Articolo metodologico

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita, Capitata Ceratitis

DOI:

10.3791/54528

⸱

1 ottobre 2016

 , 
1Department of Biology and Biotechnology, University of Pavia

In questo articolo

Sommario

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La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) è un parassita dell'agricoltura mondiale. Una comprensione più profonda della sua biologia è fondamentale per controllare le popolazioni di mosche e quindi ridurre l'impatto economico. La microiniezione di embrioni è uno strumento fondamentale che consente sia la trasformazione della linea germinale che gli studi di genetica inversa in questa specie.

Abstract

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La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Ditteri: Tephritidae) è una specie di parassiti con altissima rilevanza agricola. Ciò è dovuto al suo comportamento riproduttivo: le femmine danneggiare la superficie esterna di frutta e verdura, quando depongono le uova e le larve si nutrono schiuse sulla loro polpa. Selvaggio C. popolazioni capitata sono tradizionalmente controllati attraverso insetticidi e / o approcci eco-friendly, il maggior successo è la tecnica sterile Insect (SIT). Il SIT deduce mass-allevamento, sterilizzazione radiometrica e abilitazione campo di maschi che mantengono la loro capacità di accoppiarsi, ma non sono in grado di generare progenie fertile. L'avvento e la conseguente rapido sviluppo di strumenti biotecnologici, insieme con la disponibilità della sequenza del genoma medfly, ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della biologia di questa specie. Questo ha favorito la proliferazione di nuove strategie per la manipolazione del genoma, che can essere applicata al controllo della popolazione.

In questo contesto, embrione microiniezione gioca un duplice ruolo nell'espansione degli strumenti per il controllo della mosca della frutta. La capacità di interferire con la funzione dei geni che regolano i processi biologici chiave, infatti, amplia la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base invasività medfly. Inoltre, la capacità di raggiungere la trasformazione della linea germinale facilita la produzione di più ceppi transgenici che possono essere testati per le future applicazioni sul campo in contesti SIT romanzo. In effetti, la manipolazione genetica può essere utilizzata per conferire tratti desiderabili che possono, ad esempio, essere utilizzati per monitorare le prestazioni maschio sterile nel campo, o che può provocare nei primi mesi di vita letalità stadi. Qui si descrive un metodo per microinject acidi nucleici in embrioni medfly per raggiungere questi due obiettivi principali.

Introduzione

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La mosca della frutta mediterranea (medfly) Ceratitis capitata è una specie cosmopolita che estesamente danneggia frutta e coltivazioni. Appartiene alla famiglia Tephritidae, che comprende diverse specie di parassiti, come ad esempio quelli appartenenti ai generi Bactrocera e Anastrepha. La medfly è la specie più studiati di questa famiglia, ed è diventato un modello non solo per lo studio delle invasioni insetti 1, ma anche per ottimizzare le strategie di gestione dei parassiti 2.

Il medfly è una specie multivoltine che possono attaccare più di 300 specie di selvatici e piante coltivate 3,4. Il danno è causato da entrambi gli adulti ed i stadi larvali: femmine fecondate perforare la superficie del frutto per la deposizione delle uova, permettendo ai microrganismi di influenzare la qualità commerciale, mentre le larve si nutrono della polpa di frutta. Dopo tre stadi larvali, larve emergono dall'host e pupate nel terreno. Ceratitiscapitata mostra una distribuzione quasi tutto il mondo, tra cui l'Africa, il Medio-Oriente, Western Australia, Centro e Sud America, Europa, e le aree degli Stati Uniti 5.

Le strategie più comuni per limitare le infestazioni medfly comportano l'uso di insetticidi (ad esempio, Malathion, spinosad) e l'ecologico Sterile Insect Technique (SIT) 6. Il secondo approccio comporta il rilascio nell'ambiente naturale di centinaia di migliaia di maschi resi sterili da esposizione a radiazioni ionizzanti. L'accoppiamento di questi maschi sterilizzati alle femmine selvatiche si traduce in nessun progenie, causando una riduzione della dimensione della popolazione, portando infine alla eradicazione. Anche se SIT si è dimostrato efficace in più campagne in tutto il mondo, i suoi principali svantaggi sono gli alti costi di allevamento e sterilizzazione di milioni di insetti per essere rilasciato. Marcatura di esemplari rilasciati è necessario distinguere sterile da insetti selvatici catturati sul campo duranteattività di monitoraggio ed è attualmente realizzato con polveri fluorescenti. Queste procedure sono costose e hanno effetti collaterali indesiderati 7.

Al fine di ottimizzare e / o per sviluppare approcci più efficaci per il controllo di questo parassita, biologia e genetica medfly sono stati ampiamente esplorato da numerosi ricercatori di tutto il mondo. La disponibilità della sequenza del genoma medfly 8,9, faciliterà nuove indagini sulle funzioni dei geni. RNA interferenza è un potente strumento per tali studi e può essere raggiunto attraverso la microiniezione di dsRNA (RNA a doppio filamento) o siRNA (small interfering RNA). Questa tecnica è stata utilizzata, per esempio, per dimostrare che la determinazione del sesso cascata molecolare in C. capitata è solo parzialmente conservata rispetto a quello di Drosophila 10.

Lo sviluppo di protocolli per microinject embrioni medfly ammessi C. capitata di essere il primo nonspecie di mosca -Drosophilid da geneticamente modificati. Come le sue uova sono simili a quelli di Drosophila, sia in termini di morfologia e la resistenza all'essiccamento 11, il protocollo per fornire DNA plasmidico in embrioni pre-blastoderma primo sviluppati per D. melanogaster 12,13 inizialmente è stato adattato per l'uso in C. capitata. Questi primi esperimenti autorizzati medfly trasformazione della linea germinale in base all'elemento trasponibili Minos 11. Successivamente, il sistema originale è stato modificato 14 utilizzando altri approcci basati trasposoni. Questo è il caso del piggyBac dal Lepidoptera Trichoplusia ni 15. Il protocollo è stato poi ulteriormente ottimizzato e questo ha permesso la trasformazione di altre specie tephritid 16-21 e anche di molti altri Ditteri 22-31. Tutti questi sistemi si basano sull'impiego di un tipico / helper sistema plasmidico trasformazione binaria vettoriale: artificiale, Transpo difettosofigli contenenti geni desiderati vengono assemblati in DNA plasmidico e integrato nel genoma dell'insetto fornendo l'enzima trasposasi 32. Un certo numero di linee medfly transgenici sono stati generati, con molteplici funzioni, tra cui i ceppi che trasportano un condizionale gene dominante letale che induce letalità, ceppi produttori di soli uomini prole e quindi non richiedono strategie di sessaggio aggiuntivi, e ceppi con sperma fluorescente, che può migliorare la precisione della fase di monitoraggio SIT 33-37. Anche se il rilascio in natura di organismi transgenici è verificato nei test pilota contro le zanzare solo 38,39, almeno una società sta valutando una serie di ceppi medfly transgenici per il loro utilizzo in campo 40.

Embrione microiniezione può anche favorire lo sviluppo di nuovi strumenti di genoma-editing, come la trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens), raggruppati regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPR) / CRISPR proteina associata 9 nucleasi (Cas9) e endonucleasi homing geni (HEGs), che permetteranno nuovi studi evolutivi e di sviluppo, così come l'espansione degli strumenti biotecnologico disponibile. Genome-editing approcci già permesso la generazione di sistemi gene-drive in zanzare 41, e il loro trasferimento al medfly è imminente. Qui si descrive un protocollo universale per microinjecting acidi nucleici in embrioni medfly che possono essere utili per tutte le applicazioni di cui sopra.

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Protocollo

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1. set-up sperimentale

  1. requisiti insectary
    1. Mantenere tutto C. vita capitata in scena a 25 ° C, 65% di umidità e 12/12 ore di luce / buio fotoperiodo.
    2. Mettere circa 1.500-2.000 pupe medfly in una gabbia 6 L. Utilizzare una gabbia con ottone maglia su un lato con fori abbastanza piccolo per stimolare ovideposizione 42. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura nella base della gabbia di fornire mosche con acqua per mezzo di azione capillare. Usare una miscela di lievito e zucchero (1,10) come fonte di cibo per gli adulti (Figura 1A). Aumentare la quantità di lievito (fino a 1: 3, lievito: zucchero) devono le femmine riescono a deporre le uova.
    3. Collocare un piatto riempito con acqua sotto la gabbia a raccogliere le uova depositate attraverso le maglie. Come femmine vergini possono oviposit, attendere fino a quando le mosche sono almeno 6-7 giorni prima di raccogliere le uova per gli esperimenti di microiniezione. Questo farà sì che le femmine sono accoppiatie che saranno state fecondate le uova.
    4. Raccogliere le uova filtrando l'acqua con un colino rete fine. Trasferire le uova dal filtro in una scatola di plastica contenente cibo larvale standard (1,5 LH 2 O, 100 ml di HCl 1%, 5 g ampio spettro antimicrobico disciolto in 50 ml di etanolo, 400 g di zucchero, 175 g di lievito di birra demineralizzata, 1 kg crusca di grano tenero) con una pipetta Pasteur.
    5. Posizionare ogni scatola in un contenitore trasparente chiuso con un coperchio rete per permettere la circolazione dell'aria e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento (Figura 1B).
    6. Dopo circa 10 giorni, verificare la presenza di 3 ° larve instar che emergono dal cibo larvale e saltare giù nello strato di crusca per impupamento.
    7. 24 ore più tardi, raccogliere le pupe in una tazzina con una spazzola morbida e trasferirli ad una nuova gabbia per adulti. Adulti normalmente emergono 10 giorni dopo impupamento. La mosca emergente utilizza il ptilinum, una tasca gonfiabile situato sulla sua testa sopra esimoe di base delle antenne, per forzare l'estremità del puparium. Dopo la nascita, il ptilinum crolla definitivamente indietro all'interno della testa.
  2. Preparazione di 1 L di cibo per le larve microiniezione
    1. Sciogliere 2.5 g di agar in 300 ml di H 2 O.
    2. Warm 500 ml di H 2 O su una piastra di agitazione caldo e sciogliere 4 g di sodio benzoato, 4,5 ml di 37% di HCl, 42 g di estratto di lievito e 115 g di polvere disidratati carota.
    3. Aggiungere alla miscela una soluzione di 2,86 g ampio spettro antimicrobico sciolti in 10 ml di etanolo assoluto.
    4. Distribuire il mezzo in 15 cm rotonde piastre di Petri e lasciare raffreddare. Se necessario, conservare a 4 ° C.
  3. preparazione del vetrino
    1. Posizionare una striscia di 2 cm nastro biadesivo su un vetrino da microscopio (75 x 26 mm 2) e segnare i bordi con un pennarello la Cina, per prevenire la diffusione del petrolio e la conseguente essiccazione degli embrioni iniettati.
  4. Nucleic Acid Preparazione
    1. Isolare plasmide DNA utilizzando kit disponibili in commercio 34. Precipitare il plasmide usando etanolo e risospendere in tampone di iniezione (0,1 mM tampone fosfato pH 7,4, 5 mM KCl) alla concentrazione desiderata.
    2. Purificare in vitro sintetizzata lungo dsRNA con fenolo-cloroformio, precipitare con isopropanolo e risospendere in tampone iniezione 43.

2. Embryo Preparazione

  1. Posizionare un vassoio pieno di acqua sotto una gabbia contenente 6-7 giorni vecchi adulti.
  2. Lasciare le femmine per oviposit per 30 minuti e poi raccogliere gli embrioni filtrando l'acqua con un colino. Tenere sempre il filtro in acqua per evitare la disidratazione degli embrioni.
  3. Dechorionate gli embrioni immergendo il filtro per 5 secondi in una soluzione commerciale di candeggina al 50%.
  4. Lavare accuratamente gli embrioni ripetutamente immergendo il filtro in acqua ultrapura pulita (almeno4-5 volte). Infine, posizionare il filtro in acqua ultrapura pulita. Usare gli embrioni entro massimo 2 ore.
    NOTA: I tempi di microiniezione è legato alla necessità di iniettare in embrioni pre-blastoderma, durante una fase di divisioni nucleari prima cellularization. In questo modo il DNA iniettato da prendere-up nei nuclei, in particolare nei nuclei delle cellule germinali primordiali che provengono i gameti. In Drosophila, cellularization alle cellule polo inizia a circa 90 minuti dopo la fecondazione (a 25 ° C), con formazione blastoderma che si verificano circa 30 min più tardi 44, mentre nel cellularization medfly si svolge tra il 9 e il 12 ore 45,46.
  5. Orientamento degli embrioni in righe
    1. Utilizzando un pennello fine, raccogliere circa 50 embrioni e metterli su un disco di carta da filtro nero inzuppato d'acqua.
    2. Sotto uno stereomicroscopio dissezione, organizzare gli embrioni in fila sulla superficie superiore del nastro biadesivo suil vetrino da microscopio utilizzando un pennello fine (000) (Figura 1C).
      NOTA: allineare gli embrioni tutte con lo stesso orientamento, l'iniezione viene eseguita nel polo posteriore, dove germinali avrà origine; polo posteriore è opposta alla zona micropilo.
    3. Coprire gli embrioni con uno strato di olio clorotrifluoroetilene fare in modo che l'olio non fuoriesca la Cina confini marcatori (vedi 1.3).
      NOTA: Prima di coprire gli embrioni con olio, un ulteriore passo può essere eseguito: gli embrioni possono essere essiccate per alcuni minuti per ridurre il loro contenuto di liquido e facilitare l'ingresso della soluzione di DNA iniettato così. Questo può evitare embrione rottura durante l'iniezione o eccessiva fuoriuscita della soluzione iniettata, in conseguenza della elevata pressione del liquido.

3. Embrione microiniezione

  1. Riempire un ago (1-2 ml) con il DNA plasmide o una soluzione dsRNA (1-2 mg / mL) con una micropipetta.
  2. Collegare l'ago all'apparato microiniezione, che controlla il tempo di iniezione (0,5 sec), la pressione (800 hPa) e la contropressione (150 hPa).
  3. Eseguire microiniezione allo stereomicroscopio, utilizzando un micromanipolatore per controllare i movimenti dell'ago (Figura 1D). Utilizzare il palco microscopio per spostare la diapositiva.
    1. Posizionare il vetrino sul palco del campo di applicazione.
    2. Inserire la punta dell'ago nel polo posteriore dell'embrione (Figura 1E).
    3. Iniettare la soluzione attivando il sistema microiniezione con il pedale. Il liquido iniettato induce un aumento della pressione interna, causando un leggero movimento dell'embrione.
    4. Rilasciare il pedale e subito, ma delicatamente, rimuovere l'ago dall'embrione.
    5. Osservare un po 'di dispersione citoplasmatica al sito di iniezione.
      NOTA: per discriminare tra i potenziali effetti letali di DNA / RNA a doppio filamento / siRNA e la mortalità a causa della microiniezione proprocedura stessa, esperimenti di controllo devono essere eseguite. Questi comprendono l'iniezione di tampone soltanto, o, nel caso di esperimenti di genetica inversa, di una proteina fluorescente verde (GFP) -derived doppio filamento RNA (dsRNA-GFP), o siRNA.
  4. Dopo l'iniezione incubare gli embrioni a 25 ° C.

4. Procedure post-iniezione

  1. Due giorni dopo l'iniezione, controllare le diapositive per le larve schiuse (Figura 1F) sotto uno stereomicroscopio. Le larve può muoversi nell'olio ma devono essere trasferiti al cibo larvale appena possibile. Per questo motivo, controllare le diapositive più volte al giorno.
  2. Utilizzando un pennello fine (000), trasferire delicatamente le larve schiuse al cibo larvale carota-based. Trasferire fino a un massimo di 200 larve per ogni piatto Petri.
  3. Incubare le larve al 65% di umidità (25 ° C). Assicurarsi che il coperchio non si attacca al piatto, compromettendo ricambio d'aria.
  4. Mantenere le piastre di Petri con il coperchioper lo più chiusi in modo che ci sia ancora flusso d'aria alle larve. Per evitare l'asciugatura eccessiva, controllare i piatti tutti i giorni e, se necessario, aggiungere acqua per compensare l'evaporazione.
  5. Porre le capsule di Petri in un contenitore trasparente chiuso da un coperchio-rete e contenente uno strato di crusca per favorire impupamento. Per quanto riguarda la routine di allevamento insectary, 3 ° larve instar saltare fuori del cibo larvale e pupate nella crusca.
  6. Raccogliere le pupe e metterli in una piccola gabbia per l'allevamento degli adulti e di screening (questo è Generazione 0, G0). Posteriore la progenie sul cibo larvale standard.
  7. Nel caso di esperimenti di trasformazione germ-line, verificare la presenza di eventuali individui trasformati nella prossima generazione (G1), come individui iniettati di solito sono chimere. eventi di trasposizione, infatti, potrebbe essersi verificato in uno qualsiasi dei nuclei del sincizio embrionali, che andranno a formare sia il germe-line o il soma.
    1. Poco dopo la nascita, anestetizzare gli individui G1 con CO 2 e verificare la presenza di transfeventi ormazione sotto un stereomicroscopio epifluorescenza. Per lo screening per la presenza di fluorescenza rossa, utilizzare un filtro DsRedwide (Ext 546/12;.. Emm 605/75), mentre allo schermo per fluorescenza verde utilizzare il filtro EYFP (Ext 500/20;.. Emm 535/30) .
    2. Mettere le persone trasformate in una piccola gabbia con wild-type adulti di sesso opposto e originare una nuova, inizialmente eterozigote, ceppo.

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Risultati

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Qui riportiamo due applicazioni di microiniezione dell'embrione diretto alla caratterizzazione funzionale di un gene di interesse (caso 1), e alla generazione di ceppi transgenici (caso 2), rispettivamente.

Consegna di dsRNA in embrioni di svelare la funzione del gene.

Il gene innexin-5 codifica una gap-junction che, negli insetti, si esprime in particolare...

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Discussione

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Microiniezione di acidi nucleici in embrioni insetti è una tecnica universale che facilita sia l'analisi della funzione genica e applicazioni biotecnologiche.

La recente pubblicazione delle sequenze genomiche da un crescente numero di specie di insetti porta ad una necessità urgente di strumenti per la caratterizzazione funzionale dei geni di funzione ancora sconosciute. RNA-interferenza ha dimostrato di essere uno dei metodi più importanti per dedurre funzioni molecolari 49 e...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano tutti i membri del Laboratorio "Genetica e Genomica degli Insetti", in particolare Lorenzo Ghiringhelli che ha lavorato allo sviluppo, all'adattamento e al mantenimento dell'allevamento della mosca negli ultimi trent'anni. Parte dei risultati rappresentativi di questo articolo sono stati ristampati da N. Biotechnology, 25(1) di Scolari F. et al., Marcatura fluorescente degli spermatozoi per migliorare la lotta contro l'insetto parassita Ceratitis capitata (Wiedemann; Diptera: Tephritidae), 76-84, 2008, con il permesso di Elsevier (numero di licenza 3796240759880). Questo lavoro ha ricevuto il sostegno di Cariplo-Regione Lombardia "IMPROVE" (FS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 x tampone0,1 mM tampone fosfato pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNAFenolo-Cloroformio purificato
Standard Alimento1,5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g agente antimicrobico ad ampio spettro utilizzato nei prodotti farmaceutici disciolto in 50  ml di etanolo, 400 g di zucchero, 175 g di lievito di birra demineralizzato, 1 kg di crusca di grano tenero
larvale di carota2,5 g di agar, 4 g di benzoato di sodio, 4,5 ml di HCl 37%, 42 g di estratto di lievito, 115 g di carota in polvere, 2,86  g agente antimicrobico ad ampio spettro, acqua a 1 L
Adult Foodestratto di lievito e zucchero (1:10)
Vetrini per microscopioSigma-AldrichZ692247
Aghi per iniezione Eppendorf5242956000
MicroloadersEppendorf5242956003
Nastro
Whatman Carta circolare neraSigma-AldrichZ695505
BleachDiluite 1:2 prima dell'uso
Pennello (000)
MicromanipolatoreNarishigeMN-153
MicroiniettoreEppendorfFemtojet
Gabbie
Olio di clorotrifluoroetileneSigma-AldrichH8898
Ceratitis capitataIl ceppo utilizzato è ISPRA
per iniezione larvale Cibo scorrevole doppioper adulti

Riferimenti

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