È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

La manipolazione genetica del patogeno per le piante

14.4K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54522

⸱

30 settembre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.

Abstract

Gene delezione gioca un ruolo importante nell'analisi della funzione del gene. Uno dei metodi più efficaci per interrompere geni in modo mirato è la sostituzione dell'intero gene con un marcatore selezionabile tramite ricombinazione omologa. Durante la ricombinazione omologa, lo scambio di DNA avviene tra sequenze con alta affinità. Pertanto, le sequenze genomiche lineari fiancheggianti un gene bersaglio possono essere utilizzati per indirizzare specificamente un marcatore selezionabile al sito di integrazione desiderato. estremità smussata della delezione costrutto attivano sistemi di riparazione del DNA della cellula e, quindi, promuovere l'integrazione del costrutto sia tramite ricombinazione omologa o non omologa-end-adesione. Negli organismi con efficiente ricombinazione omologa, il tasso di successo delezione del gene può raggiungere più del 50% rendendo questa strategia un sistema gene distruzione di valore. Il fungo fuliggine Ustilago maydis è un modello microorganismo eucariote che mostra come ricombinante omologo efficienteionico. Fuori suoi circa 6.900 geni, molti sono stati funzionalmente caratterizzati con l'aiuto di mutanti di delezione, e ripetuta di pezzi gene tentativi punti in funzione essenziale del gene. caratterizzazione successiva della funzione del gene per codifica con marcatori fluorescenti o mutazioni di domini previsti si basa anche sullo scambio di DNA mediante ricombinazione omologa. Qui, vi presentiamo il U. maydis strategia di generazione ceppo in dettaglio utilizzando l'esempio più semplice, la delezione del gene.

Introduzione

Ustilago maydis è un fungo modello di fitopatogeni che è stato ampiamente studiato per decenni 1,2. Esiste in due morfologie, una fase non patogeno di lievito-simili e una filamentosa, forma infettiva 3. Scoperte rivoluzionarie universali come i meccanismi di ricombinazione e riparazione del DNA omologhe sono state fatte in fase di crescita del lievito-simile di questo fungo 4. Inoltre, l'interruttore morfologica al filamento e di virulenza fattori infettivi importanti per l'infezione sono ben caratterizzati 5,6. La conoscenza molecolare crescente sulla biologia e la virulenza di questo fungo fuliggine si basa su una strategia di sostituzione genica semplice 7-9 supportato da un ottimo annotazione del genoma 10 e la facilità di genetica inversa utilizzando, ad esempio, la raccolta plasmide ben organizzata presso il nostro Istituto (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). Standardizzati, saggi di infezione rapidi nel mais seedlings consentono studi dettagliati di patogenicità fattori 11.

Il genoma di U. maydis contiene circa 6.900 geni 10. Per studiare la loro funzione, possono essere eliminati singolarmente o in combinazione a causa di un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Regioni fiancheggianti di circa 1 kb contenenti estremità perfettamente omologhe sono ideali per i tassi di ricombinazione omologa superiore al 50%, ma già 250 bp con estremità non omologhe consentono un certo grado di corretta integrazione del costrutto 9. Attualmente, cinque diverse cassette di resistenza, HYGR, cbxR, NATR, G418R, e phleoR mediare resistenza contro Hygromycin, carbossina, nourseothricin, G418 e phleomycin, sono impiegati per selezionare per trasformanti 7,9. Inoltre, la resistenza igromicina è stata sviluppata in una cassetta riciclabile (FRT-HYGR) che può essere rimosso mediante l'espressione transiente di un eterologa ricombinasi FLP 12. Questo permette la rimozione della cassetta di resistenza e quindi in teoria illimitato modificazioni genetiche. Phleomycin è mutageno 13, in modo che con le nuove cassette, in particolare riciclabile cassette HYGR, l'uso di phleoR sta diminuendo. Mutanti quadruple possono così essere generati utilizzando gli altri quattro cassette, ma per mutanti quintuple, il sistema FRT-HYGR è consigliato 14.

Questa strategia generale gene delezione è stato trasferito con successo ad altri funghi Smut come Sporisorium reilianum 15, U. hordei 16, o U. esculenta 17 e offre quindi la possibilità di ulteriori applicazioni in organismi geneticamente ancora intrattabili con un sistema di ricombinazione omologa efficiente. Inoltre, gli organismi privi ricombinazione omologa possono essere modificati per migliorare l'ingegneria genetica come esemplificato dalla delezione di geni coinvolti nella non-omologa-itd-entrare in Neurospora crassa 18,19.

Qui si descrive la strategia di eliminazione del gene pubblicato per U. Maydis 7,9 in dettaglio sperimentale con un focus sulla verifica rapida e accurata dei candidati. A titolo di esempio, usiamo le chitinasi fungine e rappresentare la generazione dei singoli mutanti, nonché l'eliminazione più ceppi 20,21. Chitinasi sono esempi interessanti, perché agiscono sulla chitina nella parete cellulare rigida. è richiesto il rimodellamento della parete cellulare di cambiamenti morfologici durante la divisione cellulare, passare alla crescita filamentosa, e formazione di spore. Quindi, in mutanti di delezione può aspettare fenotipi in tutto il ciclo di vita.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Generazione di eliminazione costrutti

  1. Generare un plasmide contenente la delezione costrutto (Figura 1) comprendendo una rispettiva 1 kb fianco upstream (UF) e sul fianco valle (DF) ciascuno e la cassetta di resistenza appropriata fiancheggiata da siti di restrizione taglio smussato.
    NOTA: Qualsiasi strategia clonazione può essere utilizzato (per la clonazione vedi riferimento 22) si consiglia di Golden Gate clonazione per tali plasmidi 9.
  2. Excise la cancellazione costruire dal plasmide con un taglierino smussato per ottenere 1 mg DNA della cancellazione costruire 9. Purificare la cancellazione costrutto per eliminare enzima e buffer 22 ad esempio utilizzando reagenti commerciali e seguire le istruzioni del produttore.
    NOTA: La spina dorsale vettore può rimanere nella miscela trasformazione.

2. Preparazione di protoplasti

NOTA: Mantenere condizioni di sterilità in ogni momento della postaXperiment. La parete cellulare è una forte barriera protettiva che limita l'accesso delle molecole alla membrana plasmatica. Per consentire l'assorbimento del DNA contenente la delezione costrutto, la parete cellulare deve essere rimosso dalla parete cellulare enzimi di degradazione in una reazione protoplasting. Passaggi critici in preparazione protoplasti sono 1) la stabilizzazione osmotica del mezzo e 2) evitando sollecitazioni meccaniche sui protoplasti.

  1. Mark 2 ml tubi con un fondo rotondo di congelare i protoplasti e raffreddare a -20 ° C. Avviare una pre-cultura in 3 ml Yeps-luce da un piatto fresco del ceppo con il background genetico desiderato. Incubare su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C.
    NOTA: Il ceppo può essere il ceppo solopathogenic SG200 10, ceppi di tipo selvatico, ceppi tester, come AB33 23, o qualsiasi sfondo mutante per la generazione di doppi mutanti. Assicurarsi che il ceppo è privo della resistenza desiderata.
  2. Diluire la cultura in 50 ml Yeps-luce in un flas sconcertatok ed incubare su un agitatore orbitale a 28 ° C con 200 rpm.
    NOTA: Il tempo di raddoppio è di circa 2 ore per i ceppi di tipo selvatico. Lasciare almeno tre duplicazioni.
  3. Crescere fino fase esponenziale. Assicurarsi che la densità ottica, misurata ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD 600), è di circa 0,8 (0,6 a 1,0 viene accettabile). Un OD 600 di 1,0 corrisponde a circa 1 a 2 x 10 7 U. Maydis cellule per ml.
  4. Controllare le cellule per la contaminazione al microscopio. Utilizzare 40x. Agglomerare le cellule della completa cultura 50 ml per 5 min, 1.500 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 25 ml di citrato di sodio, soluzione di sorbitolo (SCS), centrifuga 5 min, 1.500 XG, e scartare il surnatante.
    NOTA: contaminazioni batteriche possono essere identificati come i piccoli e spesso in movimento le cellule. Contaminazioni fungine possono essere identificati sulla base di una diversa forma di cella o dimensioni rispetto alle cellule a forma di sigaro di U. maydis.
  5. durante centrifugation preparare soluzione protoplasting (12,5 mg / ml Trichoderma lisi enzimi, in SCS; preparare 3 ml al pellet cellulare; filtro sterilizzare attraverso un filtro 22 micron; soluzione deve essere fresco per l'attività enzimatica ottimale). SCS è uno stabilizzatore osmotico per impedire la rottura di protoplasti dopo la rimozione della parete cellulare.
  6. Risospendere il pellet in 2 ml protoplasting soluzione. Incubare per 5 a 20 min a RT e controllare al microscopio fino 30 al 40% delle cellule sono tonda o simili pinheads (Figura 2).
    NOTA: eseguire tutti i passi sul ghiaccio da ora in poi e gestire protoplasti con cura!
  7. Lavare 3x 10 ml freddo (4 ° C) SCS, centrifugare a 1000 xg per 5 min.
  8. Risospendere il pellet in 10 ml di sorbitolo freddo, soluzione TrisHCl, CaCl 2 (STC), far girare a 1000 xg per 5 minuti, scartare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml freddo STC, fare aliquote di 100 microlitri nei tubi raffreddati. Congelare le aliquote a -80 ° C fino all'utilizzo.

3. Trasformazione di U. maydis

NOTA: La trasformazione di U. Maydis protoplasti basa sul polietilene glicole (PEG) metodo di trasformazione mediata, che è tecnicamente semplice e contrasto elettroporazione o trasformazione biolistic non richiede attrezzature specializzate.

  1. Preparare i piatti di selezione a due strati (2 piastre per reazione di trasformazione). Lo strato inferiore contiene l'antibiotico in concentrazione raddoppiata. Pipettare 12 ml di RegLight contenenti 400 ug / ml igromicina (o 300 ug / ml nourseothricin o 4 mg / ml carbossina o 1 mg / ml G418) in una piastra di Petri. Evitare le bolle.
    NOTA: piatti di strato inferiore può essere memorizzato un paio di giorni a 4 ° C, ma preparare lo strato superiore di fresco durante la trasformazione (vedi sotto).
  2. protoplasti Scongelare su ghiaccio (1 tubo / trasformazione). Aggiungere 1 ml di eparina (15 mg / ml). Aggiungere 1 mg DNA (costrutto linearizzato) o 10 ml H 2 O (controllo dell'acqua). Incubare per 10 min in ghiaccio.
  3. Durante questo tempo, per lo strato superiore si sviluppa 12 ml liquefatti RegLight (ebollizione e raffreddare a 60 ° C) sulla piastra inferiore RegLight.
    NOTA: Questo strato non contiene antibiotici.
  4. Aggiungere 500 microlitri STC / PEG (polietilenglicole) al tubo di trasformazione (3. 2) e miscelare accuratamente per inversione. Incubare 15 min in ghiaccio.
  5. Distribuire ciascuna reazione di trasformazione su due delle piastre RegLight due strati. Stendere con attenzione e lentamente con una pipetta di vetro. Incubare le piastre in posizione verticale a 28 ° C per 5 a 7 giorni fino a quando trasformanti crescere come colonie. Ottenere circa 100-200 colonie per piastra.
    NOTA: I numeri più bassi potrebbero essere causati da protoplasti "cattivi" che o contengono parete cellulare troppo e quindi non può prendere DNA o non può rigenerare. I primi possono essere testati da trasformazione con un plasmide autoreplicante, quest'ultimo testando la rigenerazione su piastre senza antibiotici.
  6. Preparare piastre Yeps-Light contenenti l'antibiotico appropriato a 200 ug / igromicina ml (o 150 mg / ml nourseothricin o 2 mg / carbossina ml o 500 mg / ml G418; queste concentrazioni uguali mezzo di quello utilizzato per piastre inferiori). Re-purificare almeno 24 colonie trasformanti putativi su queste tavole. colonie singole devono essere ottenuti. Allo stesso tempo consecutive il ceppo originale su supporti non selettivo.
    NOTA: Le piastre possono essere conservati a 4 ° C per 1-2 settimane.

4. Verifica di una corretta eliminazione Eventi

NOTA: Le mutazioni sono verificati in un procedimento in tre fasi (Figura 1). Innanzitutto, i candidati che contengono la copia di tipo selvatico del gene sono esclusi mediante PCR. In secondo luogo, l'integrazione della cassetta di resistenza nel locus è verificata mediante PCR. In terzo luogo, l'integrazione della cassetta di resistenza unica nel locus desiderato viene verificata mediante analisi Southern blot. Un'attenta verifica ceppo è essential, in modo che fenotipi mutanti correlano veramente con l'eliminazione.

  1. Prima di diagnostica PCR 20
    1. Disegno primers accoppiamento nel gene da cancellare quel risultato in un prodotto di 250-600 bp (Figura 1). Tali prodotti di piccole dimensioni sono facili per amplificare in una colonia PCR, e abbastanza a lungo per il rilevamento in elettroforesi su gel standard.
    2. Per ciascun candidato e il ceppo originale come controllo positivo, risospendere un po '(quantità di uno spillo) di materiale cellulare di una singola colonia con uno stuzzicadenti in 20 microlitri 0,02 M NaOH. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
      NOTA: Utilizzare le colonie freschi. Se le piastre sono più vecchi di 1 settimana ri-striscia per ottenere una colonia fresca.
    3. Usare 1 ml di sospensione cellulare per la PCR immediatamente. Eseguire una reazione PCR standard e analizzare frammenti risultanti.
      NOTA: Questi campioni non possono essere memorizzati.
      NOTA: i test Questo PCR per la presenza del gene di tipo selvatico e in tal modo consente una rapida identificazione di cand negativoidates in cui il gene di interesse non è stato sostituito. I cloni che producono bande in questa reazione di PCR verranno scartati. Un tale clone negativo dovrebbe comunque essere trasportato lungo come controllo negativo aggiuntivo. I candidati senza un prodotto di PCR devono essere analizzati ulteriormente. Per geni senza effetti negativi circa la metà dei candidati deve contenere il gene di tipo selvatico, mentre l'altra metà non dovrebbe tradursi in una band. Ciò corrisponde ad un tasso di ricombinazione omologa del 50%.
  2. Secondo diagnostico PCR
    1. Preparazione di DNA genomico.
      NOTA: DNA genomico (gDNA) può essere preparato usando due diversi protocolli. Il primo riguarda i reagenti tossici come il fenolo e cloroformio e, di conseguenza, deve essere maneggiato solo da ricercatori esperti (descritti in 4.2.1.1 a 4.2.1.5), mentre il secondo può anche essere gestita da studenti meno esperti (descritti in 4.2.1.6 a 4,2. 1.11). Entrambi i protocolli funzionano in modo affidabile. Passo 4.2.1.1 è identico per entrambi ProtoCols.
      1. Seminare 5 ml Yeps-Light con ciascun candidato e incubare su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C. Goccia 2 ml di coltura su una piastra CM. Mantenere la cultura sterile.
        NOTA: In seguito è un protocollo standard (ATTENZIONE: gradini tossiche).
      2. Mettere 1 misurino (~ 200 ml) di perle di vetro HCl-lavati a 2 ml tubi. Aggiungere 2 ml di U. cultura maydis. Spin 12.000 xg per 5 min. Gettare il surnatante (pellet può essere congelato in questa fase). Aggiungere 500 microlitri fenolo / cloroformio / Isoamylalcohol (25: 24: 1) al pellet. ATTENZIONE! Il fenolo è TOSSICO!
      3. Aggiungere 500 microlitri Usti-lisi-buffer 1. Agitare per 6 a 10 minuti su un Vibrax a 1.000 giri al minuto. Verificare che il pellet è completamente risospeso, ma evitare estesa agitazione per impedire taglio del gDNA. Spin a 12.000 xg per 15 min. Trasferire 400 ml di fase acquosa nel nuovo tubo di reazione (non toccare il interfase).
      4. Aggiungere 1 ml di 100% (v / v) etanolo. Invertire i 3x tubo di mescolare, osservare la cforte di DNA che appare a breve. Spin a 12.000 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante e lavare con 200 ml 70% EtOH. Non risospendere il pellet in questa fase.
      5. Rimuovere il surnatante completamente (non lasciare che il pellet asciugare completamente). Aggiungere 50 microlitri TE / RNase. Sciogliere gDNA agitando a 400 rpm a 50 ° C per 10 min. Analizzare 2 ml di gDNA su un gel di agarosio 0,8% 20.
        NOTA: I passaggi riportati di seguito comprendono un protocollo non tossico alternativa.
    2. preparazione alternativa di DNA genomico
      1. Mettere 1 misurino (~ 200 ml) di HCl lavato perle di vetro a 2 ml tubi. Aggiungere 2 ml di U. cultura maydis e far girare a 12.000 xg per 5 min. Gettare il surnatante (pellet possono essere congelati in questa fase).
      2. Aggiungere 500 microlitri Usti Lysis buffer di 2 al pellet. Agitare per 5 a 15 minuti su un Vibrax a 1.000 rpm. Verificare che il pellet è completamente risospeso.
      3. Incubare le provette a 65 ° C per 15 a 20 min. utilizzando approincubatori appropriate progettati per ospitare da 2 ml tubi è fondamentale. Poi, metterlo in ghiaccio per 5 min.
      4. Aggiungere 100 ml 8 M acetato di potassio, vortice o invertire 8 a 10 volte. Spin 12.000 xg per 15 minuti a temperatura ambiente.
      5. Trasferimento 500 ml di surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml e aggiungere 400 ml di isopropanolo. Vortex o invertito da 8 a 10 volte. Spin 12.000 xg per 15 min. Rimuovere il surnatante e lavare con 500 microlitri 70% EtOH. Spin 12.000 xg per 5 min.
      6. Impregna fuori dal surnatante completamente! Alla fine, aggiungere una breve rotazione (10 sec) per rimuovere il liquido residuo. Lasciate asciugare pellet di DNA per 3-5 min. Aggiungere 50 microlitri TE / RNAase e incubare a 50 ° C per 10 a 15 min a 400 rpm.
    3. PCR
      1. Disegno due coppie di primer con uno di essi vincolante al di fuori i fianchi e la corrispondente vincolante ai cassetta di resistenza (UF-f, RC-r; RC-f, DF-r, Figura 1) 9.
      2. Usare 1 ml di una diluizione 1:10 del gDNA di ogni candidate come modello in 2 reazioni PCR verifica del corretto inserimento monte ea valle 9.
      3. Utilizzare le reazioni standard di PCR per ciascun candidato e analizzare conseguente frammenti 22.
        NOTA: Queste PCR test per l'inserimento della cassetta di resistenza nella corretta locus genomico. Se i prodotti sono ottenuti per entrambe le parti, il candidato è probabile un corretto inserimento. Tuttavia, anche i candidati in cui potrebbe essere confermata solo da un lato (a monte oa valle) dovrebbero essere effettuati insieme per ulteriori analisi nel caso che le reazioni PCR semplicemente non riuscita per un fianco.
  3. Verifica del corretto inserimento Genomic da Southern Blot analisi 22
    1. Digest 15 ml di gDNA (4.2.1) dei candidati mutanti e la corrispondente ceppo di tipo selvatico / progenitore con un enzima appropriato che taglia fuori del locus / costruire e in aggiunta, tagli o nel gene o nella cassetta resistenza che porta a chiaramente distmodelli inguishable (Figura 1) 8.
      NOTA: Nessuna delle bande attese dovrebbe essere più grande di 10 kb, in modo che siano chiaramente distinguibili dal DNA non digerito.
    2. Utilizzare il monte ed il fianco valle come sonde. Per etichettarli per esempio utilizzare il kit di etichettatura PCR DIG o qualsiasi metodo standard simile. Mescolare le sonde marcate in un rapporto 1: 1 molecolare ed eseguire la Southern blot. Mantenere almeno due trasformanti corretti indipendenti.
      NOTA: Il modello di tipo selvatico deve essere chiaramente rilevabile nel ceppo originale e cloni corretto dovrebbe contenere soltanto le bande attese. bande aggiuntive presenti solo nei candidati indicano altre inserzioni del costrutto in un luogo sbagliato. Tali cloni devono essere eliminate. Il candidato negativo identificato nel primo diagnostico PCR dovrebbe contenere le bande di tipo selvatico e le bande (imprevedibili in termini di dimensioni) della eliminazione costrutto torto integrato.
  4. Azioni glicerolo
    NOTA: le scorte Glicerolo servono a mantenere i cloni per anni in collezioni di deformazione. Almeno due trasformanti indipendenti dovrebbero essere conservati per ogni mutante. Questo permette fenotipi confrontando che dovrebbero essere identiche.
    1. Grow 5 ml culture dei ceppi mutanti confermati in Yeps-Light su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C Mescolare 500 ml di ogni cultura con 500 microlitri NSY-glicerolo-media. Capovolgere il tubo fino a quando la cultura e medie sono ben miscelati. Glicerolo nel mezzo previene la formazione di cristalli di ghiaccio.
    2. Congelare a -80 ° C. Re-depositano su una parte della cultura congelata per verificare se lo stock è funzionale.

5. microscopici Fenotipi

  1. Grow 5 ml culture di tipo selvatico e mutanti in Yeps-Light su una ruota girevole per 12 ore a 28 ° C.
  2. Il giorno seguente, diluire la coltura ad una OD 600 di circa 0,1 e crescere finché un OD 600 tra 0,5 e 0,7. Un OD 600 di 1,0 correspcondi per circa 1 a 2 x 10 7 U. Maydis cellule per ml.
  3. Ispezionare la morfologia delle cellule al microscopio.
    NOTA: Healthy cellule sembrano forma di sigaro (figura 4, WT). vacuoli pronunciati o formazione filamento indicano che le cellule sono stressati.
    NOTA: A seconda del fenotipo mutante previsto, l'analisi può essere adattato, per esempio, se vengono utilizzati ceppi reporter di dosaggio appropriato può essere effettuato in questa fase. Se viene analisi statistica modificata dovrebbe essere condotta morfologia cellulare, ad esempio, per determinare la lunghezza media delle cellule.

6. Infezione Assay

NOTA: Il saggio infezione piantina è stata visualizzata in precedenza in questa rivista 11. Esso può essere effettuata utilizzando un aploidi, solopathogenic sfondo ceppo come SG200 10 o mescolando i partner di accoppiamento compatibili che sia portare la mutazione.

  1. Crescere almeno 40 piantine di mais perceppo per 7 giorni alla luce del ciclo di 16 ore, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (giorno / notte). Essi dovrebbero essere nella fase 3-foglie e 10-15 cm di altezza al giorno di infezione.
  2. Due giorni prima dell'infezione, iniziare una pre-coltura dei ceppi in 5 ml Yeps-Light su una ruota girevole per 24 ore a 28 ° C. Crescere una cultura principale in 50 ml Yeps-Light fino a OD 600 = 1,0 (divisione cellulare rate = 2 ore, consentono almeno 3 divisioni, si può fare O / N).
  3. Spin giù le cellule della cultura 50 ml a 1.500 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Lavare 3x con H 2 O. sterili Risospendere le cellule in H 2 O sterile ad una OD 600 di 3,0. Se necessario, mescolare i partner di accoppiamento.
  4. Iniettare 250 - 500 ml di sospensioni di cellule staminali nel giorno del 7 vecchie piante di mais con una piccola siringa. Utilizzare H 2 O sterile come controllo. Mantenere piantine infette per altri 7-14 giorni nelle stesse condizioni di luce e temperatura. Punteggio il fenotipo di ogni pianta unecondo sano, clorosi, la formazione di antociani, piccoli tumori, tumori di grandi dimensioni, piante morte 10.
    NOTA: Scoring può essere fatto fin da 7 giorni e ripetuto a 14 giorni per seguire l'infezione nel corso del tempo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

I costrutti di delezione per tutti i quattro geni chitinolytic codificati nel U. maydis genoma sono stati generati dal Golden Gate clonazione utilizzando la cassetta HYGR per l'eliminazione della CTS1, il NATR per l'eliminazione della CTS2, cassetta G418R per l'eliminazione della cts3 e il cbxR per l'eliminazione di cts4 20. Una panoramica generale della strategia di sostituzione g...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Questo protocollo descrive come generare mutanti di delezione per studi di genetica inversa a U. maydis. Il punto di partenza è un costrutto delezione che contiene sequenze fiancheggianti del gene di interessi contenente sequenze di circa 1 kb a monte dell'inizio e valle del codone di stop, nonché una cassetta di resistenza appropriata come è stato precedentemente ottimizzato 7,9 . I costrutti devono essere generate singolarmente per ogni gene e controllate con cura per errori di sequenza prima d...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Un ringraziamento particolare al Dr. Benedikt Steuten per la lettura critica del manoscritto. L'opera originale sulle chitinasi è stato effettuato dal Dr. Thorsten Langner. Il laboratorio di VG è supportato dal Cluster di Eccellenza in Plant Sciences (CEPLAS, DFG EXC 1028) e BioSC, il laboratorio di KS è supportato da BioSC. KB è supportato da BioSC. Le attività scientifiche del bioeconomia Science Center (BioSC) sono stati sostenuti finanziariamente dal Ministero per l'Innovazione, la Scienza e la ricerca nell'ambito del NRW Strategieprojekt BioSC (n ° 313 / 323-400-00213). LF è sostenuto da una borsa di studio di dottorato del 1525 iGRADplant DFG International Group formazione alla ricerca.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido aminobenzoico (acido libero)Sigma AldrichA-9878
Bacto agarBD214010utilizzare in alternativa il fornitore locale
Bacto peptoneBD211677in alternativa utilizzare il fornitore locale
Bacto estratto di lievitoBD212750utilizza in alternativa il fornitore locale
CaCl2*2H2OGrü ssing GmbH10234utilizzare in alternativa il fornitore locale
Ca-Pantothenat (Hemi-Ca. sale)Sigma AldrichP-2250
Carboxin Sigma Aldrich45371
Casamino acidi BD223050
ColinchloridSigma AldrichC-1879
Acido citricoChemSolute24.321.000utilizzare in alternativa il fornitore locale
CuSO4*5H2O Fluka61240utilizzare in alternativa il fornitore locale
D(+)Saccarosio Roth4621.1utilizza in alternativa il fornitore locale
DNA degr. acido libero Sigma-AldrichD-3159
EDTASigma AldrichE4378
FeCl3*6H2OGrü ssing GmbH10288utilizzare in alternativa il fornitore locale
Geneticin (G418) sale disolfatoSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing enzimiSigma AldrichL1412
D (+) GlucosioCaelo2580utilizzare in alternativa il fornitore locale
Glicerina Fisher ChemicalG065015in alternativa utilizzare il fornitore locale
H3BO3AppliChemA2940Sostanza pericolosa. Si prega di controllare le istruzioni di sicurezza del produttore.
Eparina sale sodicoSigma AldrichH3393-50KU
Igromicina B-soluzioneRoth1287.2Sostanza pericolosa.
KClVWR26764298in alternativa utilizzare il fornitore locale
KH2PO4AppliChemA3620utilizzare in alternativa il fornitore locale
MgSO4 senza acquaMerck7487-88-9L'assenza di acqua è fondamentale. In alternativa, utilizzare il fornitore locale
MnCl2*4H2OAppliChemA2087in alternativa utilizzare il fornitore locale
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937in alternativa utilizzare il fornitore locale
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2utilizzare in alternativa il fornitore locale
Na2SO4Grü ssing GmbH12174utilizzare in alternativa il fornitore locale
NaClFisher ChemicalS316060in alternativa utilizzare il fornitore locale
NaOHChemSolute13.751.000in alternativa utilizzare il fornitore locale
NH4NO3RothK299.1utilizzare in alternativa il fornitore locale
Acido nicotinico (acido libero)Sigma AldrichN-4126
Nourseotricina diidrogeno solfato   Werner BioAgents5.001.000
Brodo nutriente Fenolo
:Cloroformio:Alcool isoamilico (25:24:1) pH 6.7Sigma AldrichP3803Sostanza pericolosa. Si prega di controllare le istruzioni di sicurezza del produttore.
polietilenglicole (PEG)Sigma AldrichP-3640
Acetato di potassioAppliChem121479in alternativa utilizzare il fornitore locale
Piridossina (monocloridrico)Sigma AldrichP-9755
Riboflavina Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3in alternativa utilizzare
la piccola siringa delBD300300in alternativa utilizzare il filtro sterile del fornitore locale
, 22 &; mVWR28145-477in alternativa utilizzare il fornitore locale
Sorbitolo Roth6213.1alternativa utilizzare il fornitore locale
Tiamin-cloridratoServa36020.02in alternativa utilizzare il fornitore locale
Tri-Na-CitratoFisher ChemicalS332060in alternativa utilizzare il fornitore locale
Tris- (idrossimetil) aminometanoVWR103156Xutilizzare in alternativa il fornitore locale
Tris cloridrato Roth9090.4in alternativa utilizzare il fornitore locale
Triton X-100Serva 37240in alternativa utilizzare il fornitore locale
ZnCl2Fluka96470in alternativa utilizzare il fornitore locale
Composizione delle soluzioni/preparazione del materialeComposizione delle soluzioni
CarboxinStock: 5 mg/ml in metanolo, concentrazione finale: 2 &; micro; g/ml
di piastre0,25 % (p/v) di casamminoacidi, 0,1 % (p/v) di estratto di lievito, 1,0 % (v/v) di soluzione vitaminica di Holliday, 6,25 % (v/v); Soluzione di sale di Holliday, 0,05 % (p/v) DNA degr. acido libero, 0,15 % (p/v) NH4NO3, 2,0 % (p/v) Bacto Agar; regolare a pH 7,0 utilizzando 5 M NaOH; dopo la sterilizzazione in autoclave aggiungere l'1
Geneticina (G418)Stock: 50 mg/ml in H2O, concentrazione finale: 500 µ g/ml
di perle di vetro lavate con HCl (0,35-0,45 mm)Coprire le perle di vetro con HCl concentrato (25 %, 7,8 M) e incubare per 60 minuti. Agitare più volte. Decantare l'HCl (conservare il liquido decantato) e lavare le perle di vetro con 3 M di HCl (conservare il liquido decantato). Lavare più volte le perle di vetro con H2O distillato fino a quando il pH non è 7 (il liquido non deve più essere giallo-verde). Aliquotare le perle di vetro ed essiccarle a 180 °C. L'HCl decantato deve essere neutralizzato prima dello smaltimento.
Stock di eparina: 15 mg/ml
di soluzione16.0 ‰ (w/v) KH2PO4, 4.0 ‰ (w/v) Na2SO4, 8.0 ‰ (w/v) KCl, 1,32 ‰ (w/v) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (v/v) oligoelementi, 2,0 ‰ (w/v) MgSO4; filtrato sterile
Soluzione vitaminica Holliday 0,1‰ (w/v) Tiamina, 0,05‰ (w/v) Riboflavina, 0,05‰ (w/v) Piridossina, 0,2‰ (w/v) Ca-Pantothenat, (0,05‰ (w/v) Acido amminobenzoico, 0,2‰ (w/v) Acido nicotinico, 0,2‰ (w/v) Colinclorido, 1,0 per cento; (w/v) mio-inositolo; può essere conservato a -20 gradi C
IgromicinaStock: 50 mg/ml in PBS, concentrazione finale: 200 µ g/ml
di NourseotricicinaStock: 200 mg/ml in H2O, concentrazione finale: 150 µ g/ml
NSY-glicerolo-medio0,8 % (p/v) Brodo nutriente, 0,1 % (p/v) Estratto di lievito, 0,5 % (p/v) Saccarosio,  80,0 % (v/v) 87% Glicerina (f.c. 69,6%) 
RegLight1,0% (p/v) Estratto di lievito  0,4 % (p/v) Bacto Peptone, 0,4 % (p/v) Saccarosio, 18,22 % (p/v) Sorbitolo, 1,5 % (p/v) Agar
SCS, pH 5,8Soluzione 1: 20 mM tri-Na-citrato, 1 M Sorbitolo; colutazione 2: 20 mM Acido citrico, 1 M Sorbitolo, aggiungere la soluzione 2 nella soluzione 1 fino a raggiungere il pH 5,8; autoclave
STC, pH 81 M Sorbitolo, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM CaCl2; filtro sterile
STC/PEG40 % (v/v) PEG in tampone STC 
tampone TE, pH 81,31 mM Tris-Base, 8,69 mM Tris-HCl, 10 mM Na2-EDTA*2H2O
TE/RNasi10 &; g/ml di RNaseA in tampone TE
Oligoelementi0,06‰ (w/v) H3BO3, 0,14‰ (w/v) MnCl*4H2O, 0,4 ‰ (w/v) ZnCl2, 0,4 ‰ (w/v) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (w/v) FeCl3*6H2O, 0,04‰ (w/v) CuSO4*5H2O
Trichoderma lysing enzymes solution12,5 mg/ml SCS; filtro sterile; preparare poco prima dell'uso
Tris-HCl pH 7,5806 mM Tris-HCl, 194 mM Tris-Base; controllare il pH ed eventualmente regolare con HCl; autoclave
Usti-lysis tampone 1, pH 810 mM di Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM di NaCl, 1% (p/v) di SDS, 2% (v/v) di TritonX-100, 1 mM di EDTA. Non misurare il pH con il pHmetro.
Miscela tampone Usti-lysis 2Usti lysis buffer 1 con 1x TE in rapporto 1:1
YEPS-Light medium1,0% (p/v) Estratto di lievito, 0,4% (p/v) Bacto Peptone, 0,4% (p/v) Saccarosio, per piastre: 1,5% (p/v) Bacto Agar
, , fornitore locale in CM % di glucosio di sale di Holliday

Riferimenti

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Delezione genicaricombinazione omologatrasformazione di protoplastianalisi Southern blotverifica PCRgeni della chitinasigenetica funginagenerazione di ceppi
La manipolazione genetica del patogeno per le piante
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.