Articolo metodologico

Anticorpo etichettatura con coloranti fluorescenti utilizzando proteine ​​magnetica A e proteine ​​G perline

11.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/54545

⸱

15 settembre 2016

 ,  , 
1Promega Corporation

In questo articolo

Sommario

Il metodo on-tallone per etichettare anticorpi con piccole molecole permette l'etichettatura di una piccola quantità di anticorpi direttamente dal supporto cellulare. Questo metodo è compatibile con ammina e chimica tiolo, e può gestire campioni multipli in parallelo, manualmente o utilizzando piattaforme automatizzate.

Abstract

Anticorpi marcati con piccole molecole come coloranti fluorescenti, farmaci citotossici, e traccianti radioattivi sono strumenti essenziali nella ricerca biomedica, immunodiagnostica e più recentemente come agenti terapeutici. I metodi tradizionali per gli anticorpi di etichettatura con piccole molecole richiedono anticorpi purificati in concentrazione relativamente alta, coinvolgono più passaggi dialisi ed hanno limitato il throughput. Tuttavia, diverse applicazioni, tra cui il campo di anticorpi coniugati farmaco (ADC), potranno beneficiare di nuovi metodi che consentano l'etichettatura di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Tali metodi possono consentire anticorpi proiettati in saggi biologicamente rilevanti, ad esempio, il dosaggio degli anticorpi internalizzazione mediata da recettori nel caso di ADC. Qui, descriviamo un (metodo on-tallone) metodo che consente l'etichettatura di piccole quantità di anticorpi direttamente dal supporto di cellule. Questo approccio utilizza ad alta capacità magnetica proteina A e la proteina G perline affinità per catturare gli anticorpidal supporto di cellule seguita da marcatura con piccole molecole utilizzando sia ammina o chimica tiolo e successiva eluizione degli anticorpi marcati. Prendendo coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, dimostriamo l'etichettatura on-tallone di tre diversi anticorpi di topo direttamente dal supporto di cellule utilizzando sia ammina e tiolo chimica etichettatura. L'elevata affinità di legame di anticorpi anti proteine ​​A e proteine ​​G garantisce elevati recuperi, nonché di elevata purezza degli anticorpi marcati. Inoltre, l'uso di sfere magnetiche consente a più campioni vengano maneggiati manualmente, migliorando così significativamente il throughput di etichettatura.

Introduzione

Gli anticorpi marcati con piccole molecole sono forse i reagenti più utilizzati in biologia 1,2. Anticorpi marcati con coloranti fluorescenti e biotina sono ampiamente utilizzati nella diagnostica per immagini, immunodosaggi, citometria a flusso, Western blot e immunoprecipitazione tra le altre applicazioni 3-6. Anticorpi radiomarcati 3,7 trovano ampio utilizzo nella diagnostica per immagini e la terapia, gli anticorpi marcati con farmaci citotossici (ADC) stanno offrendo nuove opzioni per il trattamento dei tumori, e due ADC sono già stati approvati per uso terapeutico 8. Nonostante il loro ampio uso, le modalità di etichettatura anticorpi sono rimasti sorprendentemente invariate e di solito sono molteplici reazioni e dissalazione passi 9-12. metodi di soluzione funzionano molto bene nei casi in cui deve essere etichettato solo pochi anticorpi e sono disponibili in forma altamente purificata ad alta concentrazione e in volumi sufficienti. Tuttavia, per le applicazioni più recenti come ADC, vi è unnecessario etichettare anticorpi nella fase ibridoma presto in modo che possano essere sottoposti a screening per proprietà biologicamente rilevanti, ad esempio, recettore-mediata anticorpo internalizzazione 13-16. Nella fase ibridoma, volumi di campione sono limitati, gli anticorpi sono espressi a basse concentrazioni e un numero di campioni sono grandi, quindi metodi di etichettatura di soluzioni basate non sono adatti.

Al fine di semplificare e migliorare il throughput dei tradizionali metodi di etichettatura degli anticorpi, alcuni approcci alternativi sono stati proposti 17,18. Un approccio consiste nell'utilizzare Protein amagnetico A perline affinità confezionati in piccole colonne di catturare anticorpi seguita dalla reazione di marcatura ed eluizione di proteina marcata e purificata. Questo metodo può essere utilizzato per etichettare anticorpi direttamente dal supporto cellulare, tuttavia, l'uso di colonne può essere laborioso. Un metodo basato branello magnetico è stato recentemente riportato 19 che elimina l'uso di colonne e produttività ma a causa miglioraall'anticorpo limitata capacità delle perline vincolante, solo nanogrammo a basse quantità microgrammi di anticorpi potrebbe essere etichettato.

Recentemente abbiamo sviluppato e usato ad alta capacità magnetica Proteina A e Proteine ​​perline G (> 20 mg di IgG umana / ml di perline stanziali) di etichettare gli anticorpi presenti nei mezzi di cella con piccole molecole 20. L'elevata capacità delle perle permette decine a centinaia di microgrammi di anticorpo da etichettare convenientemente e la risposta magnetica rapida delle perline semplifica la gestione e il trattamento di un gran numero di campioni in parallelo. Utilizzando coloranti fluorescenti come surrogati per le piccole molecole, si dimostra che il metodo è compatibile con ammina e tiolo etichettatura chimica e offre alti recuperi di anticorpi marcati e molto puri.

Questo protocollo e il video di accompagnamento descrivono l'etichettatura on-tallone di anticorpi di topo presenti nei mezzi di comunicazione cellulari che utilizzano proteine ​​magnetica A e G proteina perline. Il protocollo èsuddiviso in quattro sezioni: Sezione 1 descrive la cattura di anticorpi sul tallone da campioni biologici. Dopo la cattura, l'etichettatura di anticorpi con colorante fluorescente che utilizzano la chimica ammina o che utilizzano la chimica tiolo è descritta nelle sezioni 2 e la sezione 3, rispettivamente. Infine, la sezione 4 descrive il metodo per il calcolo della concentrazione di anticorpo e il colorante rapporto anticorpo.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. anticorpo di cattura su Perle G ad alta capacità di proteine ​​magnetica A o proteine ​​magnetica

  1. Uniformemente ri-sospendere sfere magnetiche di agitando delicatamente. Mantenere la divisa di sospensione quando si dispensa perle.
  2. Aggiungere 50 ml di perline liquami in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il buffer di stoccaggio.
  3. Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone vincolante.
  4. Mescolare e posizionare nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere con attenzione il tampone di legame.
  5. Aggiungere 1,0 ml di campione contenente 50-100 mg di anticorpi ai talloni. I campioni possono essere purificati anticorpi o anticorpi in supporti delle cellule.
  6. Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end.
  7. Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante.
  8. Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone vincolante / lavaggio. Ripetere questo sTEP per un totale di due lavaggi.
  9. Procedere alla sezione 2 di anticorpi di etichette che utilizzano la chimica ammina o alla Sezione 3 per gli anticorpi etichetta con tiolo chimica.

2. Anticorpo Labeling Utilizzando Amine Chimica

  1. Coniugato anticorpo
    1. Aggiungere 100 ml di tampone ammina coniugazione ai talloni.
    2. Sciogliere i coloranti fluorescenti ammina reattiva (AlexaFluor 532-SE): 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di dimetilsolfossido (DMSO) a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell'uso.
    3. Aggiungere 2,5 ml di tintura amminico reattivo per 100 mg di anticorpo.
      Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi.
    4. Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in suspension.
    5. Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante.
    6. Aggiungere 250 microlitri di anticorpi tampone di legame / lavaggio e mescolare. Mettere nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere e gettare tampone di legame / lavaggio. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
  2. anticorpo di recupero
    1. Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni.
    2. Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
    3. Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di tampone di neutralizzazione.
    4. Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti.
    5. Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4.

3. Anticorpo etichettatura Utilizzando Thiol Chimica

  1. anticorpo Riduzione
    1. Aggiungere 250 microlitridi tampone coniugazione tiolo e mix. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questa operazione due volte.
    2. Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo.
    3. Aggiungere ditiotreitolo (DTT) ad una concentrazione finale di 2,5 mM.
    4. Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
    5. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e scartare il buffer.
    6. Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere ed eliminare il buffer. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
    7. Aggiungere 100 ml di tampone coniugazione tiolo.
  2. Coniugato anticorpo
    1. Sciogliere il colorante tiolo reattivo a 10 mg / ml aggiungendo 100 ml di DMSO a 1,0 mg di colorante. Mescolare nel vortex. Rendere questa soluzione al momento dell'uso.
    2. Aggiungere 2,5 ml di tintura tiolo reattivo per 100 mg di anti-corpo.
      Nota: in genere si raccomanda un 5-20 molare eccesso di colorante reattivo. Tuttavia, quantità di colorante reattivo aggiunto alla reazione deve essere empiricamente ottimizzata a seconda colorante desiderato rapporto anticorpi e intrinseche proprietà anticorpi.
    3. Mescolare il campione per 60 minuti a temperatura ambiente utilizzando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
    4. Porre il tubo nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il surnatante.
    5. Aggiungere 250 ml di tampone coniugazione tiolo e mescolare. Posizionare nel supporto magnetico per 10 secondi e rimuovere il tampone. Ripetere questo passaggio per un totale di due lavaggi.
  3. Elute anticorpo
    1. Aggiungere 50 ml di tampone di eluizione ai talloni.
    2. Mescolare per 5 minuti a temperatura ambiente usando un vortex o mixer end-over-end. Assicurarsi che le perline rimangono in sospensione.
    3. Posizionare il tubo nel supporto magnetico per 10 sec. Rimuovere campione eluito e trasferimento in un nuovo tubo micro-centrifuga contenente 5 ml di neutBuffer ralization.
    4. Ripetere il processo ancora una volta e in comune i campioni eluiti.
    5. Quantificare la concentrazione di anticorpi e tingere-to-anticorpo rapporto come descritto nella Sezione 4.

Rapporto 4. Calcolare Dye-to-anticorpo

  1. Misurare l'assorbanza del coniugato anticorpo-dye a 280 nm (A280) e alla λmax per il colorante (Amax).
  2. Calcolare la concentrazione di anticorpi:
    Anticorpo Concentrazione (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1.4
    dove CF = fattore di correzione del colorante (fornita dal produttore).
  3. Calcolare il rapporto dye-to-anticorpi:
    Dye-to-anticorpo Ratio (DAR) = (A max × 150.000) / Ab Concentrazione (mg / ml) × ε colorante
    dove, tintura ε = coefficiente di estinzione del colorante al massimo assorbimento e il peso molecolare di anticorpo = 150.000 Da.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Uno schema per l'etichettatura anticorpi con piccole molecole con elevata capacità Protein magnetico A e proteina G perline è mostrato in Figura 1. Anticorpi catturato sulla proteina magnetica perline G possono essere etichettati con piccole molecole, per coloranti fluorescenti esempio, utilizzando la chimica ammina quali etichette ammine primarie degli acidi lisina amminoacidi o utilizzando la chimica tiolo che le etichette ai tioli ridotti nella regione cerniera de...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

L'obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo per etichettare anticorpi, presenti nei mezzi di cella a basse concentrazioni, con una varietà di piccole molecole. Tale metodo permette un gran numero di anticorpi, durante le prime fasi di scoperta di anticorpi, etichettato con piccole molecole e schermati con un saggio biologicamente rilevante. Uno di questi test è il test degli anticorpi internalizzazione mediata dai recettori in cui internalizzazione può variare tra gli anticorpi anche con affinità simili...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori sono dipendenti di Promega Corporation.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Magne Protein A Perline PromegaCorporation G8781
Magne Protein G BeadsPromega Corporation   G7471
AlexaFluor 532-SE (Estere succinimidilico)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemide)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimmide)Life TechnologiesA20347
Fluoresceina-ME (Maleimmide)Life TechnologiesF-150
Supporto magneticoPromegaZ5332

Riferimenti

  1. Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
  2. Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
  3. Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
  4. Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
  5. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).
  6. Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
  7. Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
  8. Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
  9. Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
  10. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
  11. Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
  12. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  13. Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
  14. Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).
  15. Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
  16. Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
  17. Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
  18. Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
  19. Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
  20. Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
  21. Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
  22. Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).
  23. Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
  24. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
  25. Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Sferette magneticheSferette con proteina AChimica delle ammineChimica dei tioliTerreno di coltura cellularePurificazione di anticorpiEluizione delle sferette

Articoli correlati