodo non sono stati descritti. Non è stato riportato anche se questo miThOD possono essere applicati a cellule adulte e tessuti. Qui, descriviamo un metodo affidabile per il trapianto di mouse e cellule umane del tratto riproduttivo femminile e dimostrare che questo metodo è applicabile anche a trapianto d'organo a lungo termine.

Protocollo

Tutto il lavoro in vivo descritto viene approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa Cornell University.

1. Preparativi di esempio per ovariche Fat Pad Assays

  1. Isolamento e la coltura di primaria Tubal Epitelio Cells (TE)
    1. Euthanize donatore da 6 a 8 settimane di età vergine di β-actina-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) o rosso fluorescente delle proteine ​​(DsRed) topi β-actina Discosoma-by CO 2 amministrazione seguita da dislocazione cervicale. Verificare l'eutanasia di successo da un pizzico dito del piede.
    2. Posizionare un mouse individuo su un telo assorbente, ventrale rivolta verso l'alto, e quindi pulire l'addome con il 70% di etanolo. Aprire la pelle facendo una incisione laterale alla linea mediana del corpo e con le dita tirare la pelle sopra e sotto l'incisione verso la testa e la coda del mouse.
    3. Tenere il peritoneo con pinze smussato e fare un taglio con le forbici sottili per aprire la cavità del corpo. Spingere delicatamente la bobina del intestindi e da parte e di individuare gli organi riproduttivi.
    4. Con una pinza sottile prendere un corno uterino e tagliare 0,5 cm sopra il punto in cui le corna uterine separano. Tenendo premuto il corno uterino, sezionare via il tessuto connettivo attaccato al corno uterino, tuba uterina, cuscinetto adiposo ovaie e alle ovaie. Posizionare tratto riproduttivo sezionato in un piatto con 6 ml sterile tampone fosfato (PBS). Procedere con il secondo tratto riproduttivo.
    5. Trasferire il piatto per un armadio biosicurezza e lavare i tessuti per 3 volte in 6 ml di PBS sterile. Continuare il lavoro al microscopio dissezione situato nel cabinet biosicurezza. Afferra il corno uterino con le pinzette sottili e scollegare il corno uterino dal tubo uterino tagliando a livello della giunzione utero-tubarica. Tagliare la borsa ovarica che circonda l'ovaio utilizzando un ago da 25 G.
      Nota: Dopo la borsa ovarica è stato rimosso, la dissezione è completa e il tubo uterino individuo rimane nella soluzione PBS.
    6. Trasferire un single tuba uterina in una goccia 50 ml di PBS per un piatto di 3,5 cm e usa mezzi in pezzi 0,1 mm con 28 aghi di calibro. Trasferimento a 200 buffer di digestione microlitri 1 (modificato (DMEM) F12 Eagle Dulbecco () medio di Ham integrato con 300 unità ml -1 collagenasi, 100 unità ml -1 ialuronidasi) e incubare per 1 ora a 37 ° C in un CO 5% 2 incubatore.
    7. Dopo l'incubazione, aggiungere l'acido tripsina-Ethylenediaminetetraacetic 1 ml 0,25% (EDTA) e sospendere la soluzione con l'aiuto di un puntale 1 ml (aka blu punta) 20 volte per 3 minuti. Aggiungere 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 media (Ham) contenente 2% di siero fetale bovino.
    8. Raccogliere i tessuti per centrifugazione (600 RCF, 5 min, temperatura ambiente (RT)), e aggiungere 1 ml di tampone di digestione 2 (DMEM F12 () medio di Ham integrato con 7 mg ml -1 dispasi II e 10 mg ml -1 Deoxyribonuclease I ( DNasi I)). Sospendere il tessuto pellet 20 volte con l'aiuto di una pipetta ti 1 mlp.
    9. Aggiungere 5 ml di siero terreno di coltura del mouse tube epitelio completo libero (M-TE-GM, tabella 1).
    10. Raccogliere le cellule per centrifugazione (600 RCF, 5 min, RT). Aggiungere 1 ml di M-TE-GM, sospendere e contare le cellule da emocitometro. Seme 1 x 10 5 cellule in 1 ml per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti partire fissaggio e incubare a M-TE-GM a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per 4 giorni.
    11. Cambiare la media ogni giorno.
    12. Preparare sospensioni singola cella di cellule in coltura di sospensione primario TE dai topi beta-actina-EGFP o β-actina-DsRed.
      1. Raccogliere TE colture in sospensione da 24 pozzetti bassi di attacco. Centrifuga (600 RCF, 5 min, RT), e sospendere pellet cellulari con 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA. Incubare per 10 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
      2. Interrompere l'attività tripsina con l'aggiunta di 5 ml DMEM / F12 media (Ham) contenente il 5% di siero fetale bovino. Raccogliere pellet cellulari mediante centrifugazione (600 RCF, 5 min, RT).
    13. pellet cellulari lavare due volte con 4 ml di PBS freddo (4 ° C), aggiungere 1 ml di PBS per pellet cellulare, e sospendere. Contare le celle da emocitometro e trasferire a 1,7 ml tubi centrifugazione. Lavorando su ghiaccio, aggiungere 1 x 10 5 cellule per 10 microlitri di PBS, quindi aggiungere matrice membrana basale 10 ml. Sospendere e trasportare sul ghiaccio per la stanza degli animali.
      Nota: Eseguire tutte le dissezione e il tessuto di lavoro la cultura in un armadio biosicurezza in condizioni sterili.
  2. Preparazione di Immortalata linea cellulare umana
    1. Separatamente crescere lentivirus-EGFP e -mCherry etichettato immortalato lineHIO118 cellule dell'epitelio ovarico umano superficie fino a 80-90% di confluenza su 10 piatti cm a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%.
    2. Lavare i piatti due volte con 10 ml di PBS, aggiungere 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA per ogni piatto e incubare per 10 minuti a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml DMEM / F12 media (Ham) contenente il 5% di siero fetale bovino. Collezionarepellet cellulari mediante centrifugazione (600 RCF, 5 min, RT).
    3. pellet cellulari lavare due volte con 10 ml di PBS freddo (4 ° C), aggiungere 1 ml di PBS per pellet cellulare, e sospendere. Contare le celle da emocitometro e trasferire a 1,7 ml tubi centrifugazione.
    4. Lavorando su ghiaccio, aggiungere 1,0 x 10 6 cellule Lenti-mCherry etichettati + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP etichettato cellule per 10 ml di PBS. Aggiungere matrice membrana basale 10 ml. Sospendere e trasportare sul ghiaccio per la stanza degli animali.
  3. Preparazione della tuba uterina
    1. Sezionare tube uterine individuali da 6- a 8 settimane di età topi vergini β-actina-DsRed in PBS come descritto nei passaggi 1.1.1-1.1.5. Trasferire tubi singoli uterine in una goccia 200 ml di PBS al microscopio di dissezione. srotolare delicatamente salpingi con l'aiuto di pinzette e 28 aghi calibro rimuovendo il mesosalpinge, una porzione del legamento largo che supporta i segmenti del tubo uterino. Posizionare singoli tube uterine srotolò in una goccia di 200 ml ghiacciata PBS fino cuscinetto adiposo ovarico del destinatario è esposto e preparati a ricevere il trapianto.

2. ovarico Fat Pad Trapianti

Nota: disinfettare gli strumenti tra ogni intervento chirurgico animale. Preparare e organizzare tutte le attrezzature in anticipo. trapianti dorsali al cuscinetto adiposo ovarico destra sono preferenziale come questo evita la milza. Tuttavia, i destinatari possono avere trapianti in entrambi i cuscinetti di grasso ovariche.

  1. Utilizzare topi singenici o grave topi immunodeficienza combinata (SCID / NCR) come destinatari di cellule primarie. Per le cellule umane, come ad esempio le cellule HIO118, / SCID / gamma topi uso Nod (GFN) o topi SCID.
  2. Anestetizzare topo ricevente con una singola iniezione intraperitoneale di 2,2,2-tribromoethanol alla dose di 0,15 ml / 10 g di peso corporeo. Posto l'animale su una piastra elettrica, nella cappa animale e confermare il corretto anestesia da perdita di pedale riflesso (pinch tep). Applicare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza, mentre ilanimale è sotto anestesia. Iniettare il sottocutanea animale con l'analgesico ketoprofene alla dose di 4 mg / g di peso corporeo per trattare per il dolore post-operatorio.
    Nota: In alternativa, utilizzare isoflurano per l'anestesia. Posto l'animale in camera di induzione e regolare il flussometro di ossigeno a 0,8-1,5 L / min e il vaporizzatore isoflurano al 2-3%. Rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera, lasciate respirare isoflurano da una maschera e impostare il flussometro di ossigeno a 0,4-0,8 L / min e il vaporizzatore isoflurano al 1,5%, quindi avviare l'intervento chirurgico.
  3. Radere l'area chirurgica con # 40 Clippers; rimuovere i capelli da una zona 2 volte l'area chirurgica, preparare la pelle rasata con tre scrub antisettico di povidone-iodio, seguito da etanolo al 70%, e coprire con un telo sterile.
  4. Spostare l'animale sotto un microscopio dissezione situato in un armadio biosicurezza. Esporre il tratto riproduttivo da un'incisione nella posizione dorsomediale direttamente al di sopra del cuscinetto adiposo ovarico.
    Nota: Critical step: Precise incisione cutanea favorisce la guarigione della ferita, l'uso di un bisturi è raccomandato nel passo 2.4.
  5. Utilizzando una pinza sottile smussato tirare il cuscinetto adiposo ovarico con attenzione attraverso l'incisione verso la linea mediana, riducendo al minimo i danni ai nervi e vasi sanguigni principali.
    Passo fondamentale: se si verifica il sanguinamento, fermare l'intervento chirurgico e prendere in considerazione il trapianto a un altro animale ospite.
  6. Sotto il controllo del microscopio dissezione con l'aiuto di un ago calibro 28 smussato fare una incisione profonda 2-4 mm nel cuscinetto adiposo ovarico, 3-4 mm sopra l'ovaio.
    passaggio fondamentale: Assicurarsi che l'incisione va solo attraverso la metà del cuscinetto adiposo; puntura tutto il percorso attraverso il lato inferiore provoca perdite. Essere rapidi e procedere senza indugio dopo questo passaggio.
  7. Per i trapianti di cellule, riempire una siringa (ago da 30 gauge) con 10-20 ml della cellula-membrana basale matrice della miscela e iniettare l'incisione cuscinetto adiposo. Per il trapianto di tuba uterina, prendere l'ingegno tubo uterinoh pinza sottile e posto in 10 - matrice di membrana basale di 20 ml tenuti in ghiaccio. Utilizzando un 0.1-10 / 20 ml XL è laureato punta filtro (accorciata di 3 mm) prendere il tessuto e membrana basale sospensione matrice e rilasciare nell'incisione cuscinetto adiposo.
  8. Attendere 5 minuti per la matrice membrana basale a solidificare e posizionare il tratto riproduttivo di nuovo nel peritoneo. Chiudere i muscoli con 2 stiches di sutura chirurgica e la pelle con due clip piccola ferita o sutura chirurgica.
  9. Ripetere i passaggi 2,4-2,8 per trapiantare una membrana PBS-interrato matrice miscela nel cuscinetto adiposo contra-laterale dell'animale che servirà come controllo.
    passaggio fondamentale: Dopo l'intervento chirurgico posto l'animale su una piastra elettrica, perché la perdita di calore è rapida nei topi anestetizzati.
  10. Lasciate animale recuperare su una piastra elettrica nella gabbia nativo e osservare l'animale fino a quando completamente sveglia dall'anestesia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere sternal prona. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
  11. Mettere una manciata di pellet cibo pre-umido all'interno della gabbia in aggiunta al cibo secco sulla gabbia dopo l'intervento chirurgico. Applicare analgesici post-chirurgica, se necessario, per i prossimi giorni ed esaminare la ferita quotidiano. Applicare gli antibiotici secondo il protocollo approvato animale in caso di infezione della ferita. Rimuovere clip ferita 10 giorni dopo l'intervento quando la ferita è completamente chiuso.

3. Istologia e Image Acquisition

  1. Graft raccolta e conservazione
    1. Preparare la soluzione paraformaldeide 4% miscelando 26 ml DDH 2 O con 4 ml 10x PBS e soluzione di paraformaldeide 10 ml 16%.
    2. Sezionare in un unico blocco, il pad innestato ovarico grasso, ovaio, tube uterine, 0,5 centimetri utero come descritto nei passaggi 1.1.1-1.1.4. Porre immediatamente in 2 ml di paraformaldeide al 4% e fissare per 2 ore, a temperatura ambiente. Dal stesso animale, sezionare il non-innestatocontrolaterale sistema cuscinetto adiposo ovarico trapiantato con PBS-interrato miscela matrice di membrana come controllo (vedi punto 2.9). Fix e processo nello stesso modo.
    3. Dopo lavaggio fissaggio dei tessuti tre volte con PBS per 5 minuti e incubare una notte in PBS a 4 ° C.
    4. Per tutto il montaggio di immagini del cuscinetto adiposo ovarico procedere al punto 3.2.1.
      Nota: Dopo che i tessuti di acquisizione di immagini possono essere congelati (3.3.1) o trattati per paraffina (3.3.2). notte di incubazione in saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C migliora la qualità dei tessuti congelati.
  2. Acquisizione dell'immagine
    1. Posto tutto il montaggio ovariche sistemi cuscinetto adiposo in piatti PBS pieni e immagine utilizzando un microscopio invertito dotato di attaccamento epi-fluorescenza e telecamera a colori ad alta definizione, con 4, 10x obiettivi, e uno stereomicroscopio dotato di un allegato di fluorescenza, telecamera a colori e Piano Apo 1xWD70, obiettivi ED Piano 1.5xWD45.
  3. Istologia
    1. A seguiretutto il montaggio di acquisizione delle immagini (3.2.1) Mettere una goccia 200-500 ml di mezzo di inclusione per i campioni di tessuto congelato su un 2 x 1 cm pezzo di pellicola di laboratorio e l'utilizzo di pinze, di trasferire il tessuto al calo. Sollevare il film al un bordo e trasferire la caduta dei tessuti-media per un ml Fiala criogenico 1.8. Chiudere la fiala ed immergersi in azoto liquido. Conservare tessuti congelati a -80 ° C.
    2. In alternativa, procedere con l'incorporamento di paraffina standard. Utilizzare 20-40 volumi di volume del tessuto per ogni passaggio.
      1. Immergere i tessuti una volta nel 65% di etanolo per 30 minuti, agitando delicatamente a temperatura ambiente.
      2. Immergere i tessuti una volta in etanolo al 70% per 30 minuti, agitando delicatamente a temperatura ambiente. In questa fase i campioni possono essere conservati per mesi a temperatura ambiente.
      3. Immergere tessuti volta in etanolo al 90% per 30 minuti, agitando delicatamente a RT.
      4. Immergere tessuti volta in etanolo al 95% per 30 minuti, agitando delicatamente a RT.
      5. Immergere tessuti due volte in etanolo assoluto (200 proof) per 30 minuti, agitando delicatamente a RT.
      6. Immergere tessuti due volte in cloroformio per 30 minuti, agitando delicatamente a temperatura ambiente.
      7. Immergere i tessuti una volta in paraffina per 30 minuti, agitando delicatamente a 58 ° C.
      8. Immergere i tessuti una volta in paraffina per 12 ore, scuotendo delicatamente a 58 ° C.
      9. Immergere i tessuti una volta in paraffina per 3 ore, a 58 ° C.
      10. Mettere i tessuti in stampi di metallo istologia e riempire stampi con 58 ° C di paraffina. Aggiungere una cassetta istologia plastica sulla parte superiore della paraffina e raffreddare paraffina a +4 ° C. Estrarre blocco di paraffina-tessuto e conservare a temperatura ambiente.
        Nota: Temperatura di paraffina non deve superare i 58 ° C per la conservazione ottimale del tessuto adatto per la colorazione immunoistochimica.
    3. In alternativa, Preparati per la paraffina con il campione di elaborazione del gel.
      1. Aspirare il PBS e il trasferimento dei tessuti tutto il montaggio al 70% di etanolo. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore. In un bagno d'acqua, campione preriscaldamento elaborazione gel a 60 ° C.
      2. Pipette 200 ml di gel di elaborazione campione sul una capsula di Petri laboratorio di cinema-allineati. Uso di pinze dissezione multa trasferire l'intero sistema di montaggio dei tessuti per la caduta di gel di trattamento dei campioni.
      3. Lasciare la spina gel trattamento dei campioni solidificare a temperatura ambiente, o solidificare la spina per 10 min a 4 ° C.
      4. Posizionare il tessuto incorporato gel di trattamento dei campioni in cassette di tessuto istologia inserita tra imbottiture biopsia. Incorpora in paraffina come nei passaggi 3.3.2-3.3.2.10.
        Nota: Procedura sul campione gel incorporamento previene la perdita e permette la conservazione di piccoli campioni di tessuto fragile.
        Nota: I tessuti conservati per congelamento o paraffina sono adatti per la colorazione immunoistochimica 14,15.

Risultati

Cellule e tessuti sperimentali possono essere trapiantate precisione nel cuscinetto adiposo ovarico sotto un microscopio di dissezione (Figura 1). Gli esempi includono il mouse primario cellule epiteliali delle tube derivate da topi che esprimono ubiquitariamente EGFP (Figura 2A) o DsRed (Figura 2B) e le cellule umane immortalate superficie ovarica epiteliali HIO118 16,17 cellule marcate con mCherry e EGFP lentivirus (Figura 2C - F). L'approccio è applicabile anche per il trapianto a lungo termine di organi, come il tubo del mouse uterina (Figura 3). Secondo la colorazione immunoistochimica, sia ciliato (FOXJ1 positivo 14) e cellule (15 PAX8 positivo) di secrezione sono conservati nell'epitelio delle tube di tessuti trapiantati (Figura 3D ed E).

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Figura 1:. Ovarica Fat Pad Trapianti (A) area esposta del trapianto (freccia). (B) L'incisione è fatta da un 28 ago G (freccia). (C) UT / seminterrato matrice membrana miscela attecchimento dalla punta della pipetta (freccia). (D) UT innestati (freccia, rosso brillante, UT di topi-DsRed β-actina). FP, cuscinetto di grasso; Ov, ovaio; UT, tube uterine. Barra di scala = 2 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2:. Rilevamento di trapiantati principale del mouse cellule Tubal epitelio umano Immortalized ovarico superficie Epitelio cellule (A, B) Out crescite di topo primaria cellule epiteliali delle tube (frecce) di topi β-actina-EGFP (A, verde) e beta-actina-DsRed (B, rosso) 8 giorni dopo il trapianto in un topo singenici. (C, D) Engraftments di cellule miste HIO118 (frecce) etichettati sia con Lenti-EGFP (verde) o Lenti-mCherry (rosso) 10 giorni dopo il trapianto in topi NSG. (D) Area ingrandita da (C, freccia). (E, F) Graft sviluppato 43 giorni dopo il trapianto delle stesse cellule come in C, D di topo SCID (frecce). AD, F, fluorescenza; E, in campo chiaro, FP, cuscinetto di grasso; Ov, ovaio; UT, tube uterine. (A, B, DF) Barra di scala = 500 micron; (C) Scala bar = 1,600 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Caratterizzazione di uterino tubo trapianto. (A) tuba uterina completa (freccia) di β-actina-DsRed del mouse 6 giorni dopo il trapianto nel cuscinetto adiposo ovarico (freccia, rosso brillante). (B) sezione congelata fluorescente del cuscinetto adiposo con trapianto mostrato in (A). Rosso, DsRed; Blu, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) di contrasto nucleare. (C) tubo uterino innesto (freccia) 40 giorni dopo il trapianto in NSG del mouse ricevente (freccia). sezione di paraffina. Nota corretta conservazione di tutti i componenti del tubo uterina principali, e la mancanza di fibrosi trapianti associati e infiammazione. Colorazione ematossilina-eosina. (D, E) di rilevamento di marcatori epitelio tubarica associati-box gene 8 (PAX8) e la scatola Forkhead J1 (FOXJ1; colore marrone nucleare, punte di freccia) nelle cellule del trapianto (frecce) mostrate in ( C). Sistema dell'immunoperossidasi. Controcolorazione con verde metile. FP, cuscinetto di grasso; Ov, ovaio; UT, tube uterine. (A) Barra di scala = 1.000 micron; (B) Barra di scala = 200 micron; (CE) Scala bar = 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Componente 1x DMEM F12 media (Ham)
L-glutammina 2 mm
pruvate sodio 1 mM
fattore di crescita epidermico 10 ng ml -1
Base fattore di crescita dei fibroblasti-2 10 ng ml -1
idrocortisone 500 ng ml -1
Insulina 5 mg ml -1
Transferrin 5 mg ml -1
selenite di sodio 5 ng ml -1
albumina bovina 0,10%
Penicillina / streptomicina 100 unità ml -1 / 100 mg ml -1
Media Aquila (MEM) acidi minimi essenziali non essenziali 0,1 mm
Beta-mercaptoethanol 10 -4 M

Tabella 1:. Mouse Tubal Epithelim di crescita a medio (M-TE-GM) i componenti elencati nella colonna di sinistra vengono sciolti in 1x DMEM F12 media (Ham) alle concentrazioni indicate, colonna di destra. La composizione media finale è di siero libero.

Discussione

Abbiamo stabilito un saggio trapianto cuscinetto adiposo ovarico che permette la consegna accurata e la rilevazione di cellule e tessuti epiteliali. La procedura di trapianto di test cuscinetto adiposo ovarico è tecnicamente meno impegnativo rispetto a iniezione intrabursal 10-12 e consente una più uniforme e precisa posizione delle cellule trapiantate rispetto a iniezione intraperitoneale 9. E 'anche adatto per il trapianto a lungo termine di un intero organo, come il tubo uterino.

È importante sottolineare che il cuscinetto di grasso ovarico fornisce un microambiente familiare per epiteli del sistema riproduttivo femminile. Dovrebbe essere particolarmente adatto per studi sulle proprietà molecolari e cellulari della ovarico umano e mouse e cellule dell'epitelio tubarico durante la rigenerazione e la trasformazione maligna. A differenza di altri organi, pochi studi si sono concentrati sull'identificazione e caratterizzazione di cellule staminali nel epiteli della R femminiletratto eproductive 18,19. Tali studi sono di particolare importanza in quanto molti tumori si ritiene che provengono da cellule staminali adulte 20. Eppure origini cellulari di tumori ovarici epiteliali rimangono molto discutibile 18. Tumori ovarici epiteliali rappresentano la maggior parte dei tumori ovarici ed è al 5 ° posto tra tutti i decessi per cancro correlati di donne negli Stati Uniti 21. Così sviluppo di un test ortotopico con diversi vantaggi rispetto alle tecniche di trapianto esistenti 9-12 dovrebbe facilitare notevolmente studi in questo campo.

Data la posizione superficiale del cuscinetto adiposo ovarico, piccoli sistemi di imaging animale possono essere utilizzati per seguire su engraftments etichettato con una forte fluorescenza o reporter bioluminescenti. Inoltre dovrebbe essere possibile stabilire test di imaging minimamente invasivi ad alta risoluzione in tempo reale, come la microscopia non lineare 22. Il cuscinetto adiposo ovarico può essere mantenuto anche in colture d'organo, consentono in tal modoing coltura tridimensionale di epiteli normali e neoplastici in condizioni riassumono vicino l'organizzazione delle cellule e la matrice extracellulare. Gli studi futuri dovrebbero affrontare queste possibilità promettenti.

Diversi passaggi critici devono essere considerati. Fornire una piastra elettrica e tenere roditori caldo durante l'intervento chirurgico migliora notevolmente il tasso di sopravvivenza. La sterilità degli strumenti di gestione del cuscinetto adiposo assicura che i sistemi trapiantate sono mantenuti sterili. Nella nostra esperienza, i risultati significativi sanguinamento in ritardo nella crescita dei trapianti. È importante sottolineare che il grasso pad incisione dovrebbe essere fatto proprio perché strappare il cuscinetto adiposo o pungere attraverso cause di sanguinamento. Coagulanti dovrebbero essere utilizzati per fermare l'emorragia, se necessario. Se engraftments non sviluppano, dovrebbe essere considerata una maggiore concentrazione di cellule iniettate. I primi escrescenze di successo possono essere osservati fin da una settimana dopo il trapianto e più engraftments dovrebbe essere visibilemese dopo la procedura. Per il trapianto, aghi con diametro maggiore (23-25 ​​G) possono essere usati per prevenire tranciatura di grandi cellule (oltre 10 micron di diametro). Tuttavia, tali aghi possono essere più traumatica per l'cuscinetto adiposo ed il loro uso dovrebbe essere testato in anticipo. Per i nostri esperimenti abbiamo utilizzato topi donatore e ricevente vecchi 6-8 settimane. Per entrambi gli scopi topi più giovani o più anziani possono essere utilizzati. Tuttavia, il numero di cellule iniettate può essere necessario regolare. dovrà anche essere considerata la dimensione più piccola di cuscinetti di grasso ovariche nei donatori più giovani.

Come con qualsiasi metodo, ci sono alcune limitazioni del grasso ovarico test trapianto di tappetino per il mouse. Anche se i topi immuno-competenti singenici possono essere utilizzati per murini primari cellule / tessuti, la nostra tecnica richiede NSG o topi SCID per il trapianto di materiale umano. E 'probabile possibile umanizzare il cuscinetto di grasso per sostenere la crescita delle cellule epiteliali umane. Tuttavia, non abbiamo ancora testato questo approccio. L'utilizzo di più giovane femaschi possono portare a costi di allevamento più bassi; tuttavia, maturi topi femmina vergine (età 8 a 10 settimane) hanno un cuscinetto adiposo più grande, consentendo in tal modo il trapianto di esemplari più grandi. Infine, il personale di laboratorio dovrebbero essere addestrati in chirurgia degli animali per garantire la tempestiva esecuzione e di successo della procedura.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dott Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center, per la fornitura di cellule umane HIO118. Questi studi sono stati supportati da sovvenzioni dal New York Stem Cell Programma (NYSTEM; T028095) e National Institutes of Health / Istituto Nazionale di Child Health e lo Sviluppo Umano (P50HD076210) per AFN, e dalle sovvenzioni dal NYSTEM (C028125, C024174 e T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) e il Fondo Ovarian Cancer Research (327.516) per AYN.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Ago calibro 25BD Becton Dickinson305122
ago calibro 28 (siringa ipodermica con ago collegato)Kendall30339Numero del pezzo: fattore di
crescita di base dei fibroblasti 8881500014-2Sigma-AldrichF9786
(Geltrex)InvitrogenA1413202
β-actina-DsTopi rossiIl laboratorio Jackson6051B6. Topi Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-actina-EGFPThe Jackson Laboratory3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-mercaptoetanoloSigma-AldrichM7522
albumina bovinaSigma-AldrichA3311
cloroformioVWREM-CX1058-1
collagenasi/ialuronidasiStem Cell Tecnologie7912
fiale criogenicheThermo Scientific Nunc377267
dispase IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM's)Corning10-092-CV
DNaseI (desossiribonucleasi I)Stem Cell Technologies7900
terreno di inclusione per campioni di tessuto congelato (O. C. T.)Sakura Finetek 4583
fattore di crescita epidermicoSigma-AldrichE4127
etanolo 200 provaKoptecV1001per preparare il 70% 
siero fetale bovinoSigmaF4135
punta filtrante 0,1-10/20 &; l XL USA Scientific1120-3810
FOXJ1 anticorpoeBioscienceE10109-1632utilizzato a concentrazione 1:1.000 (senza smascheramento)
idrocortisoneSigmaH0135
KetoprofeneZoetis4396H
film di laboratorio (Parafilm M)American National CanPM-999
L-GlutamminaCorning25-005-Cl
insulina-transferina-selenito di sodioSigma-AldrichI884
isoflurano, 250 mlSanta Cruz Animal Healthsc-363629Rx
piastra di attacco bassa a 24 pozzettiCostar3473
MEM aminoacidi non essenzialiCorning25-025-Cl
stampi per istologia metallica Scienzemicroscopia elettronicaMicroscopio 62527-22
NikonEclipse TS 100invertito
, mouse stereoNikonSMZ800
Nod/SCID/gamma (NSG)The Jackson Laboratory05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
soluzione di paraformaldeide al 16%Microscopia elettronica Sciences15710
paraffina (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
PAX8 anticorpoProteintech10336-1-APutilizzato alla concentrazione 1:1.000 (senza smascheramento)
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Corning  21-030-CV
penicillina streptomicinaCorning30-002-Cl
immunodeficienza combinata grave (SCID/NCr) topi, background BALB/C)NCI-Frederick Animal Production Program01S11
piruvato di sodioCorning25-000-Cl
campioni (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
saccarosioSigma-AldrichS0389
tripsina-EDTA, 25%Corning25-053-Cl
Matrice della membrana basale della , microscopio gel per la lavorazione dei

Riferimenti

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