Sporulazione efficiente di<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; In un pozzetti formato 96

Sommario

Qui, la sporulazione di Saccharomyces cerevisiae viene effettuata in un formato a 96 pozzetti.

Abstract

Durante i periodi di stress nutrizionale, Saccharomyces cerevisiae subisce una gametogenesi, nota come sporulazione. Le cellule di lievito diploidi che sono affamate di azoto e carbonio avvieranno il processo di sporulazione. Il processo di sporulazione include la meiosi seguita dalla formazione di spore, in cui i nuclei aploidi vengono impacchettati in spore resistenti all'ambiente. Abbiamo sviluppato metodi per l'efficiente sporulazione del lievito in gemmazione in 96 piastre multipozzetto, per aumentare la produttività delle cellule di lievito di screening per i fenotipi di sporulazione. Questi metodi sono compatibili con lo screening con plasmidi contenenti lieviti che richiedono una selezione nutrizionale, quando vengono utilizzati terreni minimi appropriati, o con lo screening di lieviti con alterazioni genomiche, quando viene utilizzato un ricco regime di presporulazione. Riteniamo che per questo metodo, l'aerazione durante la sporulazione sia fondamentale per la formazione delle spore e abbiamo ideato tecniche per garantire un'aerazione sufficiente compatibile con il formato di piastre multipozzetto 96. Sebbene questi metodi non raggiungano il tipico livello di sporulazione del ~80% che può essere raggiunto in esperimenti basati su fiasche di grande volume, questi metodi raggiungeranno in modo affidabile circa il 50-60% di livello di sporulazione in piastre multipozzetto di piccolo volume.

Introduzione

Sporulazione nel lievito erba è stata studiata per fornire approfondimenti molti aspetti della biologia, compreso il controllo della segregazione cromosomica durante la meiosi ^1, meccanismi di ricombinazione genetica ^2, il controllo dello sviluppo da cellule segnalazione ^3, controllo nutrizionale di sviluppo ^4, il trascrizionale regolazione dello sviluppo ^5, e l'esame di formazione di spore ^6. Formazione di spore include un nuovo evento divisione cellulare coinvolge la formazione di nuovi compartimenti di membrana all'interno della cellula madre seguita dalla deposizione di un muro di spore di protezione ^6. Questi studi che esaminano le cellule sporulanti spesso approfittano della rapida sporulanti ceppo di lievito SK1, che può subire il processo di sporulazione in circa 24 ore in modo relativamente efficiente ^7,8. Anche se l'ottimizzazione delle condizioni di sporulazione per gemmazione di lievito sono state descritte ^9-13, questi esperimentis esaminato sporulazione su mezzi solidi o in colture liquide scala più ampia in cui è effettuata la sporulazione utilizzando tubi di coltura o flaconi.

Qui si descrive un metodo per sporulanti lievito in un formato piatto pozzetti 96. Troviamo che per questo metodo, aerazione è fondamentale per sporulazione sincrona ed efficiente, e hanno ideato tecniche per assicurare sporulazione sufficiente un formato multipozzetto piccolo volume. Sporulanti in un formato 96 pozzetti piatto permette alle cellule di essere sottoposti a screening utilizzando tecniche high-throughput e reagenti ottimizzati per un formato piatto multipozzetto, tale screening per soppressori di alta copia utilizzando una libreria di piastrelle ^14-16.

Protocollo

1. Preparazione per Sporulazione

Nota:. I media descritti in questo protocollo sono realizzati con ricette e metodi standard di ^13,17 La tabella 1 riporta la formulazione per 1 L di vari supporti utilizzati in questo protocollo.

	Bacto Peptone	Estratto di lievito	Bacto Agar	Destrosio	Acetato di potassio	glicerina	DDH 2 O
piastre YPG	20 g	10 g	20 g	-	-	30 ml	970 ml
piastre YPD	20 g	10 g	20 g	20 g	-	-	1.000 ml
YPD liquido	20 g	10 g	-	20 g	-	-	1.000 ml
YPA liquido	20 g	10 g	-	-	20 g	-	1.000 ml
mezzi sporulazione	-	-	-	-	10 g	-	1.000 ml

Tabella 1:. Formulazioni media importi vengono forniti 1 l di media. Specifiche su supportiingredienti possono essere trovati nella Tabella Materials.

1. Se tutte le celle sporulanti sarà lo stesso genotipo, seguire questa procedura:
   1. Scongelare ceppo di lievito da utilizzare su un (YPGlycerol) Piastra YPG. Grow lieviti per 12-16 ore a 30 ° C. È importante sottolineare che le cellule SK1 sono anche pronti a sporulare, in modo da ceppi SK1 non dovrebbero essere lasciati troppo a lungo su piatti YPG, o possono sporulare sul piatto.
      Nota: Un ceppo appena scongelati coltivate su YPG è preferito, come l'utilizzo di glicerolo come fonte di carbonio richiede fosforilazione ossidativa, e sceglie quindi per cellule che hanno DNA mitocondriale funzionale. cellule SK1 hanno una tendenza a perdere DNA mitocondriale funzionale e diventare petites. DNA mitocondriale funzionale è necessario per sporulazione.
   2. Streak lievito dalla piastra YPG su un (YPDextrose) piastra YPD per singole colonie. Crescere lievito sulla piastra YPD 24-28 ore a 30 ° C.
   3. Dopo circa 36-48 ore di crescita su YPD supporto solido, avviare una cultura di 25 ml YPD utilizzando una singola coloniadalla piastra YPD. Crescere questa cultura fino a quando le cellule sono circa ₆₀₀ OD = 4,0-7,0. Eseguire questo passaggio a 30 ° C per una notte in un incubatore agitazione, agitazione a 220 giri al minuto.
   4. Dalla cultura YPD, utilizzare una quantità appropriata di cellule per iniziare a 1.000 ml di YPA (YPAcetate) cultura che è OD ₆₀₀ = 0,1 per ogni esigenza 96 pozzetti nella sezione 2. crescere il lievito in una agitazione incubatore a 30 ° C (agitazione a 220 rpm) fino a quando la coltura OD ₆₀₀ è compreso tra 1,3 a 1,5.
      Nota: Seminare 100 ml di cultura YPA per ogni piatto pozzetti 96 a proiettato nella sezione 2. Per esempio, se lo screening quattro 96 piastre a pozzetti multipli, saranno necessari 400 ml di cultura YPA. A partire con il 10% in più di volume nella cultura YPA è necessario per proteggere contro la perdita di volume per evaporazione. Tipicamente, ci vorranno tra 12-16 ore per le cellule per raggiungere il diametro esterno adeguato _600; la quantità di tempo può variare a seconda del genotipo del ceppo di lievito. YPA è il supporto presporulation. Pregrowthin acetato aiuta inducono l'espressione di geni (ad esempio IME1) necessario per sporulazione efficiente e sincrona ^6.
   5. Spin a 1.800 xg in una centrifuga da tavolo per 5 minuti per far sedimentare le cellule coltivate in YPA. Lavare le cellule 1x con 0,5 volume di acqua deionizzata sterile in autoclave. Spin di nuovo, e scartare lavare. Risospendere le cellule in 1x supporto del volume sporulazione. Continuare alla Sezione 2.
2. Se si utilizza cellule per sporulazione che sono di diversi genotipi, (vale a dire, trasformate con diversi plasmidi o contenenti diverse mutazioni, in genere ottenuti e memorizzati come scorte congelate), le cellule matrice dei diversi genotipi in un formato pozzetti 96. Quindi, seguire questa procedura:
   1. Utilizzare uno sterile Frogger 96 poli per trasferire le cellule provenienti dalle scorte congelate scongelati a 96 pozzetti piastra (s) sul YPG terreni solidi. Crescere durante la notte di lievito a 30 ° C.
   2. Utilizzando uno sterile frogger 96 poli, trasferire le cellule dal YPG terreni solidi su supporti solidi YPD o selettivomezzi solidi (cioè, terreno minimo sintetico privo aminoacidi, se le celle contengono plasmidi che richiedono la selezione). Grow lievito a 30 ° C fino colonie si formano per ogni ceppo, in genere almeno 1 giorno in YPD e 2 giorni se terreni selettivi è necessario.
   3. Aliquotare 1,2 ml di terreno liquido YPD o supporti liquidi selettivi in ​​ciascun pozzetto di una piastra multipozzetto 96 profonde 2 ml. Trasferire le cellule da supporti solidi in liquidi utilizzando una Frogger, coprire con un coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro adesivo, e crescere durante la notte in 30 ° C shaker, agitando a 220 giri al minuto.
      Nota: Per ridurre al minimo la contaminazione, piastre di copertura utilizzando i coperchi di plastica da una piastra di Petri rettangolare. Tenere coperchi in posto con un pezzo di nastro, in modo che la circolazione dell'aria è minimamente limitata.
   4. piastre centrifugare a 1.800 xg per 5 minuti, utilizzando un secchio centrifuga oscillante con gli adattatori per accogliere 96 pozzetti. Eliminare i media dalle cellule; aggiungere 500 microlitri YPA a ciascun pozzetto e sospendere nuovamente le cellule pellet nel YPA. Copertinacon coperchio in plastica trattenuta da nastro.
   5. Crescere le cellule per 15 ore a 30 ° C in un incubatore agitazione, agitazione a 220 rpm. Continuare alla Sezione 2.

2. Le cellule sporulanti in un multiwell formato 96

1. Aggiungere uno dei due 3 millimetri perle di vetro solido sterile o un sterili 5 mm x 2 mm ancoretta magnetica in ciascun pozzetto di una piastra ben 96 con 1,3 ml di pozzi. (Vedere Rappresentante Risultati al di sotto per una discussione sull'opportunità di usare una perlina o un ancoretta.)
2. Se tutte le celle da schermati sono dello stesso genotipo, vai a 2.2.1. Se le cellule per essere schermati sono di diversi genotipi, andare a 2.2.2.
   1. Prendere le cellule dal punto 1.1.5 e un'aliquota 500 ml di cellule più supporti in ciascun pozzetto della piastra di pozzetti 96. Coprire con il coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro. Procedere alla 2.3.
   2. cellule Spin che sono YPA da 1.2.4 a 1800 xg per 5 minuti, utilizzando un secchio centrifuga oscillante con adattatori per ospitare piastre da 96 pozzetti. versare dif supporti dalle cellule. Aggiungere 500 ml di mezzi sporulazione in ciascun pozzetto e sospendere nuovamente le cellule pellet nei media sporulazione. Coprire con il coperchio di plastica tenuta in posizione da nastro. Procedere alla 2.3.
3. Se si utilizza un perle di vetro, luogo campioni in un incubatore agitazione a 30 ° C e agitare a 220 rpm per sporulazione. Se si utilizza un ancoretta magnetica, I campioni su un piatto mescolare all'interno di un incubatore a 30 ° per la sporulazione.
   Nota: La velocità esatta mescolate per i bar mescolare magnetiche non è molto importante, a patto che tutte le barre si muovono con energia e la cultura è aerato.
4. Per monitorare la progressione attraverso la sporulazione, prelevare campioni dalla cultura sporulanti per la visualizzazione, Aggiungere 6 ml di cellule dalle culture sporulanti a 24 ml di media sporulazione in una piastra da 96 pozzetti coprioggetto (diluizione 1: 5). Lasciare le cellule accontentarsi di 5 minuti prima di esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito.
   Nota: In cellule SK1 wild-type, compatti spore mature formeranno da 36 ore dopo il trasferimento su un supporto sporulazione. La progressione attraverso sporulazione può essere monitorato tramite microscopia utilizzando marcatori fluorescenti, come ad esempio un marcatore nucleare (cioè, Htb2-mCherry ¹⁸⁾ per esaminare la divisione meiotica o un marcatore di membrana prospore (vale a dire, G20 ¹⁹⁾ per esaminare spore morfogenesi. In alternativa, la formazione di spore rifrangenti può essere visto utilizzando Nomarski microscopia DIC partire da circa 12 ore dopo il trasferimento sul supporto sporulazione.

Risultati

Per valutare questo protocollo, efficienze sporulazione ottenuti da sporulanti cellule in piastre a pozzetti multipli (come descritto sopra) sono stati confrontati con cellule sporigeni utilizzando volumi maggiori in beute (Tabella 2). L'uso di piastre a pozzetti multipli non ha raggiunto l'alta efficienza visto quando sporulanti in fiaschi, in cui l'efficienza ~ 80% può essere visto di routine. Sporulanti in piastre a pozzetti multipli con una corretta...

Discussione

Qui vi presentiamo un protocollo per sporulanti SK1 lievito in un formato di pozzetti 96. L'aerazione è la chiave per la sporulazione efficiente, che richiede l'utilizzo della propria ancoretta o una perla di vetro in ogni pozzetto. Quando le cellule sono sporulata in una piastra multipozzetto 96 in un incubatore agitazione senza né una perlina o ancoretta, le cellule non sporulino in modo efficiente. Solo un piccolo aumento dell'efficienza sporulazione è visto quando le cellule sono sporigeni senza né un co...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nunc 1,3 ml Piastre DeepWell	ThermoScientific	260251	Utilizzato per la sporulazione
Nunc 2,0 ml Piastre DeepWell	ThermoScientific	278743	Utilizzato per la crescita della presporulazione, passo 1.2.3
Perla di vetro da 3 mm	Fisher	11-312A	Utilizzato per la sporulazione
Barra di agitazione da 5 mm x 2 mm, confezione da 12	Fisher	14-511-82	Utilizzato per la sporulazione
96 pozzo frogger	V& P Scientific	VP407
la fotocopiatrice per librerie	V& P Scientific	VP381	necessario per il passaggio 1.2; da utilizzare con la
piastra di Petri rettangolare	ThermoScientific	264728	necessario per il passaggio 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	necessario per i terreni
Estratto di lievito	BD	212750	necessario per i terreni
Bacto Agar	BD	212750	necessario per i terreni
Destrosio	Fisher	D16-3	necessario per i terreni
Acetato di potassio	Fisher	P171-500	necessario per i terreni
Glicerolo	Fisher	G33-500	necessario per i terreni
Piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti nera	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	necessaria per il passaggio 2.4

necessario per passaggio 1.2 frogger