Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Sommario

Qui, vi presentiamo un protocollo per ottenere adattativa evoluzione laboratorio di microrganismi in condizioni che utilizzano la cultura chemostat. Inoltre, l'analisi genomica del ceppo evoluto è discusso.

Abstract

L'evoluzione naturale coinvolge la diversità genetica come il cambiamento ambientale e una selezione tra piccole popolazioni. L'evoluzione di laboratorio adattiva (ALE) si riferisce alla situazione sperimentale in cui l'evoluzione viene osservata utilizzando organismi viventi in condizioni controllate e fattori di stress; Gli organismi sono quindi artificialmente costretti a fare cambiamenti evolutivi. I microrganismi sono soggetti a una varietà di fattori di stress nell'ambiente e sono in grado di regolare alcune proteine inducibili dallo stress per aumentare le loro possibilità di sopravvivenza. Le mutazioni spontanee presenti in natura provocano cambiamenti nel genoma di un microrganismo che influiscono sulle sue possibilità di sopravvivenza. L'esposizione a lungo termine alla coltura chemostataria provoca un accumulo di mutazioni spontanee e rende dominante il ceppo più adattabile. Rispetto ai metodi di trasferimento di colonie e di trasferimento seriale, la coltura di chemostat comporta il maggior numero di divisioni cellulari e, quindi, il maggior numero di popolazioni diverse. Sebbene la coltura chemostatica per l'ALE richieda dispositivi di coltura più complicati, è meno laboriosa una volta iniziata l'operazione. Le analisi comparative genomiche e del trascrittoma del ceppo adattato forniscono indizi evolutivi su come i fattori di stress contribuiscano alle mutazioni che superano lo stress. L'obiettivo del presente articolo è quello di accelerare l'evoluzione dei microrganismi in condizioni di laboratorio controllate.

Introduzione

I microrganismi possono sopravvivere e di adattarsi ad ambienti diversi. Sotto stress grave, l'adattamento può avvenire attraverso l'acquisizione di fenotipi benefici da mutazioni genomiche casuali e la successiva selezione positiva ^1-3. Pertanto, le cellule microbiche in grado di adattarsi cambiando metabolica o reti di regolazione per una crescita ottimale, che viene definito "l'evoluzione adattativa". Recenti importanti tendenze microbici, come focolai di superbatteri e la comparsa di ceppi microbici resistenti, sono strettamente correlate a adattivo evoluzione in condizioni di stress. In condizioni di laboratorio definite, siamo in grado di....

Protocollo

1. Preparazione dell'apparecchiatura

1. Ottenere un barattolo chemostat (150-250 ml) o una beuta (250 ml) contenente una luce di ingresso ed una luce di uscita. Collegare le porte con tubo in silicone che consente portate di 10-100 ml / h. Facoltativamente, utilizzare una presa d'aria, una porta di uscita dell'aria, e le porte di ingresso e uscita a temperatura controllata.
2. Ottenere un dispositivo adatto per il barattolo chemostat che prevede l'agitazione e la temperatura di controllo (o utilizzare un incubatore agitazione rotante).
3. Ottenere due pompe peristaltiche per erogare mezzo fresco e raccogliere la cultura. <....

Risultati

Per l'alta-succinato adattamento stress, la wild-type E. coli W3110 ceppo è stato coltivato in un chemostato a D = 0,1 hr ^-1 per 270 giorni (figura 2).

Figura 2: High-succinato sforzo di adattamento di E. coli W3110 con la cultura chemostat. frecce sottili indicano l'ora in cui è stata aumentata la concentrazione di st.......

Discussione

I microrganismi sono in grado di adattarsi a quasi tutti gli ambienti a causa del loro rapido tasso di crescita e la diversità genetica. Adaptive evoluzione di laboratorio permette di evolvere microrganismi in condizioni progettati, che fornisce un modo di selezionare gli organismi individuali harboring mutazioni spontanee che sono favorevoli nelle condizioni date.

La tecnica chemostat è più robusto per realizzare evoluzione artificialmente guidato di tecniche di trasferimento per i seguenti.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fermentatore mini-chemostat	Biotron Inc.	-	prodotto con
un tubo in silicone	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	le dimensioni del tubo possono essere variate a seconda del tasso di diluizione e delle dimensioni del vaso del fermentatore.
vaso serbatoio	Bellco	Media bottiglia di conservazione	20 L
sostanze chimiche	Sigma-Aldrich-reagente		grado
glucosio	Sigma-Aldrich	G5767	reagente ACS
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434	per la biologia molecolare, adatto per la coltura cellulare, ≥ 99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	reagente ACS, ≥ 99%
Na2HPO4· 2H2O	Sigma-Aldrich	4272	98,5-101%
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488	reagente ACS, ≥ 99%
MgSO4· 7H2O	Sigma-Aldrich	230391	reagente ACS, ≥ 98%
CaCl2	Sigma-Aldrich	793639	reagente ACS, ≥ 96%
tiamina· Grado di reagente HCl	Sigma-Aldrich	T4625	, ≥ 99%
Na2· succinato· 6H2O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥ 99%

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