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Articolo metodologico

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

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⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

9 settembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto presenta un metodo di stampaggio ad iniezione di progettare microvasi che ricapitolano le proprietà fisiologiche di endotelio. Il processo di microfluidica-based crea reti vascolari brevetto 3D con condizioni tailorable, come il flusso, composizione cellulare, la geometria, e gradienti biochimici. Il processo di fabbricazione ed esempi di possibili applicazioni sono descritte.

Abstract

In piattaforme vitro per studiare le cellule endoteliali e biologia vascolare sono in gran parte limitati a colture di cellule endoteliali 2D, il flusso camere con polimeri o substrati di vetro a base, e saggi di formazione del tubo di idrogel a base. Questi test, mentre informativo, non ricapitolano la geometria del flusso luminoso, matrice extracellulare corretta, e la vicinanza multicellulare, che svolgono un ruolo chiave nel modulare la funzione vascolare. Questo manoscritto descrive un metodo di stampaggio ad iniezione per generare navi ingegnerizzate con diametri dell'ordine di 100 micron. Microvasi sono fabbricati da semina cellule endoteliali in un canale microfluidica incorporato all'interno di un tipo nativo collagene idrogel. Incorporando cellule parenchimali all'interno della matrice di collagene prima di incanalare la formazione, microambienti tessuti specifici possono essere modellati e studiati. Ulteriori modulazioni di proprietà e dei media idrodinamica composizione consentono il controllo della funzione vascolare complessa all'interno del microambiente desiderato.Questa piattaforma permette lo studio del reclutamento perivascolari cellule, interazioni sangue-endotelio, risposta flusso, e le interazioni microvascolotessutali. microvasi Engineered offrono la possibilità di isolare l'influenza da singoli componenti di una nicchia vascolare e precisamente controllare i suoi chimiche, meccaniche e biologiche per studiare biologia vascolare sia in salute e malattia.

Introduzione

Il microcircolo in ogni organo aiuta a definire il microambiente del tessuto, mantenere l'omeostasi tissutale e regolare l'infiammazione, la permeabilità, la trombosi, e fibrinolisi 1,2. Endotelio microvascolare, in particolare, è l'interfaccia tra il flusso di sangue e di tessuto circostante e svolge quindi un ruolo fondamentale nella modulazione vascolare e la funzione degli organi in risposta a stimoli quali forze idrodinamiche e citochine circolanti e ormoni 3 - 5. La comprensione delle interazioni approfondite tra l'endotelio, sangue e il microambiente tessuto circostante è importante per lo studio della biologia vascolare e la progressione della malattia. Tuttavia, i progressi nello studio di queste interazioni è stato ostacolato dalla limitata in vitro strumenti che non ricapitolano nella struttura microvascolare vivo e funzionano 6,7. Come risultato, il campo e il progresso terapeutico è affidato molto costoso e tempo-consumare modelli animali, che spesso non riescono a tradurre in successo negli esseri umani 8 - 10. Mentre modelli in vivo sono preziosi nello studio dei meccanismi di malattia e funzioni vascolari, sono complessi e spesso non preciso controllo dell cellulari, biochimici e biofisici spunti.

Vascolarizzazione in tutto il corpo possiede una struttura gerarchica maturo in collaborazione con letti capillari espansive, fornendo perfusione ottimizzato e trasporto dei nutrienti simultaneamente 11. Inizialmente, le forme vascolarizzazione come un plesso primitiva che riorganizza a una rete ramificata gerarchicamente durante lo sviluppo precoce 12,13. Sebbene molti dei segnali coinvolti in questi processi sono ben comprese 14 - 16, rimane elusiva come tale modello vascolare viene determinato 15. A sua volta, ricapitolando questo processo in vitro per progettare reti vascolari organizzate ha apen. Molte piattaforme difficili esistenti in vitro per modellare vascolare, come due colture di cellule endoteliali dimensionali, mancano caratteristiche importanti quali la vicinanza multicellulare, tre geometria tridimensionale luminale, flusso, e la matrice extracellulare. Saggi del tubo di formazione in idrogel 3D (collagene o di fibrina) 17 - 19 o invasione saggi 20,21 sono stati utilizzati per studiare la funzione endoteliale in 3D e le loro interazioni con altri vascolari 17,22 o di cellule del tessuto tipo 23. Tuttavia, assemblati lumen in questi saggi mancano di interconnessione, il flusso emodinamico, e perfusione adeguata. Inoltre, la propensione per la regressione vascolare in questi saggi formazione del tubo 24 impedisce coltura a lungo termine e maturazione che limita il grado di studi funzionali che possono essere eseguite. Pertanto, vi è la necessità crescente di progettare piattaforme in vitro di reti microvascolari che possono opportunamente modellare itendoteliale caratteristiche e sono capaci di coltura a lungo termine.

Una varietà di tecniche di ingegneria vascolari sono emerse nel corso degli anni per le applicazioni mediche per sostituire o vasi di bypass colpite nei pazienti con malattia vascolare. Vasi di grande diametro realizzati con materiali sintetici come il polietilene tereftalato (PET), e politetrafluoroetilene (ePTFE) hanno avuto un notevole successo terapeutico con termine pervietà a lungo (in media il 95% pervietà oltre 5 anni) 25. Anche se piccolo diametro innesti sintetici (<6 mm) in genere affrontare complicazioni quali iperplasia intimale e trombopoiesi 26 - 28, di ingegneria tessutale innesti di piccolo diametro realizzati con materiale biologico hanno compiuto progressi significativi 29,30. Nonostante i progressi di questo genere, vasi ingegnerizzati su microscala sono rimaste una sfida. Per modellare adeguatamente il microcircolo, è necessario generare modelli di rete complessa con sufficiente resistenza meccanica a mantenere la pervietà e con una composizione matrice che permette sia permeazione nutrienti per le cellule parenchimali e rimodellamento cellulare.

Questo protocollo rappresenta una rete di vasi romanzo artificiale perfusable che imita un nativo in vivo impostazione con un sintonizzabile e controllabile microambiente 31 - 34. Il metodo descritto genera microvasi ingegnerizzate con diametri dell'ordine di 100 micron. microvasi Engineered sono fabbricati mediante perfusione cellule endoteliali attraverso un canale microfluidica che è incorporato all'interno di tipo morbido collagene idrogel. Questo sistema ha la capacità di generare reti di fantasia con struttura luminale aperto, replicare le interazioni multi-cellulari, modulare la composizione della matrice extracellulare, e applicare fisiologicamente rilevanti forze emodinamiche.

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Protocollo

1. Microfabbricazione di Patterned Polidimetilsilossano (PDMS) con Network Design

  1. Wafer creare un modello negativo del Design Network
    1. Creare un modello di rete utilizzando qualsiasi software per computer-aided design (CAD). Assicurarsi che la dimensione diagonale tra ingresso e uscita corrisponde alla distanza tra i serbatoi di ingresso e di uscita dei dispositivi di alloggiamento a passi successivi (vedi 2.1.1).
      Nota: Il disegno del modello stesso è personalizzato a seconda degli obiettivi di ricerca specifiche dell'utente (si veda la Figura 1 per segni di esempio).
    2. Genera una maschera del modello di rete utilizzando la stampa ad alta risoluzione o ordinare un fotomaschere cromato da un fornitore commerciale. Un protocollo più dettagliata del processo di fotolitografia è disponibile altrove 35.
    3. Pulire un wafer di 8 "di silicio per 5 minuti a 100 W con trattamento al plasma di ossigeno.
    4. Versare abbastanza fotoresist negativo (SU-82.100 funziona bene) sul wafer tale che la forma resist un ciuffo con diametro di 2,5 cm. Utilizzando un dispositivo a induzione rotazione, far girare il wafer a 500 rpm con 100 rpm rampa / sec e mantenere per 10 sec. Poi rampa fino a 1.600 rpm con 300 giri / sec e mantenere per 30 sec. Nota: La velocità e la rampa deve essere ottimizzato per ogni condizione di laboratorio per dare uno spessore di 150 pm resistere.
    5. Soft-bake il wafer a 65 ° C per 7 minuti, rampa fino a 95 ° C a 360 ° C / hr, e mantenere per 45 min. Lentamente raffreddare a temperatura ambiente su piastra calda. Imprimere il modello di nave sul wafer rivestito da esposizione a 365 nm luce UV sotto un fotomaschera cromato, con tripla esposizione quella della raccomandazione del produttore (350 mJ / cm 2 per uno spessore SU-8 di circa 150 micron).
      Nota: Poiché SU-8 è resistere ad un negativo, le regioni esposte (tutto tranne il modello di progettazione) diventerà insolubile per lo sviluppatore nel passaggio 1.1.7.
    6. Duro-cuocere il wafer esposta a 65° C per 5 min e rampa fino a 95 ° C a 360 ° C / ora e mantenere per 25 minuti, poi lasciar raffreddare lentamente verso RT sulla piastra calda.
    7. Immergere il wafer di SU-8 sviluppatore per 10 - 15 minuti per lavare via impressionate resistere, poi pulire con alcool isopropilico e asciutto sotto un flusso di azoto compresso. Controllare il motivo sotto un microscopio ottico per garantire la SU-8 resist è ben aderenti al wafer (cercare peeling indesiderati e bolle).
    8. Misurare lo spessore delle funzioni di ripetizione utilizzando un profilometro secondo le istruzioni del produttore 36. Durante l'acquisizione di misura, evitando regioni della struttura che sono essenziali per la funzione di rete (cioè, ingresso e condotti di uscita) come un profilometro contatto basato possano compromettere l'integrità strutturale delle caratteristiche modellata sul wafer. In alternativa, utilizzare un metodo senza contatto (vale a dire, profilometro ottico) per evitare questo problema del tutto.
  2. Generazione di modellato e Flat Stampo da collagene Molding
    Nota: maneggiare silani all'interno di una cappa.
    1. Posizionare il wafer in un essiccatore con 100 ml di tricloro (3,3,3-trifluoropropyl) silano per 2 ore al silanizzata superficie.
    2. Trasferimento wafer silanizzata in un 120 x 120 mm quadrati capsula di Petri. Versare agente misto e de-gasati PDMS elastomero e polimerizzazione (10: 1 w / w ratio) sul wafer per ottenere 4 - 6 mm di spessore. Versare PDMS aggiuntivi in ​​un 120 x 120 mm quadrati Petri piatto separato per generare forme piatte, senza modelli. Polimerizzare a 65 ° C per 2 ore.
    3. Togliere dal forno e lasciare il PDMS raffreddare a temperatura ambiente. Usando un bisturi con attenzione tagliare un quadrato attorno al SU-8 e lentamente staccare lo stampo PDMS dal wafer. Tagliare i bordi a 30 mm x 30 mm. Per stampi piane, taglio PDMS curata senza un pattern impresso in pezzi quadrati di circa 40 mm x 40mm.

2. Dispositivi Housing

  1. fabricationi di superiore e inferiore dell'alloggiamento Pezzi
    1. Realizzare abitazioni vaso utilizzando poli (metilmetacrilato) (PMMA). Per fabbricare, ordinare i pezzi da un negozio di macchina standard con il computer numerici capacità di fresatura a controllo (CNC). Nella figura 1 uno schema delle parti superiore e inferiore.
    2. Progettare la piece alloggiamento superiore (Figura 1D) per includere da 20 mm x 20 mm e sul lato inferiore del dispositivo con una profondità di 1 mm, due fori di iniezione di collagene (diametro 4 mm) sulla parte superiore del dispositivo si trova in corrispondenza degli angoli del quadrato ben, due serbatoi entrata e di uscita con diametro di 6 mm, e quattro fori (3 mm di diametro) ai quattro angoli del dispositivo.
      Nota: fori supplementari possono essere praticati sulla periferia del pezzo per scopi di manipolazione.
    3. Progettare il pezzo alloggiamento inferiore (Figura 1E) per includere un foro quadrato al centro (Dimensioni 15 mm x 15 mm) con un circostanti di 25 mm x 25 mmmensola con una profondità di 0,25 mm. Drill 4 fori per le viti con 4-40 thread. Assicurarsi che i fori per le viti nella parte inferiore e superiore pezzi si allineano insieme durante le future fasi di montaggio.

3. microvasi fabbricazione di dispositivi

  1. Preparazione dei Materiali
    1. Lavare e autoclave due serie di pinzette, una spatola in acciaio inossidabile, un piccolo cacciavite piatto, viti in acciaio inox, e parecchi perni di centraggio in acciaio inox. Per la fabbricazione dei vasi, autoclave anche PDMS micropatterned stampi, PDM piazze piatte, vetrini (22 x 22 mm), e pezzi di cotone.
    2. Sterilizzare i pezzi abitative PMMA in candeggina per almeno 1 ora, quindi risciacquare con acqua autoclavato nella cappa coltura tissutale due volte, e lasciare asciugare all'aria in piatti di coltura tissutale sterile (150 mm x 25 mm).
  2. Sterile Polyethyleneimine-glutaraldeide (PEI - GA) Rivestimento
    1. Trattare pozzi interni di pezzi PMMA secco sterilizzaticon plasma per circa 1 min. Aggiungere 1% Polyethyleneimine (PEI) sui pozzi interni (20 mm quadrati e sulla parte superiore e la mensola piazza 25 millimetri sul fondo) dei pezzi PMMA per 10 min. Risciacquare con sterili H 2 O e lasciare asciugare nel cappuccio coltura di tessuti.
      Nota: Il tempo necessario per il trattamento al plasma è variabile a seconda del dispositivo utilizzato - PEI deve diffondersi facilmente indica una superficie idrofila. In caso contrario, il trattamento al plasma supplementare può essere necessario.
    2. Applicare 0,1% glutaraldeide (GA) su PEI superfici dei pezzi PMMA trattata per 30 min. Sciacquare due volte con acqua sterile e lasciare asciugare.
      Nota: Nei passaggi futuri, collagene aderirà alla superficie rivestita con reticolazione collagene-glutaraldeide. Ciò consente di proteggere il gel in posizione all'interno del dispositivo durante future fasi di montaggio e durante il periodo di coltura dispositivo.
  3. Collagene Gel di Preparazione
    1. Realizzare le navi che utilizzano 0,6% - 1% del collagenesoluzioni. Per rendere il collagene 0,75% per la fabbricazione nave, di tipo mix collagene soluzione di riserva (1,5% - isolati da ratto code 37) con idrossido di sodio (NaOH), 10x media Supplement (M199), e mezzi di coltura cellulare. Mantenere tutte le soluzioni su ghiaccio.
    2. Determinare il volume di collagene dalla seguente equazione, dove V ƒinal è il volume finale di gel richiesto (tipicamente, 1 ml di collagene per dispositivo è sufficiente), V stock collagene è il volume di magazzino collagene necessario, C archivio di collagene è la concentrazione dello stock collagene, collagene e C ƒinal è la concentrazione desiderata del collagene nel recipiente.
      figure-protocol-1
    3. Utilizzare una siringa da 1 ml di trasferire il volume appropriato di magazzino collagene per un nuovo 30 ml tubo conico. Determinare i volumi della neutralizzazione NaOH (V NaOH), M199 10x mezzi supplemento(V 10 X), e mezzi di coltura cellulare (V 1 X) come segue e miscelare separatamente in un tubo da 15 ml:
      figure-protocol-2
    4. Aggiungere la miscela dei reagenti neutralizzanti (V 10 X, V NaOH, V 1 X) al collagene aliquotati e utilizzare una piccola spatola per mescolare lentamente la soluzione fino ad ottenere un gel omogeneo. Evitare l'introduzione di bolle mescolando lentamente e delicatamente.
    5. Per incorporare celle nella matrice alla concentrazione desiderata (ad esempio, 0,5 - 20 milioni di cellule / ml), aggiungere le cellule alla soluzione di collagene dopo averlo miscelato con i reagenti di neutralizzazione, e continuare a mescolare fino a quando le cellule sono omogeneamente distribuiti.
    6. Quando vengono aggiunti cellule, regolare il volume del supporto di coltura cellulare per accogliere il volume supplementare, come determinato dalla seguente equazione, dove le cellule V </ sub> è il volume richiesto di sospensione cellulare, C densità cellulare ƒinal è la densità di celle desiderato nel serbatoio, la densità delle cellule C sospensione è la densità delle cellule in soluzione madre.
      figure-protocol-3
  4. Il collagene Iniezione - Top Pezzo
    1. Mettere lo stampo PDMS micropatterned in da 100 mm x 20 mm piatto. PLASMA pulire lo stampo PDMS per 1 min.
    2. Allineare il pezzo superiore PMMA sulla sommità dello stampo PDMS in modo che i serbatoi quadrati stampo sono direttamente sotto i serbatoi di ingresso e uscita (vedere Figura 1D - linee tratteggiate). Posizionare i perni di riferimento in acciaio inox in entrata e uscita fori serbatoio sul pezzo PMMA superiore per mantenere l'accesso chiaro dai serbatoi al modello.
    3. Utilizzare una siringa da 1 ml per estrarre ~ 0.5 - 0,6 ml di collagene. Assicurarsi che non rimangano bolle nella siringa.
    4. Premere lightly con le pinzette sul corpo superiore per assicurare il contatto a filo tra la parte superiore e lo stampo PDMS. Iniettare collagene lentamente attraverso una porta di iniezione sul pezzo PMMA superiore. Verificare che il collagene riempie in 20 millimetri dominio x 20 mm sopra il modello e non perde fuori.
    5. Chiudere il piatto senza spintoni le spine di centraggio e lasciare gelificare in un incubatore a 37 ° per 30 min.
  5. Il collagene Iniezione - inferiore Pezzo
    1. Collocare un vetrino di vetro 22 x 22 mm al centro del pezzo inferiore. Utilizzare una siringa da 1 ml per dispensare ~ 0,25 ml di collagene in modo uniforme sul vetrino. Abbassare delicatamente il PDMS quadrata piatta sopra il collagene, garantendo il PDMS è piatto contro il PMMA e non ci sono la formazione di bolle. Lasciare gel a 37 ° C per 30 min.
  6. Montaggio dispositivo
    1. Dopo gelificazione, aggiungere abbastanza PBS attorno al pezzo PDMS piatta sul pezzo inferiore a circondare il PDMS (circa 1 ml). Utilizzare le pinzette per rimuovere qualsiasi ecollagene Xcess intorno ai bordi, e lentamente staccare il pezzo PDMS. Aggiungere più PBS in cima al collagene per mantenere l'idratazione.
    2. Per preparare il pezzo superiore, utilizzare pinzette per raccogliere il pezzo PMMA superiore e capovolgerla in modo che lo stampo PDMS è in cima. Aggiungere qualche goccia di PBS all'interfaccia, poi rapidamente e rimuovere saldamente lo stampo PDMS dal pezzo PMMA superiore.
    3. Rimuovere delicatamente spine in acciaio inox dal lato opposto della custodia PMMA con un altro paio di pinzette. Aggiungere qualche goccia di più PBS sul collagene micropatterned. Capovolgere il pezzo superiore PMMA in modo che il collagene rivolto verso il basso e inserire 4 viti nei fori d'angolo.
    4. Delicatamente fissare la parte superiore sulla parte superiore del pezzo inferiore, allineando le viti con i fori d'angolo sul pezzo inferiore. Evitare che i due pezzi di scorrere uno contro l'altro. Utilizzare un cacciavite per stringere le viti utilizzando un tocco delicato. Non stringere eccessivamente.
    5. Aspirare il PBS che circonda le superfici PMMA e posizionare una piccola piece cotone sotto un bordo del dispositivo. Usando una pipetta, rimuovere PBS dai serbatoi e sostituirli con mezzi di coltura cellulare. Consentire al dispositivo di gel insieme in un incubatore a 37 ° per almeno 1 ora.
  7. Semina delle cellule
    1. Vena ombelicale umano cellule endoteliali (Culture HUVECs) in terreni di crescita endoteliale a 37 ° C (CO 2, O 2) a confluenza 38. Se possibile, utilizzare i passaggi tra 4 e 7.
    2. Trypsinize cellule endoteliali lavando il pallone di coltura con 6 ml di PBS e quindi aggiungendo 2 ml di 0,05% tripsina a 37 ° C per dissociare le cellule. Lasciare le cellule in tripsina finché la maggior parte delle adesioni focali hanno staccato e le cellule sono arrotondati (questo richiede in genere circa 2 - 3 min). Arrestare la reazione tripsina con l'aggiunta di 4 ml di terreni di crescita endoteliale contenente siero fetale bovino (FBS). Lavare il pallone con più volte mezzi per garantire le cellule vengono staccate dal pallone e raccoglierein un tubo conico.
    3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e risospendere ad una densità di 10 milioni di cellule per ml. Rimuovere tutti i terreni di coltura delle cellule dai serbatoi di entrata e uscita. Utilizzando un 200 microlitri gel loading punta, aggiungere 10 ml di sospensione cellulare al centro del serbatoio di ingresso. Le cellule devono iniziare a fluire nella rete immediatamente e cappotto rete.
    4. Aggiungere 200 microlitri mezzi ugualmente ad entrambi i serbatoi e lasciare che le cellule si attaccano e si diffondono all'interno della rete per almeno 1 ora.
  8. Cultura dispositivo
    1. Culture il dispositivo con flusso per gravità guidato attraverso la rete aggiungendo 200 ml di mezzo di coltura al serbatoio di ingresso e 50 microlitri al serbatoio di uscita. Con questo metodo di cultura, sostituire i media ogni 12 ore per mantenere la vitalità endoteliale.
      Nota: Se le condizioni di coltura di flusso continuo sono desiderabili (per mantenere costante sforzo di taglio, raccogli supporto in uscita, ecc) un syrpompa Inge può essere usato al posto della cultura gravità guidato.
    2. Lasciare le cellule endoteliali seminate almeno 24 ore per fissare e stabilizzare prima di applicare a flusso continuo. Prima di configurazione flusso continuo, mantenere i dispositivi con la gravità guidato condizioni di flusso.
      NOTA: Le condizioni di media per il flusso applicata differiscono dalla cultura gravità guidato. L'aggiunta di un espansore del plasma, come destrano, ai media stabilizza microrecipienti ingegnerizzati e previene il collasso vascolare durante la perfusione sostenuta 39.
    3. Per rendere supporto per la configurazione a flusso continuo, sciogliere 3,5% Destrano (70 kDa) in terreni di crescita endoteliale per la cultura ottimale nave. Usando una tecnica sterile, riempire 10 ml siringhe con mezzi di crescita endoteliale con 3,5% destrano.
    4. Preparare un piatto di coltura sterile per flusso fondendo fori nella parete laterale di un piatto Petri utilizzando un saldatore.
    5. Attaccare 12 "tubo in silicone (1/32" ID) per un blocco di accoppiamento Luer (Donna, 1/16 "ID), e un 1 /16 "connettore diritto tubo-tubo con un 1" segmento di tubo sull'altra estremità. Inserire una "ago smussato 20G (staccato dal mozzo dell'ago) per l'estremità libera del 1" 1/4 segmento. Anche preparare un "segmento di tubo attaccato ad un 90 ° congiunta tronchetto tubo-tubo (da nel tubo di custodia). Nei passi successivi, il tubo più lungo sarà infilato attraverso il piatto preparato e fissato al 3 3 "segmento tramite l'ago 20 G. tubo di uscita dovrebbe rispecchiare tubo di ingresso, con una estremità libera, invece di un innesto blocco Luer. Autoclavare tutti i segmenti prima dell'uso.
    6. Attacco ingresso autoclavato e tubo di uscita attraverso i fori nel piatto preparato. Fissare 3 "segmenti a Inner 20 aghi G. Attaccare il giunto Luer lock per la siringa supporto pieno e profumato dei media attraverso il tubo con la pompa a siringa impostata ad una portata elevata. Verificare che non vi siano bolle nella tubazione o connettori, poichè questi impedire il flusso alla nave.
    7. Inserire il connector congiunta nella presa custodia. Impostare la pompa a siringa alla portata desiderata e iniziare la perfusione.
      NOTA: Questo può essere regolata a seconda della geometria del serbatoio e condizioni sperimentali di forze di taglio applicate. Per un canale diametro di 100 micron, un flusso di 3 ml / min funziona bene.
    8. Se lo si desidera, raccogliere perfusato con preparato tubo di uscita inserito in una sterile 5 ml in polistirolo tubo tondo in basso contenente 500 ml di media.
      Nota: Una piccola quantità di materiale viene aggiunto al tubo di raccolta per evitare la formazione di bolle che possono bloccare il flusso.
    9. A seconda della velocità di flusso, la siringa può avere bisogno di essere riempito dopo 24-36 ore. Questo viene fatto rimuovendo il connettore dalla presa custodia, sostituendo la siringa, e permettendo media per perfusione ad una portata elevata per diversi minuti. Questa sequenza assicura che bolle non vengono introdotti al tubo. Ripristinare la pompa alla portata desiderata per la cultura, inserire il connettore nella presa custodia, etornare alla incubatore.

Analisi 4. Dispositivo

  1. Analisi permeabilità
    1. Utilizzare 40 kDa FITC-destrano per visualizzare la permeabilità del vaso in situ. Inserire l'alloggiamento recipiente su un microscopio confocale e concentrarsi sul piano vaso. Aggiungere 5 pM 40 kDa FITC-destrano per l'ingresso e l'immagine a 4X, 25 msec tempo di esposizione, e ad 1 frame per secondo per 10 min.
    2. Analizzare la serie di immagini con il codice di analisi per valutare la permeabilità Destrano attraverso la parete dei vasi in collagene (micron / sec) sulla base di un modello pubblicato da Zheng et. al. 31.
  2. Analisi Immunocolorazione & Imaging confocale
    1. Per risolvere i vasi, profumato con il 3,7% di formaldeide attraverso l'ingresso per 20 minuti e lavare mediante perfusione PBS per tre volte (20 min a lavaggio). Block anticorpo legame non specifico con il 2% di albumina sierica bovina (BSA) e 0,5% Triton X-100 perfused attraverso la rete per 1 ora. Profumato soluzioni anticorpo primario notte a 4 ° C e lavare tre volte con PBS. Profumato soluzioni anticorpo secondario per 1 - 2 ore, e lavare ancora con PBS nello stesso modo.
    2. Prendere immagini di immunofluorescenza di microvasi in situ utilizzando un microscopio confocale con una z-passo di 1 micron. Immagine dei microvasi con un ingrandimento di 4X, 10X, 20X o.
      Nota: 4x fornirà informazioni globale struttura di rete, mentre 10X e 20X immagini ingrandite forniranno dettagli cellulari come l'allungamento, la formazione di giunzione, ecc.
    3. Analizzare le pile di immagini utilizzando ImageJ con proiezioni Z (Immagine / Stacks / Z-progetto), sezioni trasversali (Immagine / vista Stacks / ortogonale), e ricostruzioni 3D (Immagine / Pile / Progetto 3D).
  3. Scanning Electron Microscopy Imaging
    1. Per l'analisi di microscopia elettronica, fissare in situ mediante perfusione mezza forza sol di Karnovskyution (2% paraformaldeide / 2,5% di glutaraldeide in 0,2 M tampone cacodilato) durante la notte. Smontare il vaso e separare accuratamente i due pezzi. Tagliare i bordi e completamente immersi nella soluzione fissativo per diversi giorni.
    2. Immergere la parte superiore di spessore del recipiente nel 25% glutaraldeide per 20 minuti e sciacquare tre volte con PBS (2 min ciascuna). Disidratare in lavaggi etanolo seriali di 50%, 70%, 85% (2 min ciascuno) e due lavaggi in 100% di etanolo (5 min ciascuna).
    3. Preparare il campione per l'analisi con un ulteriore disidratazione dal punto di essiccazione critica seguendo il protocollo 40 del produttore. Sputter cappotto nave oro-palladio (7 nm) e analizzare al microscopio elettronico a scansione con una tensione di accelerazione di 5 kV, dimensione del punto 3.

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Risultati

La piattaforma nave progettata crea microcircolo funzionale incorporato all'interno di un tipo di collagene naturale I MATRIX e permette di stretto controllo dell'ambiente cellulare, biofisici e biochimici in vitro. Per realizzare microvasi ingegnerizzati, vena ombelicale cellule endoteliali umane (HUVEC) sono perfusi attraverso la rete microfluidica collagene-embedded in cui essi attribuiscono a formare un lume di brevetto e confluenti endotelio. Come illustrato in

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Discussione

Microvasi ingegnerizzati sono un modello in vitro in cui sono presenti e sintonizzabile caratteristiche fisiologiche come la geometria luminale, forze idrodinamiche, e le interazioni multi-cellulari. Questo tipo di piattaforma è potente in quanto offre la possibilità di modellare e studiare il comportamento endoteliale in una varietà di contesti in cui le condizioni di coltura in vitro in può essere abbinata a quella del microambiente in questione. Ad esempio, i meccanismi di guida processi endoteliali...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrebbero riconoscere il Lynn e Mike Garvey Imaging Laboratory presso l'Istituto per cellule staminali e la medicina rigenerativa, nonché il Fondo di Washington Nanofabbricazione presso l'Università di Washington. Essi riconoscono anche il sostegno finanziario del National Institute of Health concede DP2DK102258 (a YZ), e la formazione concede T32EB001650 (a SSK e MAR) e T32HL007312 (MAR).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fabbricazione di wafer
Sistema al plasma AutoGlow
Headway Spin Coater Headway HeadwayResearch, Inc PWM32 Spin Coater 
Allineatore a contatto ABM AB-M
Alpha Step ProfilometroTencorAlpha Step 200
SU-8 SviluppatoreMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8" wafer di silicioWafer World Inc.
Generatore di Micro Pattern da TavoloHeidelberg Instrumentsμ PG 101Per la generazione di fotomaschera
Piastra riscaldanteVWR97042-646
Alcool ispropilicoAvantor Performance Materiali9088
Piastre di Petri (120 x 120 mm, quadrate)Sigma-AldrichZ617679
Tricloro(3,3,3-trifluoropropil)silanoSigma-AldrichMKBG3805V
Base elastomerica di polidimetilsilossano (PDMS) e agente indurenteDow CorningSylgard 184Miscelato a 10:1 (p/p)
Essiccatore sottovuotoSigma-AldrichZ119024-1EA
FornoVWR9120976
Fabbricazione e coltura del dispositivo
poli(metacrilato di metile) (PMMA)Plexiglas
Corona TreaterProdotti elettrotecnici, Inc.BD-20Dispositivo portatile per il trattamento al plasma di dispositivi PMMA e stampi PDMS
SaldatoreWeller in acciaio inossidabile WTCPS
McMaster-Carr91785A096
Perni di centraggio in acciaio inoxMcMaster-Carr 93600A060
Pinzette Miltex24-572È possibile utilizzare pinzette simili
Spatola (Micro cucchiaio)Servizi di microscopia elettronica62410-01
CacciaviteÈ possibile utilizzare qualsiasi cacciavite a testa piatta, autoclavato
Vetrini coprioggetti (22 x 22 mm)Fisher Scientific12-542B
CandegginaClorox4460030966
piastre Petri (150 x 25 mm)Corning430599
piastre di Petri (100 x 20 mm)Corning2909
Cotone, tagliato in pezziautoclavata
(PEI)Sigma-AldrichP3143Diluire all'1% in acqua per colture cellulari
GlutaraldeideSigma-AldrichG6257Diluire allo 0,1% in acqua
per colture cellulariSterile H2OAutoclavato DI H2O
Collagene di tipo I, disciolto in acidoIsolato da code di ratto come descritto in Rajan et. al. 2006 (ref #37)
Siringa da 1 mlBD309659
Siringa da 10 mlBD309604
Provette coniche da 15 mlCorning352097
Tubi conici da 30 mlCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 N NaOH (sterile)Sigma-Aldrich415413Diluire a 1 N in acqua per colture cellulari
HUVECsLonza
Terreni di crescita endotelialiLonzaCC-3124
TripsinaCorning25-052-CI
Siero fetale bovino (FBS)Thermofisher Scientific10082147
Destrano da Leuconostoc spp. (70  Sigma-Aldrich31390
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Corning21-031-CV
EmocitometroHausser Scientific Co.3200
Punte di caricamento del gelVWR37001-152
18 G Ago di riempimento smussatoBD 305180
Ago di erogazione in acciaio inossidabile da 20 gMcMaster-Carr75165A123
Tygon 1/32" ID, 3/32 "OD Silicone TuboCole-ParmerEW-95702-00
1/16 "Accoppiamento tubo-tuboMcMaster-Carr5116K165
90° Connettori a gomito, tubo-tuboMcMaster-Carr5121K901
Accoppiamento Luer Lock (femmina, 1/16" ID)McMaster-Carr51525K211
Pinze in plastica, con impugnature a ganasce Servizi dimicroscopia elettronica72971
a doppia siringaApparecchio Harvard70-4505
ml Polistirene Tubo a fondo tondoFisher Scientific14-959-2A
Device Analysis
FormaldeideSigma-AldrichF8775
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA8806-5G
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
Rabbit anti-hCD31Abcamab32457Diluizione
di lavoro 1:25FITC coniugato anti-von Willebrand Factor anticorpoAbcamab88221:100 diluizione di lavoro
Capra anti-coniglio 568 anticorpo secondarioThermofisher ScientificA-110111:100 diluizione di lavoro
HoeschtThermofisher ScientificH1399Risospeso in DMSO
Cacodilato di sodio Sigma-AldrichC0250Per produrre tampone di cacodilato 0,2 M
EtanoloVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa destrano coniugato FITCSigma-AldrichFD40S 
Reagenti di coltura aggiuntivi 
CHIR-99021Selleck ChemS2924Inibitore GSK-3 a piccola molecola
VEGF ricombinante umanoPeprotech100-20
BFGF ricombinante umanoPeprotechAF-100-18B
Vite a macchina scanalato con testa a traliccio da 1 cm x 3 cm Polietilenimmina acetico allo 0,1% Pompa 5

Riferimenti

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