Articolo metodologico

Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

DOI:

10.3791/54546

⸱

17 settembre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un protocollo per la rilevazione colorimetrica di E. coli utilizzando una cartina di tornasole modificata che sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA, l'ureasi e le perle magnetiche.

Abstract

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Ci sono crescenti richieste di metodi semplici ma comunque efficaci che possono essere utilizzati per rilevare agenti patogeni specifici per applicazioni point-of-care o sul campo. Tali metodi devono essere facili da usare e produrre risultati affidabili che possano essere facilmente interpretati sia dagli specialisti che dai non professionisti. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace in quanto riporta il pH di un campione di prova tramite un semplice cambiamento di colore. Abbiamo sviluppato un approccio per sfruttare la cartina di tornasole per la rilevazione batterica. Il metodo sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA specifico del batterio per ottenere due funzioni: riconoscere un batterio di interesse e fornire un meccanismo per controllare l'attività dell'ureasi. Attraverso l'uso di perle magnetiche immobilizzate con un coniugato DNAzima-ureasi, la presenza di batteri in un campione di prova viene trasmessa al rilascio di ureasi dalle perle alla soluzione. L'ureasi rilasciata viene trasferita in una soluzione di prova per idrolizzare l'urea in ammoniaca, determinando un aumento del pH che può essere visualizzato utilizzando la classica cartina di tornasole.

Introduzione

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I patogeni batterici sono una delle principali cause di morbilità e mortalità globale. Focolai di infezioni nosocomiali, agenti patogeni di origine alimentare e contaminanti batterici nell'ambiente rappresentano una minaccia seria e continua per la salute e la sicurezza pubblica. Per prevenire questi focolai, sono necessari strumenti efficaci che consentano di rilevare gli agenti patogeni in modo tempestivo in una varietà di contesti. Test semplici ma comunque efficaci, portatili ed economici sono molto ambiti, soprattutto nelle regioni che sono suscettibili alle epidemie ma non possono permettersi costose strutture di test. 1-3 Sebbene esistano una moltitudine di metodi per rilevare i batteri, molti di essi non sono adatti come strumenti di screening o di test in loco perché richiedono lunghi tempi di analisi, strumenti costosi e procedure di analisi complicate.

I test colorimetrici sono particolarmente interessanti per le applicazioni point-of-care o sul campo, poiché i cambiamenti di colore possono essere facilmente rilevati ad occhio nudo. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace. Sebbene sia una tecnologia molto antica, è ancora oggi ampiamente utilizzata per la sua semplicità ed efficacia. Sorprendentemente, questo semplice test non era mai stato modificato per ottenere la rilevazione di altri analiti prima che avessimo recentemente sviluppato un approccio per modificare questo test per il test di E. coli. 4

La cartina di tornasole estesa per E. coli impiega tre componenti aggiuntivi: un DNAzima (EC1) attivato da E. coli, 5 ureasi e perline magnetiche. I DNAzimi si riferiscono a molecole di DNA sintetiche a singolo filamento con attività catalitica. 6 Possono essere isolati da pool di DNA a sequenza casuale utilizzando la selezione in vitro. 7,8 Sono altamente stabili e possono essere prodotti in modo economico utilizzando la sintesi automatizzata del DNA ad alta efficienza. 9 Per questi motivi, i DNAzimi, in particolare i DNAzimi che scindono l'RNA, sono stati ampiamente esaminati per applicazioni di biorilevamento. I sensori DNAzyme 6,10,11 che decidono l'RNA sono stati sviluppati per rilevare ioni metallici,12-16 piccole molecole,17,18 patogeni batterici5,19-21 e cellule tumorali. 22 Data la grande disponibilità di DNAzimi che scindono l'RNA indotti dal bersaglio, qualsiasi test che utilizza un DNAzima può essere potenzialmente ampliato per rilevare una vasta gamma di analiti.

L'ureasi è stata scelta per la sua capacità di idrolizzare l'urea in ammoniaca,23,24 con conseguente aumento del pH. L'ureasi è anche altamente efficiente, stabile e suscettibile di coniugazione con altre biomolecole. Pertanto, abbiamo ipotizzato che un coniugato di un DNAzima di scissione dell'RNA con ureasi consentirebbe l'uso della cartina di tornasole per la rilevazione di altri bersagli. 5

L'azione del DNAzima che scinde l'RNA è trasmessa all'aumento del pH mediato dall'ureasi attraverso l'uso di perle magnetiche che vengono immobilizzate con il coniugato DNAzyme-ureasi. Poiché l'attività del DNAzima in esame è strettamente dipendente da E. coli, la presenza di questo batterio nella soluzione di prova comporterà il rilascio di ureasi dalle perle magnetiche alla soluzione, che viene poi prelevata e utilizzata per idrolizzare l'urea in una soluzione reporter che contiene un colorante sensibile al pH. Il risultato finale di questa procedura è un cambiamento di colore che può essere convenientemente segnalato dalla carta colorante o pH.

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Protocollo

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1. Preparazione dei reagenti e tamponi

  1. 0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)
    1. In un becher 2 L, aggiungere 186,1 g di EDTA a 800 ml di acqua deionizzata distillata (DDH 2 O). Regolare il pH della soluzione a 8,0 con NaOH pellets. Aggiungere DDH 2 O ad un volume finale di 1,0 L e trasferire la soluzione in una bottiglia di vetro autoclavabile per autoclave e conservare a 4 ° C.
  2. EDTA 10 × Tris-borato (10x TBE)
    1. In un becher di plastica 4 L, aggiungere 432 g di Tris-base, acido borico 200 g, 80 ml ​​di 0,5 M EDTA (pH 8,0) e DDH 2 O per un volume finale di 4 L. Mescolare con ancoretta finché tutti i componenti sono disciolti. Trasferire la soluzione in bottiglie di vetro da 1 litro per la sterilizzazione in autoclave e conservare a 4 ° C.
  3. 10% di poliacrilammide denaturante della
    1. In un becher di plastica 4 L, aggiungere 1681,7 g di urea, 400 ml 10x TBE, 1 L di 40% di acrilammide / bisacrilammide (29: 1) e soluzione DDH 2 O fino alla fil volume inale è 4 L. Mescolare con un ancoretta fino a quando l'urea viene sciolta. Trasferire la soluzione in bottiglie di vetro ambrato 1 L e conservare a 4 ° C.
  4. 2x Gel Caricamento Buffer (2x GLB)
    1. In un bicchiere di vetro da 200 ml, aggiungere 44 g di urea, 8 g di saccarosio, 10 mg blu di bromofenolo, 10 mg xilene cianolo FF, 400 ml di 10% sodio dodecil solfato e 4 ml di 10 × TBE. Aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 40 ml e sciogliere i componenti con blando riscaldamento a 50 ° C sotto agitazione con ancoretta magnetica. Trasferire 1 ml aliquota provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a 4 ° C.
      NOTA: l'uso Prima richiede breve riscaldamento a 90 ° C per riportare in soluzione una qualsiasi solido.
  5. 1 M Tris-cloridrato (Tris-HCl) (pH 7.5)
    1. In una bottiglia di vetro, aggiungere 12,1 g di Tris-base e 70 ml di DDH 2 O e miscelare fino a che il solido è sciolto. Aggiustare il pH a 7,5 con 1 M acido cloridrico (HCl). Aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 100 ml, autoclave e store a 4 ° C
  6. 5 M cloruro di sodio (NaCl)
    1. In una bottiglia di vetro, sciogliere 58,4 g di NaCl in 150 ml di DDH 2 O. Regolare il volume a 200 ml con DDH 2 O. Conservare a 4 ° C.
  7. DNA Elution Buffer
    1. In una bottiglia di vetro, mescolare 2,0 ml di 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,0 ml di 5 M NaCl e 0,4 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0). Regolare il volume a 200 ml con DDH 2 O, autoclave e conservare a 4 ° C.
  8. 1 M 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) (pH 7,4)
    1. In una bottiglia di vetro, sciogliere 2,38 g di HEPES in 80 ml ​​di DDH 2 O. Portare il pH a 7,4 con NaOH 5 N e aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 100 ml.
  9. 1 M cloruro di magnesio (MgCl 2)
    1. In una bottiglia di vetro, aggiungere 2,03 g di MgCl 2 -6h 2 O e portare il volume a 100 ml con DDH 2 O.
  10. Reaction Buffer (RB)
    1. In una provetta conica da 50 ml, aggiungere 50 ml di 1 M HEPES (pH 7,4), 1,5 ml di 5 M NaCl, 0,75 ml di 1 M MgCl 2, e 5 ml di Tween-20. Aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 50 ml. Mescolare la soluzione e filtrare attraverso un altro tubo conico usando un filtro a siringa condotto (0,22 micron) e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  11. Binding Buffer (BB)
    1. In una provetta conica da 50 ml, aggiungere 500 ml di 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g di NaCl, 50 ml di 1 M di MgCl 2, e 5 ml di Tween 20. Aggiungere DDH 2 O ad un volume finale di 50 ml. Mescolare la soluzione e filtrare attraverso un altro tubo conico usando un filtro a siringa condotto (0,22 micron) e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  12. Soluzione di substrato (SS)
    1. In una provetta conica da 50 ml, aggiungere 5,8 g di NaCl, 3 ml di 1 M MgCl 2, 1,5 g di urea, e 40 ml di DDH 2 O. Regolare il pH della soluzione a 5,0 con HCl 10 mM. Poiché la soluzione non viene tamponata, regolare il pH utilizzando HClattenzione attraverso l'aggiunta di piccole aliquote HCl. Aggiungere DDH 2 O per un volume finale di 50 ml.
    2. Mescolare la soluzione e filtrare attraverso un altro tubo conico usando un filtro a siringa condotto (0,22 micron) e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  13. Luria Bertani (LB) Broth
    1. In un bicchiere, sciogliere 20,0 g LB polvere in 1 l di DDH 2 O. Trasferimento in una bottiglia di vetro, autoclave, e conservare a 4 ° C.
  14. 1,5% LB agar
    1. In un pallone da 250 ml, aggiungere 1,5 g agar e 100 ml di brodo LB. Autoclave e conservare a 4 ° C.
  15. piastre di agar
    1. Riprendere il agar LB in un forno a microonde e raffreddare la soluzione a ~ 50 ° C. Versare la soluzione in capsule di Petri, rendendo ~ 5 piatti e permettere loro di solidificare.

2. Sintesi e purificazione di E. coli- reattivo DNAzyme EC1

  1. Sintesi di EC1 by Template Mediated enzimatica legatura
    1. purificare commoligonucleotidi sintetizzati ercially BS1, DE1 e T1 (sequenze fornite nella Tabella 1) del 10% denaturazione elettroforesi su gel di poliacrilammide (dPAGE) secondo protocolli standard.
    2. Preparare una 100 micron magazzino di BS1, DE1, e T1. Conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
    3. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, aggiungere 38,5 ml di DDH 2 O, 5 ml di DE1, e 5 ml di 10x T4 tampone di reazione polinucleotide chinasi forniti dal fornitore enzima (500 mm Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl 2, 50 mM ditiotreitolo (DTT), 1,0 mm spermidina).
    4. Aggiungere 1 ml di adenosina trifosfato (ATP) (100 mM). Aggiungere 5 unità di T4 polinucleotide chinasi (10 U / mL). Mescolare pipettando accuratamente la miscela di reazione.
    5. Incubare la reazione a 37 ° C per 30 min.
    6. Quench la reazione mediante riscaldamento a 90 ° C per 5 min.
    7. Aggiungere 118 ml di DDH 2 O, 5 ml di BS1 e 5 ml di T1. Riscaldare la reazione a 90 ° C per 2 min e poi raffreddare a temperatura ambiente superiore a 10 min.
    8. Aggiungere 20 ml di 10 × T4 DNA ligasi tampone di reazione fornito dal fornitore enzima (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). Aggiungere 10 unità di T4 DNA ligasi (5 U / mL) e con attenzione mescolare pipettando.
    9. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore.
    10. Aggiungere 20 ml di acetato di 3 M di sodio (NaOAc) (pH 5,2), 500 ml di etanolo al 100% freddo. Mescolare la soluzione con vortex e posizionare il tubo in un congelatore C -20 ° per 30 min.
    11. Centrifugare la microcentrifuga a 20.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. rimuovere con attenzione il surnatante pipettando.
    12. Lavare il pellet con freddo al 70% di etanolo e centrifugare nuovamente a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C. Una volta rimuovere il supernatante e asciugare il pellet sotto vuoto per 10 min.
    13. Risospendere il DNA con 15 ml di DDH 2 O e quindi aggiungere 15 ml di 2x GLB.
    14. Vortex vigorosamente e si riscalda a 90 ° C per2 min. Purificare il DNA integrale del 10% dPAGE come descritto di seguito.
  2. Impostazione 10% dPAGE
    1. piastre pulite due di vetro (un piatto pieno e uno dentellati), due da 0,75 mm di spessore, distanziali e un pettine 12-pozzetti. Lay uno lastra di vetro su una superficie piana con due distanziali su ogni lato e la piastra dentata sopra. Agganciare le due piastre insieme con le quattro clip forniti dal fornitore.
    2. In un becher di plastica 150 ml, versare 40 ml di 10% dPAGE, 40 ml di tetrametiletilendiammina (TEMED), e 400 ml di persolfato di ammonio 10% (APS). Miscelare i componenti e versare la soluzione tra le piastre lentamente.
    3. Inserire il pettine e quindi consentire il gel di polimerizzare su 10 min. Una volta che il gel è polimerizzato, rimuovere lentamente il pettine e lavare i pozzetti con DDH 2 O.
    4. Montare le piastre su dell'apparato elettroforesi su gel. Utilizzare una piastra metallica per dissipare il calore generato per evitare il surriscaldamento.
    5. Versare TBE 1x sulle camere superiore e inferioree garantire che i pozzi sono ben immersi nel buffer. Lavare i pozzetti con 1x TBE con una pipetta o una siringa.
    6. Impostare l'apparecchiatura per l'esecuzione a 35 mA e pre-corsa per 15 minuti prima caricato i campioni.
  3. Eluizione di legatura EC1 dal 10% dPAGE
    1. Seguendo passo 2.2.6, eseguire il gel a 35 mA fino colorante inferiore (blu di bromofenolo) raggiunge il fondo della piastra di vetro. Questo dovrebbe prendere circa 1,5 ore. Spegnere l'alimentazione e rimuovere le piastre dall'apparecchio.
    2. Posare le lastre su alcuni fogli di carta assorbente e rimuovere con attenzione i distanziatori dalle lastre di vetro. Rimuovere con cura la lastra di vetro superiore e avvolgere il gel con pellicola trasparente.
    3. Capovolgere il gel sopra per rimuovere la seconda lastra di vetro e coprire con pellicola trasparente di nuovo. Fare attenzione a evitare le rughe della pellicola trasparente.
    4. Visualizza il prodotto legatura utilizzando UV shadowing (260 nm), che produrrà 4 bande di DNA distinte (EC1 completamente legatura, DE1, BS1 e T1).
    5. Excise la fascia superiore (EC1) con una lama di rasoio sterile e trasferimento in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Schiacciare il gel con una punta di pipetta sterile (200 dimensioni punta ml) fino a quando non si trasforma in una pasta fine. Aggiungere 550 pl di tampone di eluizione DNA, coprire il tubo con un foglio di alluminio per proteggere il fluoroforo incorporato e agitare per 15 min.
    6. Centrifugare la soluzione di gel a 20.000 xg per 5 minuti e trasferire con cautela 400 ml di surnatante in un'altra provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Evitare il ritiro pezzi di gel durante il pipettaggio.
    7. Per la provetta per microcentrifuga con il surnatante trasferito aggiungere 40 ml di 3 M NaOAc (pH 5.2) e 1,0 ml di freddo 100% di etanolo. Mescolare la soluzione con vortex e posizionare il tubo in un congelatore C -20 ° per 30 min.
    8. Centrifugare la microcentrifuga a 20.000 xg per 20 minuti a 4 ° C. rimuovere con attenzione il surnatante pipettando.
    9. Lavare il pellet con freddo al 70% di etanolo e centrifugare nuovamente a 20.000 xg per 10 min a 4 ° C. Ancora una volta, rimuovere lasupernatante e asciugare il pellet sotto vuoto per 10 min.
    10. Determinare la concentrazione di EC1 misurando l'assorbanza UV a 260 nm. Fare un 10 mM magazzino e conservare il campione a -20 ° C fino al momento dell'uso.

3. Coniugazione del Ureasi al DNA

  1. Preparazione di succinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cicloesano-1-carbossilato (SMCC) Stock
    1. Sciogliere 1 mg SMCC in 676 ml di DMSO. Vortex e posto sul ghiaccio fino al momento dell'uso.
  2. Preparazione di Ureasi della
    1. Sciogliere 1 mg ureasi in 1 ml di 1 × PBS (senza Mg 2+ o Ca 2+). Mettere in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      NOTA: cristallizzato ureasi è lenta a dissolversi ed è necessario delicata miscelazione per evitare la denaturazione.
  3. Sintesi di Ureasi-DNA (UrDNA)
    1. Aggiungere 10 ml di 100 mM LD1 in una provetta da 2,5 ml microcentrifuga. Aggiungere 140 ml di DDH 2 O, 40 ml di PBS 10x, e vortice.
    2. Aggiungere 80,5 ml di SMCC stac, 159,5 ml di DMSO, vortex e centrifugare brevemente con una centrifuga da banco.
    3. Incubare a 37 ° C per 60 min. Evitare la formazione di condensa sotto il tappo microcentrifuga.
    4. Aggiungere 200 ml di PBS 1x, 60 ml di 3 M NaOAc (pH 5.2) e 1,5 ml di freddo 100% di etanolo. Mescolare la soluzione nel vortex e incubare a -20 ° C per 30 min.
    5. Centrifugare la soluzione a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e asciugare il pellet sotto vuoto. Evitare di essiccazione.
    6. Al pellet essiccati aggiungere 400 ml di ureasi magazzino e incubare a temperatura ambiente per 5 ore.
    7. Trasferire 200 ml di coniugato greggio ad un 100k MWCO colonna di filtro centrifugo pre-lavati. Centrifugare la colonna a 14000 xg per 5 min.
    8. Trasferire i restanti 200 ml di coniugato greggio alla colonna e centrifugare a 14000 g per 5 min. Rimuovere la colonna e metterlo a testa in giù in un nuovo 2,0 ml provetta per microcentrifuga ( "tubo di raccolta").
    9. centrifuge il tubo di raccolta (con la colonna invertita) a 1.000 xg per 2 min. Rimuovere il tubo di raccolta e aggiungere 30 ml di PBS 1x alla colonna di centrifuga per lavare la membrana per ulteriore recupero di coniugati.
    10. Ancora una volta invertire la colonna e inserire di nuovo nel tubo di raccolta. Centrifugare il tubo di raccolta (con la colonna invertita) a 1.000 xg per 2 min. Rimuovere e smaltire la colonna.
    11. Conservare il UrDNA a 4 ° C fino all'utilizzo.

4. Montaggio di EC1 e UrDNA su biglie magnetiche

  1. Mescolare il magazzino tallone magnetica (MB) bene e trasferire 100 ml di sospensione MB in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Posizionare il tubo microcentrifuga su un supporto magnetico cremagliera per isolare la MB.
  2. Rimuovere il surnatante pipettando e aggiungere 150 ml di Binding Buffer (BB) al tubo. Rimuovere il tubo dal supporto e toccare con attenzione il tubo per sospendere di nuovo la MB a una soluzione omogenea. Evitare di spruzzare la sospensione al top del tubo o tappo. In questo caso, utilizzare una centrifuga da banco a girare brevemente il residuo torna alla sospensione.
  3. Ripetere il punto 4.2 altre due volte.
  4. A questa sospensione aggiungere 10 ml di 10 mM EC1. Mescolare accuratamente toccando il tubo.
  5. Incubare la soluzione con lieve agitazione per 30 min. Premere il tubo ogni 2-3 min per evitare la precipitazione del MB.
  6. Posizionare la provetta per microcentrifuga indietro sulla griglia magnetica per isolare il MB e rimuovere il surnatante pipettando. Lavare il MB per tre volte con 150 ml di BB (come descritto al punto 4.2).
  7. Dopo il lavaggio è completo, sospendere la MB in un totale di 150 ml di BB. A questa soluzione, aggiungere 15 ml di UrDNA e riscaldare la soluzione a 45 ° C per 2 min. Raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e incubare per 2 ore.
  8. Posizionare la provetta per microcentrifuga indietro sulla griglia magnetica per isolare il MB e rimuovere il surnatante pipettando.
  9. Aggiungere 100 ml di tampone di reazione (RB). rimuovere tegli microcentrifuga tubo dal rack magnetica e con attenzione risospendere il MB.
  10. Lavare i MB altre tre volte ripetendo il passaggio 4.9.
    NOTA: Il supernatante lavato può essere rapidamente testato per determinare se non ibridizzate UrDNA è ancora presente, che può risultare in un falso segnale positivo. Il test può essere fatto aggiungendo 10 ml di 50 mM di urea e 10 ml di 0,04% di fenolo rossi per la soluzione di lavaggio. Continuare a lavare il MB fino a quando la soluzione di lavaggio non causa un cambiamento di colore. La sospensione 100 microlitri è conservato a 4 ° C fino all'utilizzo.

5. Preparazione di cellule batteriche 20

  1. Coltura E. coli dalle scorte
    1. Piastra E. coli K12 (MG1655) su piastre di agar LB da uno stock di glicerolo sotto una fiamma o in un armadio di sicurezza biologica.
    2. Utilizzando una punta pipetta sterile, toccare delicatamente lo stock di glicerolo e leggermente striscia la superficie di una piastra di agar per evitare la puntura del agar LB.
    3. Invertire la striatipiastra e incubare a 37 ° C per 14 ore.
    4. Sigillare la piastra con parafilm e conservare a 4 ° C per un massimo di 3 settimane.
  2. Coltura E. coli per Cell conteggio
    1. In una provetta 14 ml sterile, dispensare 2 ml di brodo LB.
    2. Utilizzando una punta pipetta sterile, scegliere una singola colonia dalla piastra di agar striato preparato al punto 5.1 e trasferirlo al tubo della cultura.
    3. Incubare la cultura a 37 ° C e agitare a 230 giri al minuto per 14 ore.
    4. In serie diluire la coltura batterica in intervalli di 10-fold.
    5. Per ciascun campione diluito, uniformemente piatto cinque aliquote di 100 microlitri su piatti separati LB agar. Capovolgere le piastre e incubare a 37 ° C per 14 ore.
    6. Contare le cellule di ogni campione per ottenere la concentrazione media di cellule di ciascuna diluizione.
      NOTA: 10 7 cellule vengono spesso utilizzati per impostare una cartina di tornasole di riferimento per E. coli come questo livello di E. coli può innescare un rapido colore change. Tuttavia, una cartina di tornasole eseguito correttamente in grado di rilevare partire da 500 celle, come discusso nella sezione Risultati.
  3. Preparazione E. Le cellule coli per test
    1. Per una sospensione cellulare desiderato, il trasferimento di 1 ml di coltura in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
    2. Centrifugare le cellule a 6000 xg per 10 min a 4 ° C. rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet.
    3. Aggiungere 10 ml di tampone di reazione al pellet e risospendere le cellule. Sonicare la sospensione cellulare per 5 min. Trasferire la sospensione cellulare ad una scatola di ghiaccio per 5 min.
    4. Sonicare la sospensione cellulare per altri 5 minuti.
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 13.000 xg per 10 min a 4 ° C. Utilizzare il surnatante per la prova (10 ml).

6. cartina di tornasole

  1. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, prelavaggio il tubo con l'aggiunta e vortex 100 ml di tampone di reazione (RB) nella provetta per microcentrifuga escartando il buffer.
  2. Trasferimento 15 ml di EC1 assemblato (protocollo 4) alla provetta per microcentrifuga lavato.
  3. Lavare le sfere magnetiche ponendo la provetta da microcentrifuga su un rack magnetica. Rimuovere il surnatante pipettando. Rimuovere la provetta per microcentrifuga dal rack, aggiungere 100 ml di RB, e risospendere attentamente le sfere magnetiche.
  4. Lavare i MB altre due volte ripetendo il passaggio 6.3.
  5. Posizionare la provetta per microcentrifuga indietro sulla griglia magnetica, rimuovere il surnatante e aggiungere il 10 microlitri E. campione coli preparato dal punto 5.3.
  6. Mescolare le perline campione e magnetici accuratamente picchiettando delicatamente sul tubo microcentrifuga.
  7. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 1 ora.
  8. Per la reazione, aggiungere 90 ml di DDH 2 O e posizionare il tubo microcentrifuga su una griglia magnetica.
  9. Dopo circa 3 min di separazione magnetica, trasferire accuratamente 85 ml di surnatante in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga. Prelevare il surnatante lentamenteevitare di raccogliere eventuali sfere magnetiche.
  10. Per la provetta per microcentrifuga sopra aggiungere 15 ml di 0,04% rosso fenolo e 100 ml di soluzione di substrato.
  11. Scattare una fotografia a intervalli di tempo specifici per registrare il cambiamento di colore.
    NOTA: Il cambiamento di pH può anche essere monitorato con un pH-metro con un microelettrodo. Il pH di partenza deve essere di circa 5,2-5,5 (la soluzione è gialla). In caso contrario, la soluzione può essere regolato mediante aggiunta di 1 mM tampone acetato pH 5.0).

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il principio della prova del nove batterica è spiegato in Figura 1 Il test utilizza tre materiali principali:. Un DNAzyme RNA-scissione che viene attivato da un batterio specifico, ureasi e perline magnetiche. Il DNAzyme viene utilizzato come elemento di riconoscimento molecolare per ottenere un rilevamento altamente specifica di un batterio di interesse. Ureasi e sfere magnetiche sono utilizzati per ottenere trasduzione del segnale delle attività RNA-scissione del DNAzy...

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Discussione

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La definizione dell'azione dell'attività RNA clivaggio di un DNAzyme batterio sensibile ad un banco di prova è reso possibile attraverso l'uso di ureasi e separazione magnetica, come illustrato nella figura 1. Sebbene la dimostrazione della cartina tornasole modificati per rivelare batterica è fatto con una E. coli-dipendente RNA-scissione DNAzyme, 5,19,20 il design può essere generalmente esteso per qualsiasi DNAzyme RNA-scissione. Data la grande disponibilità di DNAzimi...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il finanziamento per questo progetto di ricerca è stato fornito dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) tramite una sovvenzione per la scoperta a YL.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)VWR AMRESCO0105
Pellet di idrossido di sodio (NaOH)BIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-baseVWR AMRESCO0497
Acido boricoAMRESCO0588
UreaVWR AMRESCOM123
40% acrilammide/bisacrilammide (29:1) soluzioneBIO BASIC CANADA INC.A0007
SaccarosioBioshop Canada inc.SUC507
Blu di bromofenoloBioshop Canada inc.BRO777
Xilencianolo FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% sodio dodecil solfatoBioshop Canada inc.SDS001
Acido cloridrico (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Cloruro di sodio (NaCl)Bioshop Canada inc.SOD001
Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Cloruro di magnesio (II) esaidratoVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adenosina Trifospatica (ATP)AMRESCO0220
Acetato di sodio triidrato (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
EtanoloAlcoli commercialiP016EAAN
Tetrametileneetilendiammina (TEMED)AMRESCO0761
10% Persolfato di ammonio (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimetil solfossido (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
ureasiSIGMA-ALDRICHU0251
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04% Rosso fenoloSIGMA-ALDRICHP3532
10x tampone di reazione della polinucleotide chinasi T4Lucigen30061-1
10x tampone di reazione della DNA ligasi T4Bio Basics CanadaB1122-B
T4 DNA ligasi (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BrodoAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 polinucleotide chinasi (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
CentrifugaBeckman Coulter, Inc.
Lastre di vetroCBS scientificngp-250nr
distanziatori spessore 0,75 mmCBS scientificVGS-0725r
pettine a 12 pozzettiCBS scientificVGC-7512
Lampada UVUVP95-0017-09
Spettrofotometro (NanoVue)GE HealthcareN/A Piastra
metallicaCBS scientificoCPA165-250
VortexVWR International58816-123
Apparecchio per elettroforesi su gelCBS scientificASG-250
Piastre di PetriVWR International25384-342
100 kDa MWCO filtri centrifughiEMD MilliporeUFC510024
Magnetic Bead (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Rack di separazione magneticaNew England BioLabsS1506S
Provette per microfughe,Sarstedt72,69
Filtro per siringa (0,22 μ m)VWR International28145-501
Provetta per coltura da 14 mlVWR International60818-725
Incubatore per colture cellulariEppendorf ScientificM13520000
Lavaggio ad ultrasuoniBransonN/A
Fotocamera (Canon Powershot G11)CanonN/A
Tubo conico da 50 mlVWR International89004-364
392187

Riferimenti

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