Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita, Capitata Ceratitis

Sommario

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) è un parassita dell'agricoltura mondiale. Una comprensione più profonda della sua biologia è fondamentale per controllare le popolazioni di mosche e quindi ridurre l'impatto economico. La microiniezione di embrioni è uno strumento fondamentale che consente sia la trasformazione della linea germinale che gli studi di genetica inversa in questa specie.

Abstract

La mosca mediterranea della frutta (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Ditteri: Tephritidae) è una specie di parassiti con altissima rilevanza agricola. Ciò è dovuto al suo comportamento riproduttivo: le femmine danneggiare la superficie esterna di frutta e verdura, quando depongono le uova e le larve si nutrono schiuse sulla loro polpa. Selvaggio C. popolazioni capitata sono tradizionalmente controllati attraverso insetticidi e / o approcci eco-friendly, il maggior successo è la tecnica sterile Insect (SIT). Il SIT deduce mass-allevamento, sterilizzazione radiometrica e abilitazione campo di maschi che mantengono la loro capacità di accoppiarsi, ma non sono in grado di generare progenie fertile. L'avvento e la conseguente rapido sviluppo di strumenti biotecnologici, insieme con la disponibilità della sequenza del genoma medfly, ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della biologia di questa specie. Questo ha favorito la proliferazione di nuove strategie per la manipolazione del genoma, che can essere applicata al controllo della popolazione.

In questo contesto, embrione microiniezione gioca un duplice ruolo nell'espansione degli strumenti per il controllo della mosca della frutta. La capacità di interferire con la funzione dei geni che regolano i processi biologici chiave, infatti, amplia la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base invasività medfly. Inoltre, la capacità di raggiungere la trasformazione della linea germinale facilita la produzione di più ceppi transgenici che possono essere testati per le future applicazioni sul campo in contesti SIT romanzo. In effetti, la manipolazione genetica può essere utilizzata per conferire tratti desiderabili che possono, ad esempio, essere utilizzati per monitorare le prestazioni maschio sterile nel campo, o che può provocare nei primi mesi di vita letalità stadi. Qui si descrive un metodo per microinject acidi nucleici in embrioni medfly per raggiungere questi due obiettivi principali.

Introduzione

La mosca della frutta mediterranea (medfly) Ceratitis capitata è una specie cosmopolita che estesamente danneggia frutta e coltivazioni. Appartiene alla famiglia Tephritidae, che comprende diverse specie di parassiti, come ad esempio quelli appartenenti ai generi Bactrocera e Anastrepha. La medfly è la specie più studiati di questa famiglia, ed è diventato un modello non solo per lo studio delle invasioni insetti ^1, ma anche per ottimizzare le strategie di gestione dei parassiti ^2.

Il medfly è una specie multivoltine che possono attaccare più di 300 specie di selvatici e piante coltivate

Protocollo

1. set-up sperimentale

1. requisiti insectary
   1. Mantenere tutto C. vita capitata in scena a 25 ° C, 65% di umidità e 12/12 ore di luce / buio fotoperiodo.
   2. Mettere circa 1.500-2.000 pupe medfly in una gabbia 6 L. Utilizzare una gabbia con ottone maglia su un lato con fori abbastanza piccolo per stimolare ovideposizione ^42. Inserire una striscia di spugna attraverso una piccola apertura nella base della gabbia di fornire mosche con acqua per mezzo di azione capillare. Usare una miscela di lievito e zucchero (1,10) come fonte di cibo per gli adulti (Figura 1A). Aumentare la quantità ....

Risultati

Qui riportiamo due applicazioni di microiniezione dell'embrione diretto alla caratterizzazione funzionale di un gene di interesse (caso 1), e alla generazione di ceppi transgenici (caso 2), rispettivamente.

Consegna di dsRNA in embrioni di svelare la funzione del gene.

Il gene innexin-5 codifica una gap-junction che, negli insetti, si esprime in particolare.......

Discussione

Microiniezione di acidi nucleici in embrioni insetti è una tecnica universale che facilita sia l'analisi della funzione genica e applicazioni biotecnologiche.

La recente pubblicazione delle sequenze genomiche da un crescente numero di specie di insetti porta ad una necessità urgente di strumenti per la caratterizzazione funzionale dei geni di funzione ancora sconosciute. RNA-interferenza ha dimostrato di essere uno dei metodi più importanti per dedurre funzioni molecolari ⁴⁹ e.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 x tampone			0,1 mM tampone fosfato pH 7,4, 5  mM KCl
Construct Plasmid
Helper Plasmid
dsRNA			Fenolo-Cloroformio purificato
Standard Alimento			1,5 L H2O, 100 ml HCl 1%, 5 g agente antimicrobico ad ampio spettro utilizzato nei prodotti farmaceutici disciolto in 50  ml di etanolo, 400 g di zucchero, 175 g di lievito di birra demineralizzato, 1 kg di crusca di grano tenero
		larvale di carota	2,5 g di agar, 4 g di benzoato di sodio, 4,5 ml di HCl 37%, 42 g di estratto di lievito, 115 g di carota in polvere, 2,86  g agente antimicrobico ad ampio spettro, acqua a 1 L
Adult Food			estratto di lievito e zucchero (1:10)
Vetrini per microscopio	Sigma-Aldrich	Z692247
Aghi per iniezione	Eppendorf	5242956000
Microloaders	Eppendorf	5242956003
Nastro
Whatman Carta circolare nera	Sigma-Aldrich	Z695505
Bleach			Diluite 1:2 prima dell'uso
Pennello (000)
Micromanipolatore	Narishige	MN-153
Microiniettore	Eppendorf		Femtojet
Gabbie
Olio di clorotrifluoroetilene	Sigma-Aldrich	H8898
Ceratitis capitata			Il ceppo utilizzato è ISPRA