Colorimetrico rilevamento di batteri Uso tornasole Test

Summary

Descriviamo un protocollo per la rilevazione colorimetrica di E. coli utilizzando una cartina di tornasole modificata che sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA, l'ureasi e le perle magnetiche.

Abstract

Ci sono crescenti richieste di metodi semplici ma comunque efficaci che possono essere utilizzati per rilevare agenti patogeni specifici per applicazioni point-of-care o sul campo. Tali metodi devono essere facili da usare e produrre risultati affidabili che possano essere facilmente interpretati sia dagli specialisti che dai non professionisti. La cartina di tornasole per il pH è semplice, rapida ed efficace in quanto riporta il pH di un campione di prova tramite un semplice cambiamento di colore. Abbiamo sviluppato un approccio per sfruttare la cartina di tornasole per la rilevazione batterica. Il metodo sfrutta un DNAzima che scinde l'RNA specifico del batterio per ottenere due funzioni: riconoscere un batterio di interesse e fornire un meccanismo per controllare l'attività dell'ureasi. Attraverso l'uso di perle magnetiche immobilizzate con un coniugato DNAzima-ureasi, la presenza di batteri in un campione di prova viene trasmessa al rilascio di ureasi dalle perle alla soluzione. L'ureasi rilasciata viene trasferita in una soluzione di prova per idrolizzare l'urea in ammoniaca, determinando un aumento del pH che può essere visualizzato utilizzando la classica cartina di tornasole.

Introduction

I patogeni batterici sono una delle principali cause di morbilità e mortalità globale. Focolai di infezioni nosocomiali, agenti patogeni di origine alimentare e contaminanti batterici nell'ambiente rappresentano una minaccia seria e continua per la salute e la sicurezza pubblica. Per prevenire questi focolai, sono necessari strumenti efficaci che consentano di rilevare gli agenti patogeni in modo tempestivo in una varietà di contesti. Test semplici ma comunque efficaci, portatili ed economici sono molto ambiti, soprattutto nelle regioni che sono suscettibili alle epidemie ma non possono permettersi costose strutture di test. ^1-3 Sebbene esistano una moltitu....

Protocol

1. Preparazione dei reagenti e tamponi

1. 0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)
   1. In un becher 2 L, aggiungere 186,1 g di EDTA a 800 ml di acqua deionizzata distillata (DDH ₂ O). Regolare il pH della soluzione a 8,0 con NaOH pellets. Aggiungere DDH ₂ O ad un volume finale di 1,0 L e trasferire la soluzione in una bottiglia di vetro autoclavabile per autoclave e conservare a 4 ° C.
2. EDTA 10 × Tris-borato (10x TBE)
   1. In un becher di plastica 4 L, aggiungere 432 g di Tris-base, acido borico 200 g, 80 ml ​​di 0,5 M EDTA (pH 8,0) e DDH ₂ O per un volume finale di 4 L. Mescolare con ancoretta....

Results

Il principio della prova del nove batterica è spiegato in Figura 1 Il test utilizza tre materiali principali:. Un DNAzyme RNA-scissione che viene attivato da un batterio specifico, ureasi e perline magnetiche. Il DNAzyme viene utilizzato come elemento di riconoscimento molecolare per ottenere un rilevamento altamente specifica di un batterio di interesse. Ureasi e sfere magnetiche sono utilizzati per ottenere trasduzione del segnale delle attività RNA-scissione del DNAzy.......

Discussion

La definizione dell'azione dell'attività RNA clivaggio di un DNAzyme batterio sensibile ad un banco di prova è reso possibile attraverso l'uso di ureasi e separazione magnetica, come illustrato nella figura 1. Sebbene la dimostrazione della cartina tornasole modificati per rivelare batterica è fatto con una E. coli-dipendente RNA-scissione DNAzyme, ^5,19,20 il design può essere generalmente esteso per qualsiasi DNAzyme RNA-scissione. Data la grande disponibilità di DNAzimi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	VWR AMRESCO	0105
Pellet di idrossido di sodio (NaOH)	BIO BASIC CANADA INC.	SB6789
Tris-base	VWR AMRESCO	0497
Acido borico	AMRESCO	0588
Urea	VWR AMRESCO	M123
40% acrilammide/bisacrilammide (29:1) soluzione	BIO BASIC CANADA INC.	A0007
Saccarosio	Bioshop Canada inc.	SUC507
Blu di bromofenolo	Bioshop Canada inc.	BRO777
Xilencianolo FF	SIGMA-ALDRICH	X-4126
10% sodio dodecil solfato	Bioshop Canada inc.	SDS001
Acido cloridrico (HCl)	CALEDON LABORATORIES LTD	6026
Cloruro di sodio (NaCl)	Bioshop Canada inc.	SOD001
Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES)	Bioshop Canada inc.	HEP001
Cloruro di magnesio (II) esaidrato	VWR AMRESCO	0288
Tween 20	Bioshop Canada inc.	TW508
Adenosina Trifospatica (ATP)	AMRESCO	0220
Acetato di sodio triidrato (NaOAc)	SIGMA-ALDRICH	S8625
Etanolo	Alcoli commerciali	P016EAAN
Tetrametileneetilendiammina (TEMED)	AMRESCO	0761
10% Persolfato di ammonio (APS)	BIO BASIC CANADA INC.	AB0072
Succinimidil 4-(N-maleimidometil) cicloesano-1-carbossilato (SMCC)	ThermoFisher SCIENTIFIC	22360
Dimetil solfossido (DMSO)	CALEDON LABORATORIES	803540
ureasi	SIGMA-ALDRICH	U0251
1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	ThermoFisher SCIENTIFIC	70011-069
0,04% Rosso fenolo	SIGMA-ALDRICH	P3532
10x tampone di reazione della polinucleotide chinasi T4	Lucigen	30061-1
10x tampone di reazione della DNA ligasi T4	Bio Basics Canada	B1122-B
T4 DNA ligasi (5 U/μ l)	Thermo Fischer Scientific	B1122
Luria Bertani (LB) Brodo	AMRESCO	J106
Agar	AMRESCO	J637
T4 polinucleotide chinasi (10 U/μ l)	Lucigen	30061-1
E. coli K12 (MG1655)	ATCC	ATCC700926
Centrifuga	Beckman Coulter, Inc.
Lastre di vetro	CBS scientific	ngp-250nr
distanziatori spessore 0,75 mm	CBS scientific	VGS-0725r
pettine a 12 pozzetti	CBS scientific	VGC-7512
Lampada UV	UVP	95-0017-09
Spettrofotometro (NanoVue)	GE Healthcare	N/A Piastra
metallica	CBS scientifico	CPA165-250
Vortex	VWR International	58816-123
Apparecchio per elettroforesi su gel	CBS scientific	ASG-250
Piastre di Petri	VWR International	25384-342
100 kDa MWCO filtri centrifughi	EMD Millipore	UFC510024
Magnetic Bead (BioMag)	Bangs Laboratories Inc	BM568
Rack di separazione magnetica	New England BioLabs	S1506S
Provette per microfughe,	Sarstedt	72,69
Filtro per siringa (0,22 μ m)	VWR International	28145-501
Provetta per coltura da 14 ml	VWR International	60818-725
Incubatore per colture cellulari	Eppendorf Scientific	M13520000
Lavaggio ad ultrasuoni	Branson	N/A
Fotocamera (Canon Powershot G11)	Canon	N/A
Tubo conico da 50 ml	VWR International	89004-364