Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Sommario

Questo protocollo mostra come eseguire la microiniezione citoplasmatica negli zigoti degli animali da allevamento. Questa tecnica può essere utilizzata per fornire qualsiasi soluzione nell'embrione unicellulare, come gli strumenti di editing del genoma per generare animali knockout.

Abstract

La microiniezione citoplasmatica in embrioni unicellulari è una tecnica molto potente. Ad esempio, consente la fornitura di strumenti di editing del genoma in grado di creare modifiche genetiche che saranno presenti in ogni cellula di un organismo adulto. Può anche essere utilizzato per fornire siRNA, mRNA o anticorpi bloccanti per studiare la funzione genica negli embrioni preimpianto. La tecnica convenzionale per la microiniezione di embrioni utilizzata nei roditori consiste in una micropipetta molto sottile che penetra direttamente nella membrana plasmatica quando viene avanzata nell'embrione. Quando questa tecnica viene applicata agli animali da reddito, di solito si traduce in una bassa efficienza. Ciò è dovuto principalmente al fatto che, a differenza dei topi e dei ratti, gli zigoti bovini, ovini e suini hanno un citoplasma molto scuro e una membrana plasmatica altamente elastica che rende difficile ottenere la visualizzazione durante l'iniezione e la penetrazione della membrana plasmatica. In questo protocollo, descriviamo un metodo di microiniezione adatto per la somministrazione di soluzioni nel citoplasma di zigoti bovini che si è dimostrato efficace anche per gli embrioni di ovini e suini. Innanzitutto, viene utilizzato un laser per creare un foro nella zona pellucida. Quindi una micropipetta di vetro smussata viene introdotta attraverso il foro e fatta avanzare fino a quando la punta dell'ago raggiunge circa 3/4 nell'embrione. Quindi, la membrana plasmatica viene rotta mediante aspirazione del contenuto citoplasmatico all'interno dell'ago. Infine, il contenuto citoplasmatico aspirato seguito dalla soluzione di interesse viene iniettato nuovamente nel citoplasma embrionale. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per la somministrazione di diverse soluzioni in zigoti bovini e ovini con un'efficienza del 100%, una lisi minima e tassi di sviluppo di blastocisti normali.

Introduzione

microiniezione citoplasmatica di embrioni di 1-Cell è una tecnica molto potente. Può essere usato per erogare qualsiasi soluzione nell'embrione, per esempio, producono gene knock-out per studiare la funzione del gene o per generare animali geni modificati. La maggior parte agricolo-zigoti rilevanti animali da allevamento hanno una composizione molto alto acido grasso che rende il loro citoplasma opachi e scuri ^1. Hanno anche una membrana plasmatica mediamente elastiche (PM). Queste caratteristiche rendono la microiniezione utilizzando convenzionale pronuclear iniezione / citoplasmatica usati in specie di roditori impegnative e spesso imprecisi.

Microiniezione citoplasmatica ha dei vantaggi rispetto microiniezione pronuclear poiché è più facile da eseguire e provoca anche meno danni agli embrioni iniettati, con conseguente maggiore vitalità ^2. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare un metodo di successo per fornire soluzioni nel citoplasma degli zigoti animali da allevamento. Per poter eseguiremicroiniezione citoplasmatica con alta efficienza sugli embrioni bestiame, un laser viene utilizzato per generare un foro nella zona pellucida (ZP) e poi un ago di vetro smussato-end viene utilizzato per la microiniezione. Questa strategia mira a ridurre il danno meccanico impresso l'embrione durante l'iniezione. Poi, l'aspirazione del contenuto citoplasmatica dentro l'ago dell'iniezione permette la rottura efficiente e sicuro del PM garantire che la soluzione è consegnato nel citoplasma dell'embrione.

Questa tecnica è già stata utilizzata con successo in embrioni di bovini per fornire siRNA nel citoplasma zygotic ^3,4 e generare mutazioni utilizzando i cluster si ripete regolarmente intervallati brevi palindromi (CRISPR) / CRISPR associato sistema 9 Sistema ⁵ (Cas9). E 'anche adatto (con piccole modifiche) per iniettare bovini ovociti cumulo-racchiuso ^6. Qui, descriviamo il nostro protocollo di iniezione fornire un colorante, che può essere applicabile a qualsiasi iniezione dessoluzione ired nel zigote, e mostrano che l'utilizzo di questa tecnica provoca la lisi minima e non influenza lo sviluppo embrionale precoce.

Protocollo

1. Micropipetta Produzione

1. micropipetta iniezione
   1. Posizionare un capillare di vetro borosilicato (diametro esterno (OD): 1,0 mm, diametro interno (ID): 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo.
   2. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga tapper. (Esempio: Heat: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tempo: 200; Pressione: 500).
   3. Rimuovere con cura le pipette tirato dal dispositivo e posizionarlo su una microforge in posizione orizzontale.
   4. Portare la pipetta tirato e il riscaldamento del filamento microforge con la sua perla di vetro a fuoco. Utilizzare il reticolo oculare per misurare lo spessore desiderato e spostare la pipetta orizzontale fino filamento riscaldatore raggiunge il diametro interno di destinazione (5 micron).
   5. Regolare il calore a circa il 45% e delicatamente portare la pipetta verso il basso in modo che tocchi il filamento. Attivare brevemente il riscaldamento. Questo will leggermente fondere la pipetta in modo da aderire al filamento e per raffreddamento, la pipetta si romperà nel punto di contatto generando un taglio dritto.
      Nota: L'impostazione della temperatura appropriata è fondamentale in questa fase dal momento che le temperature troppo alte renderanno la curva pipetta e quindi un taglio dritto, non sarà possibile e le temperature troppo basse non saranno sufficienti a fondere la pipetta (Figura 1A).
   6. Fare un approssimativo di 30 ° angolo vicino alla punta della pipetta posizionandola a circa 10 micron di distanza dal filamento di riscaldamento. Impostare la temperatura a 60% ed attivare il riscaldamento.
      Nota: Questo piegare la pipetta sul filamento. Questo angolo è desiderato in modo che la punta dell'ago è parallelo alla superficie della piastra di iniezione quando montato nell'iniettore (Figura 1B).
   7. Maneggiare pipette microiniezione con cautela in quanto sono estremamente nitide e fragile.
2. tenendo micropipetta
   1. Posizionare un borosilicate capillare di vetro (OD: 1,0 mm ID: 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo.
   2. Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga anche cono e pareti parallele (Esempio: Heat: 815; Pull: 20; Velocity: 140; Tempo: 175; Pressione: 200).
   3. Rimuovere con cautela la pipetta tirato dal dispositivo estrattore e posizionarlo sul supporto microforge in posizione orizzontale. Regolare il fuoco sul filamento riscaldatore e pipetta.
   4. Utilizzare il reticolo oculare per misurare il diametro pipetta e spostare la pipetta fino al suo diametro sopra il filamento raggiunge 180 micron.
   5. Alla dimensione indicata, segnare il capillare di vetro con una penna punta di diamante, e quindi premere delicatamente sulla punta tirato a rompere il vetro. Questo dovrebbe portare a un taglio dritto (Figura 1C).
   6. Spostare la pipetta in posizione verticale con la punta vicino al filamento. Impostare la temperatura del microforge al 60%.
   7. Fuoco smalto la punta della pipetta utilizzando tecniche standard ⁷ fino a raggiungere un ID di 40 micron. Utilizzare il reticolo oculare per controllare l'ID (Figura 1D).
   8. Realizzare un angolo la pipetta.
      1. Portare la pipetta torna in posizione orizzontale a circa 10 micron di distanza dal filamento e lontano dalla punta 5 mm. Impostare la temperatura a circa il 60% ed attivare il riscaldamento di piegare la pipetta sul filamento. Continuare riscaldamento fino a raggiungere un angolo desiderato (di circa 30 ^°). Controllare l'angolo visivo (Figura 1E).
         Nota: La pipetta è di solito montato al microinjector ad un angolo approssimativo di 60 ^o rispetto al fondo del piatto iniezione. La punta della pipetta è piegata in modo che sia parallelo al fondo del piatto, che è necessaria per la corretta iniezione dell'embrione al suo piano medio.

Le "> 2. Impostazione Micromanipolatore

1. Controllare che le microiniettori sono a pieno carico con olio e che non ci siano bolle d'aria nel sistema (bolle nel microinjector impediscono un controllo preciso di iniezione).
2. Controllare che i micromanipolatori sono nella posizione centrale. Ciò consentirà per una vasta gamma di movimento delle pipette.
3. Inserire la pipetta tenendo nel supporto micromanipolatore sinistra e la pipetta di iniezione nel supporto micromanipolazione giusta.
4. Lasciare che l'olio di entrare nelle pipette per capillarità e verificare che il sistema funzioni correttamente spostando olio su e giù dentro la pipetta utilizzando i controlli microinjector.
   Nota: se non c'è movimento di olio all'interno degli aghi, ci potrebbe essere uno zoccolo. In questo caso, utilizzare un ago nuovo.
5. Utilizzare i controlli micromanipolatore per portare le pipette nel centro del campo del microscopio di vista. Utilizzando 4X ingrandimento, controllare che le punte micropipetta sono nella corretta angolazione (parallel al fondo del piatto).
   Nota: Una corretta impostazione degli aghi è la chiave per una iniezione di successo e per i risultati coerenza.
6. Calibrare il sistema laser seguente manuale di taratura del produttore.

3. Preparazione del piatto iniezione (figura 2)

1. Mettere una goccia 50 ml di riscaldato (37 ° C) SOF-HEPES (composizione descritto nella sezione materiali) supplementato con siero fetale bovino 20% (FBS) sul centro del coperchio di una piastra di Petri di 100 mm. Inserire un 1 - 2 goccia microlitri della soluzione da iniettare vicino alla goccia iniezione. Assicurarsi che gli embrioni non raffreddare sotto RT.
   Nota: In questo protocollo aggiungeremo il colorante Destrano-Red per la soluzione parenterale per essere in grado di visualizzare il sito di iniezione e tenere traccia in un secondo momento.
2. Coprire le gocce nella piastra iniezione utilizzando circa 10 ml di olio minerale.
3. Porre la capsula di iniezione sul palco del microscopio invertito e portare il pipEttes nella goccia iniezione. Verificare che gli aghi sono a fuoco all'interno della goccia. Regolare la loro altezza in base alle esigenze utilizzando i controlli micromanipolatore.
4. Utilizzando un microdispenser, caricare circa 20 - 30 zigoti (17 - 20 hr post-fecondazione (HPF)) nella parte superiore della goccia iniezione. Eseguire iniezione a temperatura ambiente in modo che il numero di embrioni nella goccia iniezione è determinata dalla velocità con cui la persona può iniettare. Non caricare più embrioni di quelli che possono essere iniettati in 30 min.
   1. Per caricare gli embrioni nel microdispenser, premere lo stantuffo completamente ed immergere la punta nella soluzione contenente gli embrioni. Toccare gli embrioni che vengono raccolti con la punta del capillare di vetro (uno alla volta) e rilasciano lentamente il pistone così ogni embrione entra nel capillare. Ripetere questa operazione fino a quando tutti gli embrioni vengono prelevati o la capacità microdispenser è piena.
   2. Per rilasciare gli embrioni caricati, premere delicatamente lo stantuffo fino a quando l'intero volume di containing gli embrioni viene rilasciato dal capillare.

4. microiniezione

1. Utilizzando l'obiettivo 4X, caricare la soluzione da iniettare nella pipetta di iniezione applicando pressione negativa (aspirazione). Caricare soluzione sufficiente per iniettare 2 - 3 zigoti. Quindi spostare la goccia iniezione.
2. All'interno della goccia iniezione, spostare la pipetta tenendo così la punta si avvicina a uno zigote. Applicare una pressione negativa (aspirazione) con la partecipazione microinjector così lo zigote viene fissata alla pipetta detenzione e la modifica a un obiettivo 20X.
3. Una volta che lo zigote è attaccato alla pipetta holding, controllarne la qualità utilizzando la pipetta iniettando per spostare delicatamente l'embrione in giro senza staccarla. Un zigote buona qualità dovrebbe avere i due corpi polari (anche se a volte è visto solo uno) e un citoplasma omogeneo. Non iniettare zigoti anormali (Figura 3a).
4. Se necessario, riposizionare l'embrione di iniezione correttoluogo. Un buon posizionamento sarebbe quella in cui vi è uno spazio tra la ZP e PM, in modo che il PM non danneggiare dal laser.
5. Verificare che la pipetta di iniezione è posizionato sul piano medio dell'embrione sfiorando zigote sul sito di iniezione. Se non è sul suo piano di mezzeria, l'ago tenderà a rendere l'embrione ruotare invece di foratura. Regolare l'altezza della pipetta di iniezione come necessario.
6. Fare un buco nella ZP utilizzando un laser (Figura 3B).
   1. Utilizzando posto software del laser del reticolo laser nel ZP cui verrà effettuato il foro (sul lato opposto a dove l'embrione è attaccato alla pipetta tenuta). Utilizzando la finestra di controllo del laser, fare clic sul pulsante di fuoco. Assicurarsi che la dimensione del foro è grande abbastanza per creare un'apertura nella ZP per l'ago di passare attraverso senza danneggiare il PM (Esempio: 0,662 ampiezza impulso msec / 6,9 micron Formato del foro).
7. Passare l'ago per l'iniezioneattraverso il foro nella ZP e prendere contatto con il PM. Continuare a spingere la pipetta in avanti fino a quando l'ago è ¾ del modo in l'embrione (Figura 3C).
8. Osservare la posizione del menisco all'interfase soluzione di olio, in modo da essere usato per controllare costantemente volume di iniezione.
9. Applicare pressione negativa (aspirazione) sulla pipetta di iniezione, che si tradurrà in PM e citoplasma essere inspirate l'ago di iniezione. Continuare finché il movimento di citoplasma all'interno dell'ago accelera o quando il contenuto citoplasma mescolando con la soluzione iniettabile può essere visto. Questi indicheranno rottura del PM (Figura 3D).
10. Iniettare nuovamente il contenuto citoplasmatico seguita dalla soluzione nel citoplasma dello zigote applicando pressione positiva (iniezione), finché il menisco all'interfase soluzione-olio ha avanzato diametro equivalente di uno zigote oltre il punto di partenza.
    Nota: Nelle nostre condizioni, questo rappresenta circa 7 pl di soluzione iniettata (Figura 3E).
11. Passare un obiettivo 4X e spostare l'embrione / s iniettato al lato inferiore della goccia iniezione. Rilasciare l'embrione mediante l'applicazione di una pressione positiva sul microinjector azienda. Mantenere gli embrioni non iniettati sul lato superiore e quelli iniettati sul lato inferiore della goccia per tenere traccia degli embrioni iniettati / non-iniettato e lavorare in modo efficiente.

5. Embrione di recupero e iniezione Risultati

1. Fare 3 gocce di circa 200 ml in un nuovo piatto con pre-riscaldato SOF-HEPES. Raccogliere gli embrioni iniettati usando una microdispenser (come descritto sopra). Lavare gli embrioni iniettati spostandoli attraverso il 3 SOF-HEPES gocce.
2. Contare gli embrioni lisati durante la microiniezione e gettarli.
   Nota: Un zigote lisato può essere facilmente distinguibili da un uno intatto dal momento che il primo appare traslucido, compilare l'intero ZP, e ha di solito citoplasmaticacontenuti fuoriuscita all'esterno dell'embrione.
3. Facoltativamente, verificare l'efficienza microiniezione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Essere consapevoli del fatto che l'esposizione ai raggi UV può indurre danni embrione che può influenzare il successivo sviluppo.
4. Gruppi Cultura di 25 embrioni iniettati in 50 gocce microlitri di media ottimizzazione simplex di potassio (KSOM) integrato con 4 mg / ml albumina sierica bovina (BSA) sotto olio minerale a 38,5 ° C, 5% di CO ₂ in aria, umidità e alla saturazione.
5. Integrare il terreno di coltura con il 5% di FBS due giorni dopo l'iniezione.
6. Controllare blastocisti (BL) i tassi di 7 giorni dopo l'iniezione. Calcola BL tariffe come numero totale di embrioni blastocisti / numero totale di embrioni coltivati ​​in quella goccia.

Risultati

Laser-assistita microiniezione citoplasmatica è un protocollo potente e affidabile per fornire soluzioni nel citoplasma di zigoti bestiame. La figura 3 mostra uno schema generale dei zigoti prima e dopo l'iniezione e la sagoma complessiva della tecnica. Destrano-rosso viene usato come iniettare soluzione per consentire il monitoraggio sito di iniezione e iniezione efficienza e precisione. Il raggiungimento della soluzione è illustrata nella figura 4 ...

Discussione

Microiniezione di zigoti è un metodo consolidato per l'introduzione di soluzioni in embrioni di mammiferi. Con alcune variazioni dipendenti dalla specie e l'obiettivo dell'esperimento, questa tecnica può essere utilizzata largamente. Mostriamo come eseguire microiniezione intracitoplasmatica utilizzando un laser per assistere all'ingresso di una micropipetta smussato-end. Zigoti di alcune specie di bestiame (come bovini, ovini, suini e) hanno un citoplasma scuro, ostacolando la visualizzazione della pipe...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Estrattore per micropipette	Strumento Sutter	P-97
Capillare in vetro	Strumenti Sutter	B100-75-10	Questi capillari vengono utilizzati per la tenuta e l'iniezione delle pipette. È possibile utilizzare qualsiasi tubo in borosilicato a parete spessa/standard senza filamento.
Microforge	Narishige	MF-9	Dotato di lente con ingrandimento 10X.
Micromanipolatore	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Microscopio invertito	Nikon	TE2000-U	Dotato di lenti 4X, 20X e di un sistema laser.
Strumenti di	ricerca	7-47-500	Saturn 5 Laser attivo.
Microdispenser	Drummond	3-000-105	Il microdispenser viene utilizzato per spostare gli embrioni. È possibile utilizzare anche una pipetta p10, ma caricando il minor volume possibile.
Piatto di coltura 100 x 15 mm	Falcon	351029	Utilizzare il coperchio della piastra per realizzare la piastra di iniezione, poiché hanno pareti più basse e facilitano il posizionamento e lo spostamento del micromanipolatore. È possibile utilizzare anche il coperchio di una piastra di coltura da 60 mm.
Piatto di coltura da 35 mm	Corning	430165	Questi piatti sono utilizzati per la coltura degli embrioni in 50 μ l. gocce ricoperte di olio minerale. In alternativa, si può utilizzare anche una parabola a 4 pozzetti. Indipendentemente dalla piastra scelta per la coltura degli embrioni, questi devono sempre essere bilanciati nell'incubatrice per almeno 4 ore prima di trasferire gli embrioni.
Incubatrice	Sanyo	MCO-19AIC	Qualsiasi incubatrice che può essere impostata su 38,5 gradi C, 5% CO2 condizioni.
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ800	Utilizzato per visualizzare gli embrioni nelle gocce di coltura e durante i lavaggi. È possibile utilizzare qualsiasi stereomicroscopio con un ingrandimento 10X.
Unità di controllo HT	Minitube	12055/0400	Sistema di riscaldamento collegato allo stereomicroscopio.
Tavolino per microscopio riscaldato	Minitube	12055/0003	Sistema di riscaldamento collegato allo stereomicroscopio.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Per l'iniezione viene utilizzata una soluzione sterile da 10 mg/ml.
Olio Minerale	sigma	M8410	Conservare l'olio minerale a temperatura ambiente e al riparo dalla luce con carta stagnola.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Integrato con 4 mg/ml di BSA. Le piastre KSOM per la coltura di embrioni devono essere bilanciate in un'incubatrice per almeno 4 ore prima dell'uso.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Utilizzare un FBS qualificato per cellule staminali.
Zigoti			Gli zigoti vengono iniettati 17 - 20 hpf e possono essere derivati in-vitro- o in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	Concentrazione finale: 107,7 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	Concentrazione finale: 7,16 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	Concentrazione finale: 1,19 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Concentrazione finale: 0,49 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Sodio DL-lattato	Sigma	L4263	Concentrazione finale: 5,3 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Concentrazione finale: 1,71 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
D-(&meno;)-Fruttosio	Sigma	F3510	Concentrazione finale: 0,5 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
HEPES	Sigma	H4034	Concentrazione finale: 21 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Concentrazione finale: 1x. Componente del mezzo SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	Concentrazione finale: 1x. Componente del mezzo SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	Concentrazione finale: 4 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Piruvato di sodio	Sigma	P4562	Concentrazione finale: 0,33 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	Concentrazione finale: 1 mM. Componente del mezzo SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	Concentrazione finale: 1 mg/ml. Componente del terreno SOF-HEPES.
Gentamicina	Sigma	G-1397	Concentrazione finale: 5 μ g/ml. Componente del mezzo SOF-HEPES.
Acqua per il trasferimento di embrioni	Sigma	W1503	Componente del terreno SOF-HEPES.
Terreno SOF-HEPES	Prodotto in laboratorio		pH 7,3 - 7,4, 280 & 10 mOs. Filtro sterilizzato attraverso un 22 μ m filtro può essere conservato in frigorifero a 4 gradi C per 1 mese. Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso.

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