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Articolo metodologico

Infezione sperimentale con

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⸱

DOI:

10.3791/54554

⸱

16 novembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology, University of Toronto, 2Toronto General Research Institute, University Health Network, 3Women's College Research Institute

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive come inoculare topi C57BL / 6J con il ceppo EGD di Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) e per misurare l'interferone-γ (IFN-γ) risposte da parte delle cellule natural killer (NK), cellule T natural killer (NKT), e adattiva linfociti T dopo l'infezione. Questo protocollo descrive anche come condurre studi di sopravvivenza in topi dopo l'infezione con una versione modificata del DL 50 dosi del patogeno.

Abstract

L. monocytogenes è un batterio gram-positivo che è una causa di origine alimentare malattie negli esseri umani. infezione sperimentale di topi con questo agente patogeno è stato molto istruttivo sul ruolo delle cellule immunitarie innate e adattative e citochine specifiche immunità dell'ospite contro gli agenti patogeni intracellulari. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule innate durante l'infezione subletale con L. monocytogenes è importante per l'attivazione di macrofagi e il controllo precoce del patogeno 1-3. Inoltre, la produzione di IFN-γ da linfociti memoria adattativi è importante per l'innesco l'attivazione delle cellule innate upon reinfezione 4. La L. monocytogenes modello di infezione quindi serve come un ottimo strumento per indagare se le nuove terapie che sono progettati per aumentare la produzione di IFN-γ avere un impatto sulle risposte IFN-γ in vivo e hanno effetti biologici produttivi come l'aumento gioco batterica o migliorare la sopravvivenza del mouse da parte diinfezione. Qui descritto è un protocollo di base per il modo di condurre le infezioni intraperitoneale di C57BL / 6J topi con il ceppo EGD di L. monocytogenes e per misurare la produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK, cellule NKT e linfociti adattivi mediante citometria di flusso. Inoltre, le procedure sono descritte a: (1) crescere e preparare i batteri per l'inoculazione, (2) misurare carica batterica nella milza e nel fegato, e (3) la sopravvivenza misura animale endpoint. Dati rappresentativi sono inoltre forniti per illustrare come questo modello infezione può essere utilizzato per testare l'effetto di agenti specifici sulle risposte IFN-y a L. monocytogenes e la sopravvivenza di topi da questa infezione.

Introduzione

IFN-γ è una citochina che è cruciale per mediare l'immunità contro i patogeni intracellulari e per il controllo della crescita tumorale 5. L'importanza di questa citochina nella resistenza batterica è evidente nell'osservazione che gli esseri umani con mutazioni nel percorso di segnalazione di IFN-γ sono altamente suscettibili all'infezione con micobatteri e salmonelle 6. Allo stesso modo, i topi carenti di entrambi IFN-γ o difetti del recettore espositive IFN-γ nella resistenza alla micobatteri 7-9 e altri agenti patogeni intracellulari, tra cui L. monocytogenes 10,11, Leishmania importante 12, Salmonella typhimurium 13, e alcuni virus 11. Oltre agli agenti patogeni Lotta contro, IFN-γ gioca un ruolo cruciale in Host-difesa contro i tumori 14. Sebbene maggiore produzione di IFN-γ è utile nel contesto di infezione o tumore, la produzione prolungata di questa citochina è stato collegato to lo sviluppo di autoimmunità sistemica 15-17 e l'accelerazione del diabete di tipo I nei diabetici non obesi modello di topo 18.

Le principali fonti di IFN-γ includono le cellule NK, cellule NKT, γδ cellule T helper, le cellule T 1 (Th1), e linfociti T citotossici (CTL) 5,19,20. IFN-γ migliora sia innata e adattativa per: (1) up-regolazione complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) classe I e II espressione, (2) aumentare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulle cellule presentanti l'antigene, (3) macrofagi migliorare fattori fagocitosi e la produzione di citochine pro-infiammatorie e microbicidi (ad esempio, l'ossido di azoto e le specie reattive dell'ossigeno), (4) promuovere la differenziazione delle cellule T CD4 + naive in cellule effettrici Th1, (5) promuovere il passaggio di classe di anticorpi di immunoglobuline ( Ig) 2a e IgG3 (nel topo), (6) inducendo la produzione di chemochine reclutare cellule immunitarie di siti di infection, e (7) miglioramento delle cellule NK e le risposte CTL 5,19. Data l'importanza cruciale di IFN-γ in risposta dell'ospite agli agenti patogeni e tumori, ricombinante IFN-γ è stato testato come trattamento per varie infezioni e neoplasie (recensito in 19). Tuttavia, a causa somministrazione sistemica di IFN-γ o citochina Th1 promuovere l'interleuchina-12 (IL-12) è associato ad effetti collaterali e dose-correlati tossicità 19,21, vi è interesse a sviluppare strategie alternative per aumentare la produzione di IFN-γ by cellule immunitarie. Sviluppo di nuovi farmaci biologici e piccole molecole richiede in strumenti di screening vivo per verificare se tali agenti aumentare la produzione di IFN-γ durante una risposta immunitaria e se questo si traduce in effetti biologici significativi come l'aumento della sopravvivenza degli animali.

Infezione sperimentale di topi con i gram-positivi batterio L. monocytogenes è stato un modello strumentale perdecifrare il ruolo di IFN-γ in host-immunità contro patogeni intracellulari 1,22. L'infezione dei topi con l'agente patogeno per via endovenosa o per via intraperitoneale (ip) porta alla rapida diffusione dei batteri alla milza e nel fegato, dove diventano internalizzati dai macrofagi residenti e epatociti con cariche batteriche picco nella milza che si verificano tra il 3 e 4 giorni post infezione 1,3,22. La produzione di IFN-γ da parte delle cellule NK è importante per l'attivazione dei macrofagi e la resistenza precoce contro l'agente patogeno 3; tuttavia a dosi elevate infettive, la produzione di IFN-γ può anche essere dannoso alla clearance dei patogeni 23. Cellule NKT sono anche una fonte di IFN-γ nella milza e nel fegato durante il controllo precoce di agenti patogeni 2,24 e questa produzione è stato dimostrato per amplificare la produzione di IFN-γ da altri tipi di cellule, tra cui le cellule NK 2. D'altra parte, in seguito ad azione adattativi linfociti T, cellule T CD8 + in partilare, sono importanti per mediare il gioco del patogeno e della protezione contro reinfezione 1,4,22.

Questo modello di infezione è stato interessante per i ricercatori per una serie di ragioni (rivisto in 1). Innanzitutto, l'infezione con il patogeno è altamente riproducibile e induce una forte Th1 e cellulare risposta immunitaria. In secondo luogo, durante l'infezione subletali, carica batterica è concentrata nel fegato e nella milza dove può essere facilmente misurata. In terzo luogo, l'agente patogeno può essere tranquillamente gestita sotto biosicurezza di livello 2 (BSL2) condizioni. In quarto luogo, l'organismo e la risposta immunitaria che genera sono stati ampiamente caratterizzati. Infine, una varietà di ceppi mutanti e geneticamente modificati sono stati sviluppati che sono disponibili per l'uso.

Qui descritto è un protocollo di base per l'inoculazione di C57BL 6J topi / con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 e per la misura di IFN - γ resposte da NK, NKT e linfociti adattivi post-infezione. Inoltre descritto è come misurare carica batterica nella milza e nel fegato dopo l'infezione subletali e di effettuare studi di sopravvivenza dopo infezione con un modificata LD 50 dose del patogeno. Infine, dati rappresentativi sono mostrati di come questo protocollo può essere usata per selezionare l'effetto di nuovi trattamenti sulle risposte IFN-gamma e la sopravvivenza mouse dalla L. monocytogenes infezione.

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Protocollo

Dichiarazione di sicurezza

Questo protocollo descrive infezione di topi con vivo L. monocytogenes. L'agente patogeno è gestito in modo sicuro in condizioni BSL2 da personale addestrato che non sono immunocompromessi. persone immunocompromessi includono le donne incinte, gli anziani e le persone che sono HIV-infetti o che hanno patologie croniche che richiedono un trattamento con la terapia immunosoppressiva. Il personale deve indossare un camice protettivo laboratorio o camice, guanti, maschera e occhiali di protezione durante la manipolazione dei campioni infetti. Il lavoro descritto nel presente documento sono state eseguite in BSL2 sotto un certificato (# 32876) che è stato rilasciato dalla University Health Network (UHN) Biosicurezza ufficio. Le carcasse di topi infetti o eventuali tessuti inutilizzati erano doppio insaccato e smaltiti nella raccolta rifiuti a rischio biologico. Gabbie da topi infetti sono stati decontaminati anche in autoclave.

Dichiarazione etica

I topi sono stati mantenuti e infettati in un Quaracamera ntine all'interno UHN strutture animali e sono stati curati in conformità con le linee guida stabilite dal Consiglio canadese sulla cura degli animali. Tutte le procedure sui topi sono stati eseguiti sotto il protocollo uso animale # 3214 che è stato approvato dal comitato di cura degli animali UHN. A causa di considerazioni etiche, la morte non è stata usata come un endpoint per gli studi di sopravvivenza. La DL 50 dosaggio modificato riportato qui per L. monocytogenes infezione è stato determinato per essere la dose alla quale il 50% dei topi raggiunto endpoint specifici, consistenti in una perdita del 20% in peso o mostrando almeno due dei seguenti segni clinici: letargia, pelliccia arruffata, la postura ingobbita, respiro affannoso, gli occhi spenti o infossati. I topi sono stati sacrificati quando hanno raggiunto gli endpoint tramite l'esposizione al biossido di carbonio (CO 2) in base alle linee guida impianto uhn.

1. Preparazione degli stock glicerolo per la conservazione a lungo termine

NOTA: Questa procedura descrive come scorte glicerolo dellaEGD ceppo di L. monocytogenes sono preparati da un stock di glicerolo originale. I passaggi che hanno il potenziale di generare aerosol devono essere eseguite all'interno di un armadio biosicurezza certificata (BSC).

  1. Preparare piastre di agar infuso cuore cervello (BHI) per la crescita batterica. Per questo aggiunge 3,8% (w / v) di brodo BHI e 1,5% (w / v) di agar bidistillata H 2 O (DDH 2 O). liquido Autoclave. Una volta che l'agar si raffredda a 50 ° C, erogare liquido in capsule di Petri batteriche (25 ml / piatto) e lasciare lastre secche (scoperti) nel BSC per 1 ora.
    NOTA: Trasferimento BHI agar in un bagno a 50 ° C acqua dopo la sterilizzazione in autoclave per evitare la solidificazione prima di versare piatti. piastre BHI Conservare a 4 ° C a testa in giù (con il lato del supporto in alto) fino al momento dell'uso.
  2. Preparare supporti BHI liquido. Per questo, mescolare 3,8% (w / v) di brodo BHI in DDH 2 O. Autoclave.
  3. Rimuovere glicerolo congelato magazzino del ceppo L. monocytogenes EGD dal -80 ° C congelamentor e disgelo a temperatura ambiente.
  4. Immergere una punta di pipetta sterile in stock di glicerolo scongelati e subito striscia la punta avanti e indietro attraverso una sezione di una piastra di BHI. Questa è la striscia primaria.
  5. Ruotare la piastra di 90 ° C e con una punta di pipetta, trascinare attraverso la prima striscia e stenderlo al prossimo ¼ della piastra (questa è la striscia secondario). Ripetere una volta di più per rendere la striscia terziario.
  6. Girare piatto a testa in giù e incubare a 37 ° C durante la notte. colonie uniformi singole devono essere ottenuti nella ultima serie di striature e visibile tra 16 e 24 ore.
  7. Dispensare 10 ml di brodo BHI sterile in un ventilato tubo da 50 ml sterile. Scegliere una colonia di L. monocytogenes dalla piastra utilizzando un puntale sterile e inoculare il brodo. Incubare la cultura in un 37 ° C incubatore orbitale agitazione durante la notte o fino a OD 600 = 1.0 con le impostazioni a 225 giri al minuto (rpm).
    NOTA: Vetro o PLA usa e gettaSTIC beute possono essere utilizzati anche per batteri coltura. Indipendentemente dal tipo di contenitore utilizzato, assicurarsi che è sterile, ventilati e che il volume di coltura non superi il 20% del volume totale del contenitore per garantire un'adeguata aerazione dei batteri.
  8. Preparare scorte glicerolo mescolando sterile 100% glicerolo con pernottamento coltura liquida batterica in un rapporto 1: 1. Distribuire la miscela batterica / glicerolo in 2 ml fiale criogeniche (500 microlitri / flacone) e fiale di trasferimento a -80 ° C per una conservazione.
    NOTA: i metodi azionari tallone può essere utilizzato anche al posto di scorte glicerolo per memorizzare i batteri. Con questo metodo, microsfere porosi vengono inoculati con una coltura pura di L. monocytogenes e conservati a -80 ° C. Ciascun tallone può essere utilizzato per inoculare una coltura fresca come necessario. Vedi l'elenco dei materiali per ulteriori informazioni.

2. Determinazione della crescita curva di L. monocytogenes in Cultura Giorno

Nota: questa procedura viene descritto come generare la curva di crescita per L. monocytogenes che viene utilizzato per stimare le unità formanti colonie (CFU) per gli studi di infezione. Tutte le fasi che hanno il potenziale di generare aerosol devono essere eseguite all'interno di un BSC certificata.

  1. Prendere 100 ml di coltura durante la notte generato nel passo 1.7 a 10 ml mezzi BHI in un tubo di sfiato 50 ml e crescere a 37 ° C in un incubatore scuotimento (225 rpm, inclinato di 45 °). Utilizzare una provetta non inoculata come controllo.
  2. Prendere 0,5 ml campioni della cultura a intervalli di un'ora (1, 2, 3, 4, 5, 6 hr, ecc.). Diluire ciascuna aliquota 1: 1 (v / v) con BHI media in una cuvetta di plastica. Pipetta su e giù per mescolare. Misurare la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600) utilizzando uno spettrometro. Continuare la coltura dei batteri, fino OD 600 = 1.
  3. Allo stesso tempo, prendere un campione di 100 microlitri della cultura e diluire con 900 ml BHI media in una sterile 1,5 ml MICRtubo ocentrifuge (questa è la diluizione 10 -1). Centrifugare i batteri a 6.000 xg per 5 min, e aspirare il surnatante.
  4. Lavare batteri due volte da risospendere il pellet in 1 ml di BHI media, centrifugazione per 5 minuti a 6000 xg, e quindi aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml BHI media. Preparare una serie di diluizioni di 10 volte di questo campione a BHI mezzi (10 -2 a 10 -9). Distribuire 100 ml di ogni diluente su piastre di agar BHI separati. Incubare le piastre per una notte a 37 ° C in un incubatore.
  5. Il giorno successivo, scegliere piatti che hanno tra 30-300 colonie. Scartare il resto. Contare le colonie su queste tavole. La tabella 1 mostra un esempio di conteggi ottenuti in un'aliquota che è stata presa quando OD 600 = 0,84. In questo esempio, una delle piastre (cioè, 10 -6 diluizione) avevano conteggio delle colonie tra 30 minuti - 300 ed è stato utilizzato per il calcolo CFU / ml.
    NOTA: Piastre con maggioredi 300 colonie non vengono utilizzati, dal momento che il sovraffollamento può ostacolare la crescita batterica e rende anche difficile da discernere e enumerare le singole colonie. Piastre con conteggi <30 non vengono utilizzate anche perché piccoli errori di tecnica di diluizione o la presenza di contaminanti possono avere un grande impatto sulla precisione dei conteggi all'estremità inferiore della gamma.
  6. Dividere il numero di colonie dal volume placcato e poi moltiplicare per il fattore di diluizione per ottenere il valore / ml CFU per una particolare diluizione. Nell'esempio della Tabella 1, il conteggio alla diluizione 10 -6 era 70. dividere questo valore di 0,1 ml per ottenere il valore / ml CFU per coltura diluita. Poi moltiplicare questo valore per il fattore di diluizione (10 6) per ottenere il valore / ml CFU della coltura diluito (7,0 x 10 8).
  7. Tracciare la OD 600 (asse y) in funzione del tempo in ore (asse x) per identificare la fase logaritmica di crescita 26.
    NOTA: Questo curv crescitae fornisce una stima del CFU / ml della coltura giorno se coltivate in una certa lettura OD. Scegliere un OD 600 lettura che è in fase logaritmica di crescita che può essere utilizzato come OD porta 600 per la coltivazione di colture giorno. Questi dati possono ora essere utilizzati per stimare la CFU in una cultura per la preparazione di inoculo (Procedura 3).

3. Preparazione dell'inoculo per infezione sperimentale con L. monocytogenes

NOTA: Questa procedura descrive la preparazione dell'inoculo infettante da una cultura giorno che è stato avviato da una coltura durante la notte (preparato in Procedura 2). Tutte queste operazioni vengono eseguite nel BSC se non diversamente indicato.

  1. Calcolare il numero di CFU richiesti per l'infezione in base al numero di topi e il disegno sperimentale dello studio. Aggiungere un volume adeguato di BHI media per un pallone o una cultura tubo Erlenmeyer ventilati sterile.
    NOTA: Il CFU di batteri prepared dipenderà dal tipo di esperimento condotto. Per studiare NK e le risposte delle cellule NKT durante l'infezione, ogni mouse viene inoculato con 10 5 CFU di batteri (Procedura 6). Se lo studio adattative risposte delle cellule T a infezioni o di misura della carica batterica, ogni mouse viene inoculato con 2 x 10 4 CFU di batteri (Procedura 8). Se lo studio di sopravvivenza agli endpoint, ogni mouse viene inoculato con il DL 50 dosi del patogeno (che è 10 5 CFU per i maschi e 1,5 x 10 5 CFU per le femmine, vedere Procedura 9).
  2. Seminare il tubo contenente mezzi BHI con 100 ml di cultura durante la notte. Incubare la cultura in un 37 ° C incubatore agitazione orbitale (225 rpm) fino a destinazione OD 600 è raggiunto. Trasferire contenuti della cultura in una provetta sterile.
  3. batteri centrifuga in un pellet per 5 minuti a 6000 xg utilizzando una centrifuga. Aspirare il surnatante con un aspirapolvere attaccato ad un pallone trappola contenente candeggina.
  4. Lavare pellet due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS), centrifugazione (5 min a 6000 xg) in mezzo.
  5. Aspirare il secondo lavaggio e diluire i batteri alla concentrazione adeguata in PBS 1x per consegnare il CFU di interesse per ogni mouse in un volume di 200 ml.
    NOTA: Si consiglia di utilizzare una fonte commerciale di sterile PBS 1x per i batteri lavaggio e per la preparazione della inoculo, in quanto laboratorio di vetreria può introdurre contaminanti immunologiche, come lipopolisaccaride.

4. infezione sperimentale di topi con L. monocytogenes

NOTA: Questa procedura descrive come infettare i topi con l'inoculo preparato in Procedura 3 e come verificare l'CFU consegnato nel inoculo. Manipolazione di topi e iniezioni vengono eseguite in un BSC.

  1. Ordinare un numero sufficiente di C57BL 6J topi maschio o femmina / per l'esperimento. ordinare anche i topi per servire come controlli non infetti.
  2. Lasciare i topi aacclimatarsi per 1 settimana prima inoculazione batterica.
    NOTA: Questo è perché lo stress associato con il trasporto degli animali può innescare un aumento transitorio nella produzione di ormoni dello stress e linfopenia 27,28.
  3. Il giorno di inoculazione, ottenere un peso corporeo iniziale per ogni mouse e registrare nel quaderno laboratorio.
  4. Nel BSC, miscelare la sospensione batterica su e giù con una pipetta sterile per garantire che i batteri siano distribuiti uniformemente e poi prendere 200 ml di inoculo in una siringa multistrato 1 ml sicurezza con ago 25 G.
  5. Iniettare un IP mouse con 200 ml di inoculo preparato (ad esempio, 10 5 CFU per l'infezione delle cellule NK, Procedura 6). Per questa procedura, collottola topi con la mano meno dominante afferrando la pelle flaccida intorno alle spalle del mouse. Dopo aver verificato che il mouse sia ben trattenuto, iniettare il mouse nel quadrante inferiore dell'addome, appena lateralmente al midline per evitare la vescica.
  6. Smaltire l'ago e la siringa in un contenitore a rischio biologico taglienti.
  7. Ripetere i passaggi 4,3-4,6 fino a quando tutti i topi vengono iniettati. Condurre le operazioni simili con 1x PBS iniettato topi (controlli non infetti).
    NOTA: Dal momento che l'UFC è una stima basata sulla curva di crescita, è anche buona norma verificare l'effettiva CFU nel inoculo. Per questo, preparare 3 - 4 diverse diluizioni del inoculo preparato (con serie di diluizioni di 10 volte) che ci si aspetta si tradurrà in colonie numerabili. Distribuire 100 ml di ogni diluente su una piastra di agar BHI e incubare una notte a 37 ° C. Contare le colonie e calcolare il reale CFU / ml, come descritto nella procedura 2.

5. Preparazione al calore ucciso L. monocytogenes per gli Studi immunitario

NOTA: Tutte le fasi che hanno il potenziale di generare aerosol sono svolte all'interno del BSC.

  1. Grow cultura giorno fino a OD 600 valori di unri raggiunto che sono all'interno della fase logaritmica. Dispensare cultura in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Incubare le provette a 70 ° C in un bagno d'acqua per 1 ora per uccidere i batteri.
  3. Lavare i batteri due volte con PBS 1x come nei passaggi 3.3 e 3.4. Risospendere in mezzi RPMI completo sterili contenenti siero di vitello fetale (FCS) (vedi supplementare File 1 per ricetta) ad una concentrazione di 4 x 10 6 / ml. Aliquota ha ucciso i batteri in 2 ml fiale criogeniche sterile e conservare a -80 ° C.
  4. Confermare la morte dei batteri attraverso la diffusione di 100 ml di preparazione batteri ucciso al calore sulle piastre di agar BHI e incubando overnight a 37 ° C.
    NOTA: Questi batteri ucciso al calore dovrebbe essere pronto per stimolare i linfociti in coltura in Procedura 8. Se ci sono colonie che crescono sulla piastra di agar BHI, ripetere la procedura di calore-uccisione.

6. Misure di IFN-gamma Risposte da NK e NKT cellule durante l'infezione

NOTA: Questa procedura descrive come misurare le risposte IFN-gamma da parte delle cellule NK e NKT nei topi a 24 ore dopo l'infezione con 10 5 CFU dei L. monocytogenes. Questa dose viene utilizzato perché induce robuste risposte IFN-gamma da parte delle cellule NK e NKT nella milza 24. Esegue tutte le fasi della BSC. Per aiutare a mantenere la vitalità delle cellule, a mantenere le cellule in ghiaccio, quando possibile e utilizzare i buffer ghiacciate.

  1. Seminare topi come descritto nella Procedura 4 con 10 5 CFU dei L. monocytogenes. Allo stesso tempo, iniettare topi di controllo non infetti IP con un volume uguale di 1x PBS.
  2. Euthanize topi a 24 ore post-inoculazione da CO 2 inalazione secondo le linee guida istituzionali.
  3. Lie ogni mouse sul lato destro e bagnare la pelle con il 70% di etanolo con una bottiglia a spruzzo.
  4. Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici duri taglio, incidere la pelle appena sotto la parte inferiore della gabbia toracica.
  5. Spray giùlo strato muscolare esposta con il 70% di etanolo. La milza dovrebbe essere visibile sotto lo strato muscolare (aperta freccia testa nella figura 1).
  6. Utilizzando pinze asettiche o sterili e forbici sottili, incidere lo strato muscolare per rivelare la milza. afferrare delicatamente la milza con le pinze e usare le forbici per tagliare bene la milza lontano da tessuto connettivo circostante.
  7. Posizionare la milza in un tubo da 15 ml contenente sterile PBS 1x.
  8. Half-riempire capsule di Petri sterili con sterili 1x PBS. Dissociare la milza attraverso un colino 70 micron cella nylon nella capsula di Petri con la parte piatta di una siringa sterile da 3 ml.
  9. Trasferire la sospensione splenocyte in una sterile tubo da 15 ml per mezzo di una sterile 10 ml pipetta sierologica.
  10. Centrifugare i campioni a 335 xg per 10 minuti a 4 ° C.
  11. Aspirare il surnatante in un pallone trappola contenente candeggina. Allentare il pellet di cellule muovendo il tubo con un dito o trascinando il tubo in bassoavanti e indietro lungo una superficie corrugata (es flusso sfiato nel BSC).
  12. Lyse globuli rossi con l'aggiunta di 1,5 ml di ammonio-cloruro-Potassio (ACK) tampone di lisi (vedi Supplemental File 1 per ricetta) per ogni milza. Dopo esattamente 1 minuto e 15 secondi, riempire il tubo con PBS 1x per fermare la lisi cellulare.
  13. cellule centrifuga come descritto al punto 6.10. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di cellule di fluorescenza-attivato (FACS) Buffer (sterile 1x PBS contenente 2% FCS).
  14. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Per questo, prendere due aliquote di sospensione cellulare per il conteggio. Aggiungere 15 ml di ciascuna sospensione cellulare in un uguale volume di Trypan blue (0,04%, fatta diluendo 0,4% trypan blue soluzione in DDH 2 O). Carico 15 ml di ciascuna cella / Trypan blue sospensione nella camera del emocitometro (cioè, uno nella camera superiore, uno nella camera inferiore).
  15. Utilizzando un microscopio, contare tutte le cellule non-blu incinque grandi piazze della griglia centrale in ciascuna camera (Figura 2). Prendere questo conteggio e dividerlo per 10 per ottenere il numero di cellule in 10 6 / ml. Nell'esempio di figura 2, il conteggio è di 215 cellule nei 5 quadrati; Pertanto, la concentrazione cellulare è 21,5 x 10 6 / ml. Calcolare la media dei concentrazioni cellulari ottenute dai due campioni.
  16. Seed 1 x 10 6 cellule per pozzetto / macchia in un piatto fondo rotondo a 96 pozzetti per citometria a flusso colorazione. Assicurati di seminare anche le cellule per uno senza macchia e la fluorescenza meno controlli (FMO). Vedere flusso consigliato citometria pannello colorazione nella tabella 2.
    NOTA: Per le seguenti operazioni, si raccomanda di mantenere le cellule in ghiaccio o a 4 ° C e per proteggere le cellule dalla luce con un foglio quando fluorocromi sono presenti. Una pipetta multicanale può essere usato per erogare liquidi in piastre a 96 pozzetti di colorazione per accelerare l'elaborazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet quandoaspirare il supernatante dalla piastra centrifugato. La colorazione può essere effettuata anche in tubi FACS se la centrifuga non è dotato di adattatori piastra. Tutte le fasi di centrifugazione da questo punto in poi sono fatte a 456 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  17. Centrifugare la piastra e poi lavare le cellule due volte con tampone FACS. Un lavaggio è fatto aggiungendo 200 microlitri di tampone FACS a ciascun pozzetto, centrifugazione la piastra, e quindi aspirare il surnatante.
  18. Eseguire il passaggio di blocco con l'aggiunta di 50 ml / pozzetto di tampone FACS contenente anti-topo CD16 / CD32 (purificata blocco Fc) (0,5 mg). Incubare le cellule a 4 ° C per 15 min. Lavare le cellule una volta in PBS 1x come descritto sopra.
  19. Aggiungere 100 microlitri vitalità colorante (dye vitalità risolvibile diluito 1: 1000 in PBS 1x) per le cellule. cellule Stain a 4 ° C al buio (in frigorifero) per 30 min. Lavare le cellule due volte in tampone FACS come descritto sopra.
  20. Dopo un secondo lavaggio, aggiungere 100 ml di anticorpi di superficie cellulare o tetrameri a rispettivi pozzetti secondo to il pannello colorazione descritte nella Tabella 2. cellule Stain a 4 ° C al buio (in frigorifero) per 30 min. A questo punto, aggiungere anche gli anticorpi per la colorazione singoli controlli positivi e FMO.
    NOTA: Per quanto riguarda singoli controlli positivi, si consiglia di entrambi splenociti d'uso che sono macchiati con le varie versioni fluorocromi dell'anticorpo CD4 o sfere di compensazione commerciali che si sono macchiati con gli anticorpi utilizzati nel pannello. Prima di svolgere questa procedura di colorazione, tutti gli anticorpi FACS deve essere aggiustato con studi di prova per determinare le concentrazioni ottimali per la colorazione.
  21. Lavare le cellule due volte in tampone FACS come sopra descritto e quindi fissare le cellule da essi risospendere in 50 ml di paraformaldeide al 4% (16% paraformaldeide magazzino diluita in DDH 2 O) e incubando per 10 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: La paraformaldeide è tossico e deve essere maneggiato solo nella cappa.
  22. Lavare le cellule due volte in buffer di FACS, centrifugazione in mezzo. Risospendere le cellule in tampone FACS. Continuare a successivi cellule step o conservare in frigorifero al riparo dalla luce per un massimo di tre giorni.
  23. cellule centrifuga, rimuovere il surnatante e lavare le cellule due volte con 150 ml di 1x Permeabilizzazione / Wash Buffer (tampone di Perm / Wash), centrifugazione in mezzo. Il / Wash Buffer Perm viene preparato da uno stock 10x diluendo 1: 9 (v / v) in DDH 2 O.
  24. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in 150 microlitri di Perm / tampone di lavaggio e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
  25. cellule centrifuga di nuovo e poi aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 50 ml di tampone 1x Perm / Wash contenenti anti-IFN-γ e incubare per 1 ora a 4 ° C al buio.
  26. Lavare le cellule due volte con tampone 1x Perm / Wash, centrifugazione in mezzo. Risospendere le cellule in 250 ml di buffer di FACS e poi trasferire le cellule a tubi FACS.
  27. Procedere alla citometria a flusso acquisizione utilizzando un flusso cytometer che ha una configurazione laser e filtro insieme appropriato di discriminare fluorocromi usati nel pannello colorazione descritto nella Tabella 2 29. Raccogliere almeno 200.000 eventi per campione e 10.000 eventi per i controlli di compensazione.
  28. Applicare matrice di compensazione e analizzare i dati utilizzando citometria a flusso software di analisi 30.

7. Misura della carica batterica nella milza e il fegato al momento dell'infezione Peak

NOTA: Tutte le operazioni vengono eseguite all'interno di un BSC se non diversamente specificato.

  1. Inoculare topi IP con 2 x 10 4 CFU del patogeno utilizzando procedure descritte in Procedura 4.
  2. Il giorno 3 dopo l'infezione, preparare sterili provette da 1,5 ml microcentrifuga, ciascuna contenente 500 ml di ghiacciata sterile 0,1% Triton X-100 in PBS 1x e 0.2 - 0.3 g di 1,5 - perline di vetro sterile d'acido 2 mm. Pesare ogni tubo.
    NOTA: Perle di vetro sono l'acido lavati da incumacerazione in acido acetico al 10% in un becher su un agitatore magnetico per 1 ora. Queste perle sono poi ampiamente lavati con DDH 2 O per rimuovere l'acido, sono essiccati all'aria, e poi in autoclave prima dell'uso.
  3. Euthanize topi di esposizione CO 2.
  4. Per la dissezione degli organi, gettare l'animale sul dorso su una tavola di dissezione e pin le membra del mouse al bordo con 25 aghi G. Disinfettare la pelle bagnando con il 70% di etanolo.
  5. Utilizzando sterili forbici taglio difficili, fare una incisione mediana nella pelle dall'inguine alla metà petto e poi dalla metà inguine verso ciascun ginocchio e dalla metà petto verso ogni curva. sezionare Blunt e riflettere indietro la pelle, pinning è aperto con 25 aghi G.
  6. Disinfettare strato muscolare bagnando con il 70% di etanolo e poi con le forbici sottili sterili fare una incisione mediana nella parete peritoneale. Afferra il processo xifoideo con una pinza. Poi, usando le stesse forbici sottili, fare dei tagli nella parete peritoneale dalla proce xifoidess lateralmente su ciascun lato, a seguito della gabbia toracica, appena sotto il diaframma per rivelare il fegato.
  7. Tagliare un pezzo mg ~ 100 del fegato (utilizzare lo stesso lobo per tutti i mouse) con le forbici sterili e collocarlo in un tubo di 1,5 ml di pre-pesato microcentrifuga.
  8. Utilizzare pinze di spingere da parte gli organi sul lato sinistro della cavità peritoneale per visualizzare la milza. afferrare delicatamente la milza con un paio di pinze e rilasciarlo dalla cavità peritoneale tagliando via il tessuto connettivo circostante.
  9. Posizionare la milza nel tubo pre-pesato 1,5 ml microcentrifuga contenente microsfere. Transport tessuti al laboratorio in un recipiente contenente ghiaccio a perfetta tenuta. Re-pesare i tubi contenenti gli organi per determinare i pesi dei tessuti in mg.
  10. Omogeneizzare i tessuti agitando i tubi utilizzando un cordone mulino omogeneizzatore per 3 min a frequenza 30 Hertz.
    NOTA: Il metodo mulino tallone è preferito per omogeneizzazione in quanto è suscettibile di procescantare un gran numero di campioni e crea meno confusione e potenziale esposizione al patogeno. Tuttavia, omogeneizzatori automatiche o sterilizzati in autoclave 2 ml omogeneizzatori di tessuto di vetro manuale potrebbero essere utilizzati come alternativa.
  11. Preparare una serie di diluizioni di 10 volte degli omogenati a 0,1% Triton-X-100 in PBS 1x, che vanno da (da non diluito a 10 -7).
  12. Distribuire 100 ml di ogni omogenato diluito su una piastra di agar BHI (in duplice copia) utilizzando una spatola sterile. piastre di trasferimento ad un 37 ° C incubatore e incubare una notte.
  13. Mantenere le piastre che contengono da 30 a 300 colonie / piastra, scartare il resto. Contare colonie su ciascuna piastra e determinare il numero medio di colonie per spread duplicati.
  14. Calcolare il CFU / mg secondo la seguente equazione:
    CFU / mg = CFU / ml nel omogeneizzato, moltiplicata per i ml di omogenato preparati, diviso per il peso mg del tessuto omogeneizzato.
    NOTA: Ad esempio, se una media di 30 colOnies state contate dopo la placcatura 100 pl di 10 -2 omogenato diluito preparata da un pezzo 120 mg di fegato che è stato omogeneizzato in 0,5 ml, i calcoli sarebbe come segue:
    (Fattore di diluizione) / ml = 30 colonie x 100 CFU / ml (0,1 volumi spread) = 30.000 CFU / ml.
    CFU / mg = 30.000 CFU / ml x 0,5 ml omogeneizzato / 120 mg di tessuto = 125 CFU / mg.

8. Effetti di L. monocytogenes sulle risposte IFN-gamma da parte CD4 + e CD8 + cellule

NOTA: Questa procedura descrive come misurare la produzione di IFN-γ da milza CD4 + e cellule effettrici T CD8 + raccolte al momento del picco della risposta adattativa immunitaria (~ 7 d post-infezione) utilizzando due metodi: (1) il flusso citometria di misurare IFN-gamma da CD4 + e CD8 + da intracellulare colorazione delle citochine, e (2) ELISA per misurare i livelli totali di IFN-γ prodotti da splenociti (include tutte le cellule T). procedurevengono eseguite all'interno del BSC.

  1. Infect topi iniettando ip con 2 x 10 4 CFU del patogeno utilizzando procedure descritte nella Procedura 4.
  2. Il giorno 7 dopo l'infezione, eutanasia topi da CO 2 inalazione secondo le linee guida istituzionali.
  3. Sezionare la milza (come descritto sopra) e mettere in un tubo da 15 ml contenente sterile PBS 1x. Trasportare i tubi al laboratorio in un recipiente contenente ghiaccio a tenuta stagna.
  4. Elaborare la milza in una sospensione singola cella, la lisi dei globuli rossi come descritto nella sezione 6, e poi risospendere le cellule in mezzi RPMI completo contenente il 10% FCS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  5. Impostare le culture per la misurazione delle risposte IFN-g. Per queste cellule di erogazione (4 x 10 6 in 1 ml / pozzetto) in piastre da 24 pozzetti insieme e uguale numero (4 x 10 6 o 1 ml / pozzetto) di calore ucciso scongelati L. monocytogenes (preparato in Procedura 5) . Trasferire le cellule in un 37° C incubatore.
  6. Dopo 20 ore di incubazione, aggiungere 0,66 microlitri / ml di inibitore della proteina di trasporto di pozzi e continuare incubazione.
  7. Quattro ore più tardi, piastra di trasferimento BSC e raccogliere 500 ml di cultura surnatante e congelamento (a -80 ° C) per la misura successiva di livelli di IFN-gamma utilizzando un kit commerciale 31 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Poi raccogliere le cellule in una provetta sterile 15 ml. Lavare i pozzetti con PBS 1x e in comune questo lavaggio insieme con cellule raccolte.
  8. Effettuare la colorazione della superficie cellulare e colorazione intracellulare per IFN-γ on CD4 + e CD8 +, come descritto nella Procedura 6 eccezione di usare il pannello di colorazione descritta nella Tabella 3. Procedere al citofluorimetro acquisizione (la raccolta di 200.000 eventi / campione) e analizzare i dati 29 citometria a flusso software di analisi 30.

9. Misurare il mouse di sopravvivenza agli endpoint dopo L. monocytogenes infezione

NOTA: Questa procedura descrive l'effetto di un agente sulla sopravvivenza del mouse per gli endpoint post-infezione con il DL 50 modificato la dose del patogeno. Tutte queste procedure sono condotte nel BSC nel stabulario.

  1. Iniettare topi IP con il DL 50 modificato dose di L. monocytogenes, come descritto nella Procedura 4. Questo è stato determinato per essere 10 5 CFU (per i maschi) o 1,5 x 10 5 CFU (per le femmine) 31.
  2. Seguire topi due volte al giorno per i segni clinici e registrare questi segni e peso corporeo degli animali in un quaderno di laboratorio. Euthanize topi se mostrano una perdita del 20% del peso corporeo o due segni clinici di listeriosi (letargia, pelliccia arruffata, la postura ingobbita, respiro affannoso, gli occhi spenti o incavati).
  3. Dopo 14 giorni, sopravvivendo eutanasia topi con CO 2 inalazione.
  4. Preparare Kaplan-Meier appezzamenti di dati tracciando la sopravvivenza per cento di ogni gruppo contro il tempo 32.
    Nota: se i topi soccombere all'infezione (incontrare gli endpoint descritti nella Dichiarazione Etica), questo di solito avviene per giorno 5 dopo l'infezione (Figura 7).

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Risultati

La figura 3 presenta alcune tipico flusso citometria colorazione di IFN-γ in cellule NK e NKT milza a dopo l'infezione 24 ore con 10 CFU 5 del patogeno. Questa figura illustra anche la strategia di gating per il pannello colorazione descritto nella Tabella 2. La figura 4 mostra alcuni dati rappresentativi che sono stati ottenuti in un esperimento in cui i topi maschi sono stati trattati con la IS001 o il veicolo di control...

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Discussione

Qui si descrive un protocollo di come effettuare una infezione sperimentale di base con il ceppo EGD di L. monocytogenes 25 in C57BL 6J maschi o femmine /. Questo protocollo è stato istituito con lo scopo di studiare l'effetto di un romanzo piccola molecola IS001 sulla produzione di IFN-γ da parte dei linfociti innata e adattativa in vivo 31. Monitorando la clearance batterica e la sopravvivenza dopo l'infezione, intuizioni sono state acquisite in modo questi cambiamenti n...

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Dichiarazioni

Nessun conflitto di interessi da divulgare.

Ringraziamenti

Lo sviluppo di questo protocollo è stato supportato da una sovvenzione operativa da CIHR (MOP97807) a SED.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Brodo per infusione di cuore cerebrale,BD299070qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
AgarBD214010qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Triton X-100Sigma-AldrichX100qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
1x PBSSigmaD8537qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
TissueLyser IIQiagen85300qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Cloruro di ammonio (NH3Cl)qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
KHCO3qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Na2EDTAqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
RPMI 1640Gibco22400089qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Siero fetale bovino Gibco12483Prima dell'uso, inattivare a caldo a 56 gradi C per 30 min
L-glutamminaGibco25030qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Aminoacidi non essenzialiGibco11140qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Penicillina / StreptomicinaGibco15140qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (contenente Monensin)BD554724Utilizzare 4 μ l in 6 ml di coltura cellulare
16% ParaformaldehyeMicroscopia elettronicaScienze 15710Diluire al 4% di PFA in ddH2O o 1x PBS
10x tampone Perm/WashBD554723Diluire 1x in ddH2O
blocco Fc, Anti-Topo CD16/CD32 PurificatoeBioscience14-0161Diluire 1:50
Colorante di vitalità riparabile eFluor 506eBioscience65-0866Diluire 1:1.000 (abbiamo utilizzato anche coloranti vitali di Molecular Probes)
anti-Mouse CD4-PE-Cy5 (GK1.5)eBioscience15-0041Il produttore raccomanda una certa dimensione del test; tuttavia questa dovrebbe essere titolata prima dell'uso.
anti-Topo CD8-FITC (53-6.7)eBioscience11-0081Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.
PBS57/mCD1d tetramero-APCNIH Tetramero Core FacilityN/AOttenuto in dono dalla struttura
anti-Mouse TCRβ-PE-Cy7 (H56-597)eBioscience25-5961Il produttore raccomanda una certa dimensione del test; tuttavia questo deve essere titolato prima dell'uso.
anti-Mouse NKp46-APC-eFluor780 (29A1.4)eBioscience47-3351Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.
anti-Mouse CD45 PE-Cyanine7 (30-F11)eBioscience25-0451Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.
anti-Topo IFN gamma-PE (XMG1.2)eBioscience12-7311Il produttore raccomanda una certa dimensione del test, tuttavia questa deve essere titolata prima dell'uso.
OneComp eBeadseBioscience01-1111Utilizzare una goccia per colorante
Kit ELISA IFN gamma per topoeBioscience88-7314Utilizzato per misurare l'interferone gamma nel surnatante di coltura
Provette ventilate da 50 ml per la colturaUtilizzato per la coltura dei batteri, qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
microcentrifuga da 1,5 mlqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
di Petri batterichequalsiasi marca dovrebbe essere appropriata
ml di cyrovialsqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Spettrometroqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
aghi ingegnerizzati di sicurezza qualsiasimarca dovrebbe essere appropriata
C57BL/6JJackson laboratoriesStock#000664Ordina per arrivo a 7 settimane
CandegginaPer la decontaminazione
70% EtanoloPer la decontaminazione
Perle diqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Rotore per centrifuga, secchi, coperchi per secchi.
Microcentrifugaqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
GlicerinaQualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Puntali perQualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
PipettaQualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Strumenti chirurgiciQualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
70 micron filtriqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
siringaqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Pistolaqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Unitàqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Trypan BlueDiluire da 1 a 9 in ddH2O, qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Emocitometroqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
a fondo tondoqualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Tubi FACFisher Scientific14-959-5
BD LSR IIBDQualsiasi citometro a flusso potrebbe essere utilizzato per l'acquisizione che abbia una configurazione laser appropriata e un set di filtri per discriminare il fluorochormes
Flowjo softwareTreestarUtilizzato per l'analisi dei dati. Saranno appropriati anche altri tipi di software di analisi dei dati
Pipettatore multicanale (0 - 300 µ l)EppendorfUtilizzato per il lavaggio delle cellule e l'aggiunta di anticorpi durante la colorazione con citometria a flusso
AcidoUtilizzato per il lavaggio di perle di vetro, qualsiasi marca dovrebbe essere appropriata
Sistema di conservazione battericaMicrobank Pro-lab DiagnosticsUtilizzato come alternativa alle scorte di glicerolo per la conservazione a lungo termine dei batteri
modificato Provette perpiastre 2 UV vetro sterile pipette da 3 ml per pipette di filtrazione Piastre acetico

Riferimenti

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