Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Sommario

Questo protocollo mostra come eseguire la microiniezione citoplasmatica negli zigoti degli animali da allevamento. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire qualsiasi soluzione nell'embrione unicellulare, come gli strumenti di editing del genoma per generare animali knockout.

Abstract

La microiniezione citoplasmatica in embrioni unicellulari è una tecnica molto potente. Ad esempio, consente la fornitura di strumenti di editing del genoma in grado di creare modifiche genetiche che saranno presenti in ogni cellula di un organismo adulto. Può anche essere utilizzato per fornire siRNA, mRNA o anticorpi bloccanti per studiare la funzione genica negli embrioni preimpianto. La tecnica convenzionale per la microiniezione di embrioni utilizzata nei roditori consiste in una micropipetta molto sottile che penetra direttamente nella membrana plasmatica quando viene avanzata nell'embrione. Quando questa tecnica viene applicata agli animali da reddito, di solito si traduce in una bassa efficienza. Ciò è dovuto principalmente al fatto che, a differenza dei topi e dei ratti, gli zigoti bovini, ovini e suini hanno un citoplasma molto scuro e una membrana plasmatica altamente elastica che rende difficile ottenere la visualizzazione durante l'iniezione e la penetrazione della membrana plasmatica. In questo protocollo, descriviamo un metodo di microiniezione adatto per la somministrazione di soluzioni nel citoplasma di zigoti bovini che si è dimostrato efficace anche per gli embrioni di ovini e suini. Innanzitutto, viene utilizzato un laser per creare un foro nella zona pellucida. Quindi una micropipetta di vetro smussata viene introdotta attraverso il foro e fatta avanzare fino a quando la punta dell'ago raggiunge circa 3/4 nell'embrione. Quindi, la membrana plasmatica viene rotta mediante aspirazione del contenuto citoplasmatico all'interno dell'ago. Infine, il contenuto citoplasmatico aspirato seguito dalla soluzione di interesse viene iniettato nuovamente nel citoplasma embrionale. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per la somministrazione di diverse soluzioni in zigoti bovini e ovini con un'efficienza del 100%, una lisi minima e tassi di sviluppo di blastocisti normali.

Introduzione

microiniezione citoplasmatica di embrioni di 1-Cell è una tecnica molto potente. Può essere usato per erogare qualsiasi soluzione nell'embrione, per esempio, producono gene knock-out per studiare la funzione del gene o per generare animali geni modificati. La maggior parte agricolo-zigoti rilevanti animali da allevamento hanno una composizione molto alto acido grasso che rende il loro citoplasma opachi e scuri ^1. Hanno anche una membrana plasmatica mediamente elastiche (PM). Queste caratteristiche rendono la microiniezione utilizzando convenzionale pronuclear iniezione / citoplasmatica usati in specie di roditori impegnative e spesso imprecisi.

Protocollo

1. Micropipetta Produzione

1. micropipetta iniezione
   1. Posizionare un capillare di vetro borosilicato (diametro esterno (OD): 1,0 mm, diametro interno (ID): 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo.
   2. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga tapper. (Esempio: Heat: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tempo: 200; Pressione: 500).
   3. Rimuovere con cura le pipette tirato dal dispositivo e posizionarlo su una microforge in posizione orizzontale.
   4. Portare la pipetta tirato e il riscaldame....

Risultati

Laser-assistita microiniezione citoplasmatica è un protocollo potente e affidabile per fornire soluzioni nel citoplasma di zigoti bestiame. La figura 3 mostra uno schema generale dei zigoti prima e dopo l'iniezione e la sagoma complessiva della tecnica. Destrano-rosso viene usato come iniettare soluzione per consentire il monitoraggio sito di iniezione e iniezione efficienza e precisione. Il raggiungimento della soluzione è illustrata nella figura 4 .......

Discussione

Microiniezione di zigoti è un metodo consolidato per l'introduzione di soluzioni in embrioni di mammiferi. Con alcune variazioni dipendenti dalla specie e l'obiettivo dell'esperimento, questa tecnica può essere utilizzata largamente. Mostriamo come eseguire microiniezione intracitoplasmatica utilizzando un laser per assistere all'ingresso di una micropipetta smussato-end. Zigoti di alcune specie di bestiame (come bovini, ovini, suini e) hanno un citoplasma scuro, ostacolando la visualizzazione della pipe.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estrattore per micropipette	Strumento Sutter	P-97
Capillare in vetro	Strumenti Sutter	B100-75-10	Questi capillari vengono utilizzati per la tenuta e l'iniezione delle pipette. È possibile utilizzare qualsiasi tubo in borosilicato a parete spessa/standard senza filamento.
Microforge	Narishige	MF-9	Dotato di lente con ingrandimento 10X.
Micromanipolatore	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Microscopio invertito	Nikon	TE2000-U	Dotato di lenti 4X, 20X e di un sistema laser.
Strumenti di	ricerca	7-47-500	Saturn 5 Laser attivo.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	Il microdispenser viene utilizzato per spostare gli embrioni. È possibile utilizzare anche una pipetta p10, ma caricando il minor volume possibile.
Piatto di coltura 100 x 15 mm	Falcon	351029	Utilizzare il coperchio della piastra per realizzare la piastra di iniezione, poiché hanno pareti più basse e facilitano il posizionamento e lo spostamento del micromanipolatore. È possibile utilizzare anche il coperchio di una piastra di coltura da 60 mm.
Piatto di coltura da 35 mm	Corning	430165	Questi piatti sono utilizzati per la coltura degli embrioni in 50 μ l. gocce ricoperte di olio minerale. In alternativa, si può utilizzare anche una parabola a 4 pozzetti. Indipendentemente dalla piastra scelta per la coltura degli embrioni, questi devono sempre essere bilanciati nell'incubatrice per almeno 4 ore prima di trasferire gli embrioni.
Incubatrice	Sanyo	MCO-19AIC	Qualsiasi incubatrice che può essere impostata su 38,5 gradi C, 5% CO2 condizioni.
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ800	Utilizzato per visualizzare gli embrioni nelle gocce di coltura e durante i lavaggi. È possibile utilizzare qualsiasi stereomicroscopio con un ingrandimento 10X.
Unità di controllo HT	Minitube	12055/0400	Sistema di riscaldamento collegato allo stereomicroscopio.
Tavolino per microscopio riscaldato	Minitube	12055/0003	Sistema di riscaldamento collegato allo stereomicroscopio.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Per l'iniezione viene utilizzata una soluzione sterile da 10 mg/ml.
Olio Minerale	sigma	M8410	Conservare l'olio minerale a temperatura ambiente e al riparo dalla luce con carta stagnola.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Integrato con 4 mg/ml di BSA. Le piastre KSOM per la coltura di embrioni devono essere bilanciate in un'incubatrice per almeno 4 ore prima dell'uso.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Utilizzare un FBS qualificato per cellule staminali.
Zigoti			Gli zigoti vengono iniettati 17 - 20 hpf e possono essere derivati in-vitro- o in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Concentrazione finale: 107,7 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Concentrazione finale: 7,16 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Concentrazione finale: 1,19 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Concentrazione finale: 0,49 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Sodio DL-lattato	Sigma	L4263	Concentrazione finale: 5,3 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Concentrazione finale: 1,71 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
D-(&meno;)-Fruttosio	Sigma	F3510	Concentrazione finale: 0,5 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Concentrazione finale: 21 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Concentrazione finale: 1x. Componente del mezzo SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Concentrazione finale: 1x. Componente del mezzo SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	Concentrazione finale: 4 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Piruvato di sodio	Sigma	P4562	Concentrazione finale: 0,33 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Concentrazione finale: 1 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Concentrazione finale: 1 mg/ml. Componente del terreno SOF-HEPES.
Gentamicina	Sigma	G-1397	Concentrazione finale: 5 μ g/ml. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Acqua per il trasferimento di embrioni	Sigma	W1503	Componente del terreno SOF-HEPES.
Terreno SOF-HEPES	Prodotto in laboratorio		pH 7,3 - 7,4, 280 & 10 mOs. Filtro sterilizzato attraverso un 22 μ m filtro può essere conservato in frigorifero a 4 gradi C per 1 mese. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.

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