Articolo metodologico

Sporulazione efficiente di Saccharomyces cerevisiae In un pozzetti formato 96

DOI:

10.3791/54584

⸱

17 settembre 2016

 , 
1Department of Biology, University of Massachusetts Boston

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, la sporulazione di Saccharomyces cerevisiae viene effettuata in un formato a 96 pozzetti.

Abstract

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Durante i periodi di stress nutrizionale, Saccharomyces cerevisiae subisce una gametogenesi, nota come sporulazione. Le cellule di lievito diploidi che sono affamate di azoto e carbonio avvieranno il processo di sporulazione. Il processo di sporulazione include la meiosi seguita dalla formazione di spore, in cui i nuclei aploidi vengono impacchettati in spore resistenti all'ambiente. Abbiamo sviluppato metodi per l'efficiente sporulazione del lievito in gemmazione in 96 piastre multipozzetto, per aumentare la produttività delle cellule di lievito di screening per i fenotipi di sporulazione. Questi metodi sono compatibili con lo screening con plasmidi contenenti lieviti che richiedono una selezione nutrizionale, quando vengono utilizzati terreni minimi appropriati, o con lo screening di lieviti con alterazioni genomiche, quando viene utilizzato un ricco regime di presporulazione. Riteniamo che per questo metodo, l'aerazione durante la sporulazione sia fondamentale per la formazione delle spore e abbiamo ideato tecniche per garantire un'aerazione sufficiente compatibile con il formato di piastre multipozzetto 96. Sebbene questi metodi non raggiungano il tipico livello di sporulazione del ~80% che può essere raggiunto in esperimenti basati su fiasche di grande volume, questi metodi raggiungeranno in modo affidabile circa il 50-60% di livello di sporulazione in piastre multipozzetto di piccolo volume.

Introduzione

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Sporulazione nel lievito erba è stata studiata per fornire approfondimenti molti aspetti della biologia, compreso il controllo della segregazione cromosomica durante la meiosi 1, meccanismi di ricombinazione genetica 2, il controllo dello sviluppo da cellule segnalazione 3, controllo nutrizionale di sviluppo 4, il trascrizionale regolazione dello sviluppo 5, e l'esame di formazione di spore 6. Formazione di spore include un nuovo evento divisione cellulare coinvolge la formazione di nuovi compartimenti di membrana all'interno della cellula madre seguita dalla deposizione di un muro di spore di ....

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Protocollo

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1. Preparazione per Sporulazione

Nota:. I media descritti in questo protocollo sono realizzati con ricette e metodi standard di 13,17 La tabella 1 riporta la formulazione per 1 L di vari supporti utilizzati in questo protocollo.

Bacto Peptone Estratto di lievito Bacto Agar Destrosio....

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Risultati

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Per valutare questo protocollo, efficienze sporulazione ottenuti da sporulanti cellule in piastre a pozzetti multipli (come descritto sopra) sono stati confrontati con cellule sporigeni utilizzando volumi maggiori in beute (Tabella 2). L'uso di piastre a pozzetti multipli non ha raggiunto l'alta efficienza visto quando sporulanti in fiaschi, in cui l'efficienza ~ 80% può essere visto di routine. Sporulanti in piastre a pozzetti multipli con una corretta aerazione (fornit.......

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Discussione

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Qui vi presentiamo un protocollo per sporulanti SK1 lievito in un formato di pozzetti 96. L'aerazione è la chiave per la sporulazione efficiente, che richiede l'utilizzo della propria ancoretta o una perla di vetro in ogni pozzetto. Quando le cellule sono sporulata in una piastra multipozzetto 96 in un incubatore agitazione senza né una perlina o ancoretta, le cellule non sporulino in modo efficiente. Solo un piccolo aumento dell'efficienza sporulazione è visto quando le cellule sono sporigeni senza né un co.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione Joseph P. Healey presso la University of Massachusetts Boston (LSH) e R15 GM86805 dal NIH (LSH). SMP è sostenuto in parte da una Sanofi-Genzyme Fellowship presso l'Università del Massachusetts di Boston.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nunc 1,3 ml Piastre DeepWellThermoScientific260251Utilizzato per la sporulazione
Nunc 2,0 ml Piastre DeepWellThermoScientific278743Utilizzato per la crescita della presporulazione, passo 1.2.3
Perla di vetro da 3 mmFisher11-312AUtilizzato per la sporulazione
Barra di agitazione da 5 mm x 2 mm, confezione da 12Fisher14-511-82Utilizzato per la sporulazione
96 pozzo froggerV& P ScientificVP407
la fotocopiatrice per librerieV& P ScientificVP381necessario per il passaggio 1.2; da utilizzare con la
piastra di Petri rettangolareThermoScientific264728necessario per il passaggio 1.2
Bacto PeptoneBD211677necessario per i terreni
Estratto di lievitoBD212750necessario per i terreni
Bacto AgarBD212750necessario per i terreni
DestrosioFisherD16-3necessario per i terreni
Acetato di potassioFisherP171-500necessario per i terreni
GliceroloFisherG33-500necessario per i terreni
Piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti neraMatTekPBK96G-1.5.5-Fnecessaria per il passaggio 2.4
necessario per passaggio 1.2 frogger

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  2. Keeney, S., Lange, J., Mohibullah, N. Self-organization of meiotic recombination initiati....

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