Articolo metodologico

Un In Vitro Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

DOI:

10.3791/54592

⸱

8 dicembre 2016

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1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.

Abstract

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L'abbattimento della barriera emato-encefalica (BBB) è un passo fondamentale nello sviluppo di malattie autoimmuni come la sclerosi multipla (SM) e il suo modello animale di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo processo è caratterizzato dalla trasmigrazione delle cellule T attivate attraverso le cellule endoteliali cerebrali (EC), i principali costituenti della BEE. Tuttavia, le conseguenze sulla funzione EC cerebrale in seguito all'interazione con tali cellule T sono in gran parte sconosciute. Qui descriviamo un test che consente di valutare la funzione dell'EC microvascolare cerebrale primaria di topo (MBMEC) e l'integrità della barriera durante l'interazione con le cellule T nel tempo. Il test si avvale della spettroscopia cellulare ad impedenza, un potente strumento per studiare l'integrità e la permeabilità del monostrato EC, misurando le variazioni della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) e della capacità dello strato cellulare (Ccl). A diretto contatto con le EC, le cellule T stimolate ma non naive sono in grado di indurre una disfunzione del monostrato EC, come dimostrato da una diminuzione del TEER e da un aumento del Ccl. Il test registra le variazioni dell'integrità del monostrato EC in modo continuo e automatizzato. È abbastanza sensibile da distinguere tra diverse intensità di stimoli e livelli di attivazione delle cellule T e consente di studiare le conseguenze di una modulazione mirata dell'interazione cellula T-EC utilizzando un'ampia gamma di sostanze come anticorpi, reagenti farmacologici e citochine. La tecnica può essere utilizzata anche come controllo di qualità per l'integrità delle EC nei saggi di trasmigrazione delle cellule T in vitro. Queste applicazioni lo rendono uno strumento versatile per studiare le proprietà della BBB in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.

Introduzione

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La barriera emato-encefalica separa la circolazione sistemica del sistema nervoso centrale (CNS) 1 - 3. Esso fornisce una barriera fisica che inibisce la libera circolazione delle cellule e la diffusione delle molecole idrosolubili e protegge il cervello da agenti patogeni e sostanze potenzialmente nocive. Oltre alla sua funzione di barriera, la BBB consente la fornitura di ossigeno e nutrienti al parenchima cerebrale, che garantisce il corretto funzionamento del tessuto neuronale. Proprietà funzionali del BBB sono altamente regolamentati dai suoi componenti cellulari e acellulari, con EC altamente specializzato essendo il suo elemento strutturale principale. EC della BBB sono caratterizzati dalla presenza di giunzioni strette (TJ) complessi, la mancanza di finestrature, estremamente bassa attività pinocytic, e meccanismi di trasporto permanentemente attivi. Altri componenti della BBB membrana basale CE, periciti incorporamento l'endotelio, i piedi di fascia astrocitari e = par associatienchymal membrana basale contribuiscono allo sviluppo, la manutenzione e la funzione della BBB 2,4 - 6 e, insieme con i neuroni e microglia, formano l'unità neurovascolare (NVU), che permette il corretto funzionamento del CNS 7 - 9.

In una varietà di malattie neurologiche, come neurodegenerative, malattie infiammatorie o infettive, la funzione della BBB è compromessa 2,5,10. Disregolazione di TJ complessi e meccanismi di trasporto molecolari porta ad un aumento della permeabilità BBB, leucociti stravaso, infiammazione e danno neuronale. Al fine di studiare le proprietà di BBB in tali condizioni fisiopatologiche, vari modelli BBB in vitro sono stati stabiliti 9,11,12. Insieme hanno fornito preziose informazioni sui cambiamenti di integrità della barriera, la permeabilità così come meccanismi di trasporto. Questi modelli utilizzano cellule endoteliali di umano, topo, ratto, suina o bovina 13 - 18; cellule endoteliali primarie o linee cellulari sono coltivate sia come monocoltura o insieme con periciti e / o astrociti in modo da imitare più da vicino la BBB in vivo 19 SpA - 25. Negli ultimi anni, la misurazione della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) è diventato uno strumento ampiamente accettata per valutare le proprietà barriera endoteliale 26,27.

TEER riflette l'impedenza al flusso di ioni attraverso il monostrato cellulare e la sua diminuzione fornisce una misura sensibile compromissione dell'integrità barriera endoteliale e quindi aumento della permeabilità. Sono stati sviluppati diversi sistemi di misurazione Teer, tra cui epiteliale Voltohmmeter (Evom), Cell-substrato elettrico impedenza di rivelazione (ECIS), e l'analisi delle cellule in tempo reale 15,28 - 30. TEER riflette la resistenza al flusso di ioni tra EC adiacenti (percorso paracellulare) ed è direttamente proporzionale allaintegrità della barriera. In spettroscopia di impedenza 27,31, impedenza totale complesso (Z) è misurata, che fornisce ulteriori informazioni sulla integrità della barriera misurando Ccl. Ccl riferisce alla corrente capacitiva attraverso la membrana cellulare (percorso transcellulare): lo strato di cellule agisce come un condensatore nel circuito elettrico equivalente, separando le cariche su entrambi i lati della membrana ed è inversamente proporzionale alla integrità della barriera. Quando coltivate su inserti permeabili, EC aderire, proliferano e si sviluppa su la membrana microporosa. Questa resiste alla corrente capacitiva sfondo dell'inserto (che si comporta come un condensatore) e porta ad una diminuzione della capacità fino a raggiungere il livello minimo. Questo è seguito dalla istituzione di TJ complessi che sigillare lo spazio tra EC adiacenti. Questo limita il flusso di ioni attraverso il percorso paracellulare, e TEER aumenta fino a raggiungere il plateau. In condizioni infiammatorie, tuttavia, il endotheliAl barriera è compromessa: TEER diminuisce come complessi TJ ottenere perturbato e Ccl aumenta la componente capacitiva dell'inserto sale nuovamente.

La nostra misura TEER utilizza il sistema automatizzato di monitoraggio cella 32: segue il principio della spettroscopia di impedenza ed estende le sue applicazioni precedenti. Qui, descriviamo un modello in vitro BBB che consente lo studio delle proprietà barriera, compresa l'interazione di endotelio cervello con cellule immunitarie; in particolare le cellule T attivate. Tali condizioni fisiopatologiche sono osservate nelle malattie autoimmuni del sistema nervoso centrale, come la sclerosi multipla e il suo modello animale encefalomielite autoimmune sperimentale 33-37. Qui, un passo fondamentale è la trasmigrazione delle cellule T specifiche per mielina encefalitogenici in tutto il BBB. Questo è seguito dal loro riattivazione nello spazio perivascolare e l'ingresso nel parenchima cerebrale, ove reclutano altre cellule immunitarie e mediato infiammazione e conseguente demielinizzazione 1,35,38. Tuttavia, i meccanismi molecolari dell'interazione tra tali cellule T e le cellule endoteliali, i costituenti principali della BBB, non sono ben compresi. Il nostro protocollo ha lo scopo di colmare questa lacuna e dare nuove intuizioni le conseguenze sulle cellule endoteliali (vale a dire, l'integrità barriera e permeabilità), al loro contatto diretto e complessa interazione con le cellule T attivate.

Il protocollo qui descritto fa uso di cellule endoteliali microvascolari cerebrali di topo primaria, coltivate come un monostrato su inserti permeabili con membrane microporose. Le cellule endoteliali sono co-coltura con cellule T CD4 +, che può essere pre-attivati sia policlonale o in maniera antigene-specifica. Co-cultura MBMECs con cellule pre-attivate, ma non naive T induce una diminuzione TEER e un aumento Ccl, che fornisce una misura quantitativa della MBMEC erettile e barriera interruzione. La tecnicanon è invasivo: utilizza built-in, invece di elettrodi bacchette, che impediscono principali disturbi del monostrato CE; esso può essere utilizzato per monitorare funzione barriera senza l'uso di marcatori cellulari. Rende misurazioni continue in modo automatico e consente una valutazione indipendente dei due parametri barriera (Teer e CCL) contemporaneamente nel corso del tempo. Il metodo è anche abbastanza sensibile per distinguere tra diversi livelli di attivazione delle cellule T e gli effetti di tali cellule T su EC.

Esso può essere utilizzato in una vasta gamma di saggi funzionali: diverse citochine e / o chemochine implicati in processi infiammatori possono essere aggiunti al co-coltura delle MBMECs e le cellule T; bloccanti anticorpi contro molecole di adesione cellulare su entrambi CE o parte delle cellule T possono essere utilizzati; e inibitori di marcatori di attivazione delle cellule T o delle loro proprietà citolitica possono essere aggiunti durante il priming di cellule T o la loro co-coltura con cellule endoteliali. Il saggio è utile anche per la trasmigrazione cellule Tsaggi, come può servire come un controllo di qualità dell'integrità monostrato MBMEC prima dell'aggiunta di cellule T. Tutto questo rende questo metodo uno strumento versatile e affidabile per studiare la BBB in vitro, con una particolare attenzione per l'effetto delle cellule T attivate sull'integrità monostrato CE. Questo è di particolare importanza per la comprensione dei meccanismi della perturbazione BBB nella patogenesi delle malattie autoimmuni, come la sclerosi multipla e il suo modello animale EAE, dove, le cellule T encefalitogenici autoreattive attraversare la BBB e causano infiammazione e danno neuronale.

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Protocollo

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Per tutti gli esperimenti, i topi sono stati allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni nella struttura animali centrale presso l'Università di Münster, secondo le linee guida tedesche per la cura degli animali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida del comitato etico degli animali sperimentali e approvati dalle autorità locali del Nord Reno-Westfalia, Germania (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. MBMEC Isolamento e la coltura

NOTA: isolare MBMECs come precedentemente descritto in dettaglio 14 con le seguenti modifiche:

  1. Sacrificio 20 adulti C57BL 6 topi / (6-8 settimane) da CO 2 inalazione e confermare la loro morte per accertare arresto cardiaco e respiratorio.
  2. Risciacquare il mouse con il 70% di etanolo e decapitare usando le forbici; rimuovere il cuoio capelluto con pinze e forbici. Fare incisioni sul lato destro e sinistro del cranio, partendo dal foro occipitale. Sollevare il cranio dal suo lato caudale e takvia e fuori il cervello con una pinza.
  3. Sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare pinze sterili per posizionare il cervello in una capsula di Petri e rimuovere il tronco cerebrale, cervelletto, e talamo, mantenendo solo la corteccia.
    NOTA: L'uso di un microscopio non è necessario per uno di questi passaggi.
  4. Posizionare la corteccia su un pezzo di carta assorbente sterile occidentale e rotolare delicatamente con una pinza fino meningi non sono più visibili.
  5. Dopo la digestione enzimatica e meccanica (seguendo il protocollo 14), raccogliere le cellule endoteliali dal gradiente di densità utilizzando un lungo ago sterile ed uno stantuffo 5 ml. Le cellule endoteliali appaiono come uno strato torbido sopra l'anello rosso con eritrociti. Trasferimento 20-25 ml di questo strato in un nuovo tubo 50 ml centrifugazione; rabboccare il tubo con DMEM.
  6. Dopo due turni di lavaggio 14, sospendere nuovamente le cellule in 6 ml di mezzo MBMEC contenente puromicina (4 mg / ml) e seminare su sei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti; lasciarli in un tessutocultura incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 (indicato come 'incubatore' da qui in) per tre giorni.
    NOTA: Per i dettagli della soluzione di rivestimento MBMEC, vedi Materiali Tavolo.
  7. Modificare il medium con l'aggiunta di 1 ml a ciascun pozzetto di mezzo fresco MBMEC senza puromicina; mettere la piastra posteriore a 37 ° C e 5% CO 2 per altri due giorni.

2. La raccolta MBMECs

  1. Al quinto giorno dopo l'isolamento MBMEC, pre-coat inserti permeabili con soluzione di rivestimento MBMEC: aggiungere 80 ml di soluzione per inserto e li lasciano a 37 ° C e 5% di CO 2 per 3 ore.
  2. pipetta con attenzione la soluzione di rivestimento e lasciare che il inserti asciugare per 30 minuti. Aggiungere 2 ml di temperatura ambiente (RT) PBS a ciascun pozzetto della piastra, utilizzando MBMECs per lavare il mezzo; ripetere questo passaggio. Aggiungere 0,05% tripsina-EDTA (300 ml per pozzetto) e lasciare la piastra nell'incubatore per 5-10 min.
  3. Aggiungere 2 ml di terreno MBMEC a ciascun pozzetto per arrestaretripsinizzazione. Trasferire le cellule raccolte in una provetta da 15 ml centrifugazione e centrifugare a 700 xg per 8 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno MBMEC senza puromicina.
  4. Contare le cellule; mescolare 10 ml di sospensione cellulare con 90 ml di 0,04% Trypan Blue (10x diluizione delle cellule). Pipettare 10 ml di questo mix tra la copertura in vetro e la camera di conteggio delle cellule (emocitometro). Contare le cellule blu-libere Trypan nei quattro quadranti della camera (N) e determinare il numero medio di cellule contate (N ') come segue: N' = N / 4.
  5. Calcolare la concentrazione cellulare (10 6 cellule / ml), utilizzando la seguente formula: C = N 'x 10 4 x 10, dove 10 4 è dato dalle dimensioni del emocitometro e 10 è il fattore di diluizione dal punto 2.4.
  6. Seed 2 x 10 4 cellule in un volume di 260 microlitri per inserto. Aggiungere 810 pl di mezzo MBMEC al vano inferiore di ogni pozzetto. Posizionare la piastra con inserti in incubatrice fino al momento di procedere con la sezione 4.
    NOTA: I volumi per il vano superiore e inferiore sono specifici di inserimento e non funzionano per tutti i formati da 24 pozzetti.

3. CD4 + T cellule Isolamento e stimolazione

  1. L'isolamento delle cellule T CD4 +
    1. Sacrificare un topo adulto (6-8 settimane) da CO 2 inalazione e confermare la sua morte per accertare arresto cardiaco e respiratorio.
    2. Posizionare il mouse sul dorso su una tavola di dissezione pulito e risciacquare con etanolo al 70%; usare le forbici e pinze sterili per aprire il peritoneo e rimuovere i milza e nei linfonodi inguinali (, ascellare, brachiale e cervicale); infine, trasferire il tessuto in una provetta da 15 ml centrifugazione contenente 5 ml di PBS in ghiaccio.
    3. Sotto la cappa a flusso laminare, trasferire il tessuto per decantazione PBS con il tessuto in un tubo di centrifugazione 50 ml con un filtro 70 micron cella sopra; omogeneizzareil tessuto premendo con un pistone 1 ml attraverso il filtro.
    4. Aggiungere 30 ml di tampone FACS e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di tampone FACS. Filtrare la sospensione attraverso un filtro cella 40 micron, aggiungere altri 20 ml di tampone FACS al tubo.
    5. Centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 500 ml di tampone FACS.
    6. Aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche topo CD4, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 ° C. Aggiungere 25 ml di tampone FACS e centrifugare a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    7. Nel frattempo, posizionare una colonna di separazione LS nel magnete e sciacquarlo con 3 ml di tampone FACS. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di tampone FACS.
    8. Aggiungere cellule alla colonna. Lavare la colonna con 3 ml di tampone FACS per tre volte. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarlo su un nuovo 15 ml Centritubo fugation. Aggiungere 5 ml di tampone FACS, scovare le cellule marcate con lo stantuffo della colonna e centrifugare è a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C.
    9. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 3 ml di terreno delle cellule T. Contare le cellule come descritto in 2.4 e sementi 1 x 10 5 cellule in 100 microlitri di terreno per pozzetto.
  2. T CD4 + cellule Stimolazione
    1. La stimolazione delle cellule T CD4 policlonale +
      1. Pre-coat una piastra a 96 pozzetti a fondo rotondo con purificato anticorpo anti-topo CD3 (clone 145-2C11) in PBS ad una concentrazione finale desiderata. Ad esempio, per pre-coat il piatto pieno con α-CD3 a 1 mg / ml, mescolare 10 ml di anticorpi (magazzino di concentramento = 0,5 mg / ml) con 5 ml di PBS, vortice e aggiungere 50 ml di mix di ogni pozzetto con una pipetta multicanale.
      2. Lasciare la piastra nell'incubatore per 3 ore. Dopo isolare le cellule T, lavare la piastra pre-rivestita due volte con PBS. Aggiungere purificato anticorpo anti-CD28 (clone37.51) alle cellule T isolate ad una concentrazione finale desiderata (ad esempio, a 1 mg / ml); mescolare bene. Seme le cellule T e lasciarli in incubatrice per due o tre giorni.
    2. La stimolazione delle cellule T CD4 + antigene-specifiche con le cellule dendritiche (DC)
      NOTA: se le DC sono utilizzati come cellule presentanti l'antigene (APC), seguire il protocollo per l'isolamento delle cellule T, con le seguenti eccezioni:
      1. Prima di omogeneizzare la milza, iniettarla con 1 ml di Collagenasi tipo IA in PBS a 0,5 mg / ml e trasferirlo ad un tubo di centrifugazione 15 ml.
      2. Incubare a bagnomaria a 37 ° C per 15 min. Dopo il lavaggio con PBS, risospendere il pellet in tampone FACS e aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche del mouse CD11c, invece di microsfere CD4.
      3. Utilizzare una colonna di separazione MS ei volumi appropriati: lavare la colonna con 1 ml di tampone FACS; Risospendere le cellule in 1 ml di tampone FACS e lavare la colonna con 1 ml di FACS buffer di tre volte.
      4. Anno Dominid antigene di scelta ai PVS (ad esempio, la mielina oligodendrociti glicoproteina (MOG) aa 35-55 a 20 mg / ml), mescolare bene e di semi di 5 x 10 4 cellule in 100 ml di terreno di coltura delle cellule T a 96-round-bottom bene.
      5. Aggiungere 1 x 10 5 cellule T in 100 ml di mezzo di coltura cellulare T per 96-round-bottom-bene alla fine, come descritto nel protocollo per T isolamento delle cellule.
    3. La stimolazione delle cellule T CD4 + antigene-specifiche con le cellule B
      NOTA: se le cellule B sono usati come APC, seguire il protocollo per l'isolamento delle cellule T, con le seguenti eccezioni:
      1. Utilizzare la milza di topi transgenici le cui cellule B sono l'antigene-specifica (ad esempio, IgH MOG (Th) i topi, le cui cellule B specificamente riconoscere MOG 35-55).
      2. Utilizzare cellule T antigene-specifiche (ad esempio, da TCR MOG (2D2) topi). Aggiungere 20 ml di microsfere magnetiche topo CD19 invece di microsfere CD4.
      3. Aggiungere l'antigene di scelta al cel BLS (ad esempio, MOG 35-55 a 20 mg / ml), mescolare bene e di semi di 5 x 10 4 cellule in 100 ml di B mezzo di coltura cellulare per 96-round-bottom-bene.
      4. Aggiungere 1 x 10 5 T cellule in 100 ml di terreno di coltura delle cellule T per 96-round-bottom-bene, come descritto nel protocollo per l'isolamento delle cellule T.

4. Configurazione ed esecuzione di misura TEER

  1. Posizionare il modulo 24 pozzetti dello strumento TEER sotto cappa a flusso laminare. Togliere i coperchi e luogo inserti con MBMECs nello strumento con pinze.
  2. Pipettare 810 ml di mezzo fresco al vano inferiore dei pozzetti modulo: inserirlo attenzione tra l'inserto e la parete del modulo bene.
  3. Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento in incubatrice. Collegare lo strumento al suo calcolatore; accendere il controllore strumento e aprire il software.
  4. Seleziona 'nuova misura' nella finestra pop-up. Check 'show TEER' e scatole di 'show Ccl'; quindi premere 'start'. Dopo aver completato la prima misurazione, selezionare 'controllare tutti i pozzetti' nella scheda 'risultati' per vedere tutti i valori Teer e CCL.
  5. Salvare il file: File> Salva con nome> 'il nome del file'.
    NOTA: Come TEER e Ccl sono continuamente misurati in modo automatico, monitorare i loro valori per un periodo di tre-cinque giorni. Cambiando il mezzo non è necessario, a meno vitalità cellulare è ottimale, come visualizzato dalla mancanza di aumento TEER.
  6. Scegliere il punto di tempo di co-coltura con cellule T MBMECs quando Ccl è stabile e inferiore a 1 mF / cm 2 e TEER ha raggiunto il livello massimo.
  7. Ispezionare con cura valori assoluti Teer e CCL ed escludere i pozzi in cui MBMECs non hanno sviluppato confluenti abbastanza monostrati deselezionando tali pozzi.
  8. Gruppo il resto dei pozzi: tasto destro del mouse su un pozzo e selezionare 'aggiungere ben al nuovo pozzo media'. Namvia e nella finestra pop-up; fare lo stesso per tutti i singoli pozzetti da raggruppare.
  9. Controllare tutti i pozzetti medi per confermare che tutti hanno le stesse condizioni iniziali prima della co-coltura. Se alcuni hanno significativamente diversi valori assoluti TEER o TEER piste, o gli errori standard sono troppo grandi, rifare il raggruppamento.
    NOTA: Il raggruppamento ottimale dei pozzi fornisce minima variazione nei valori Teer, sia all'interno che tra i gruppi sperimentali.
  10. Nella scheda 'esperimento', premere 'pausa', scollegare lo strumento e portarlo fuori dell'incubatore. Rimuovere i coperchi sotto cappa a flusso laminare.
  11. Preparare pre-attivato e / o di cellule T naive, con o senza specifiche citochine, anticorpi o altre sostanze, se lo desideri: Per esempio: Mix purificato NA / Le Rat anticorpi anti-topo IFN-γ (XGM1.2 clone) con preparato T cellule, a 20 ug / ml per pozzetto dello strumento TEER.
    NOTA: Se si utilizzano sostanze come inibitore granzima B, sono undded di coltura cellulare T all'inizio di stimolazione delle cellule T: ad esempio, Granzyme B Inhibitor II (Calbiochem) viene mescolato con le cellule T isolate ad una concentrazione finale di 10 mM in DMSO. Vedi Materiali e attrezzature per maggiori dettagli.
  12. Rimuovere alcuni del mezzo dall'inserto (vano ben superiore): per esempio, con attenzione pipetta fuori 150 ml (rimuovendo tutto il supporto deve essere evitata in quanto potrebbe disturbare il monostrato MBMEC).
  13. Aggiungere cellule T di MBMECs pipettando con cautela 150 ml di mezzo contenente 2 x 10 5 cellule / inserto.
    NOTA: quando la raccolta delle cellule pre-attivate T, contare solo brillamento, le cellule Trypan Blue-free.
  14. Chiudere i coperchi e posizionare lo strumento per l'incubatore. Ricollegare lo strumento e premere 'la misura di ripresa'. Dopo 24 ore, premere il tasto 'stop' nella scheda 'esperimento' e salvare il file (File> Salva).

5. Esporta dati e l'analisi statistica

  1. Esportare i risultati scegliendo File> Esporta.
  2. Nella scheda "Impostazioni" della finestra pop-up, selezionare "dot" nell'opzione "separatore decimale" e "tabulatore" nell'opzione "campo delimitatore".
  3. Nella scheda "risultati di esportazione", il nome del file, controllare tutti i pozzi da esportare, e selezionare le caselle "Ccl" "TEER" e l'opzione "scegliere i dati".
  4. Premere il tasto "i dati di esportazione", aprire il file esportato, e copiare i dati in un foglio di calcolo.
  5. Normalizzare i dati esportati (ordinati per ogni replica, con Teer e CCL valori dati per ogni ciclo (di misura)): i valori Set Teer e CCL dell'ultimo punto di tempo prima che il co-coltura al 100% e modificare di conseguenza i valori per tutti gli altri piste, relative al periodo '100%'.
  6. Copiare dati normalizzati ad un software di scelta per generare un grafico, utilizzando singoli pozzetti e visualizzando l'errore standard della media per ciascun gruppo di trattamento.
  7. Perfo rm a due vie test statistico ANOVA con una correzione di Bonferroni per confronti multipli, utilizzando il software statistico di scelta.

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Risultati

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La figura 1 fornisce una panoramica generale del modello in vitro di BBB utilizzato per studiare l'interazione tra cellule T e le cellule endoteliali. L'esperimento consiste di tre fasi principali. Il primo passo è l'isolamento di MBMECs primari da cortecce cerebrali, e la loro cultura per cinque giorni. Quando raggiungono confluenza nella piastra di coltura cellulare, MBMECs vengono tripsinizzate e reseeded su inserti permeabili, che sono successivamente poste ...

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Discussione

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Diverse fasi del protocollo descritto sono essenziali per un esperimento riuscito. Durante l'isolamento MBMEC iniziale e cultura, è essenziale che il lavoro viene effettuato in condizioni sterili per quanto possibile, per evitare la contaminazione della coltura cellulare con spore fungine o batteri. Per ottenere una coltura pura di EC, si raccomanda di utilizzare un supporto contenente puromicina per i primi tre giorni, che consente la sopravvivenza di cellule endoteliali, ma non altri tipi di cellule (in particolar...

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Dichiarazioni

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I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl e L. Klotz non hanno nulla da rivelare. H.-J. Galla è consulente scientifico di nanoAnalytics GmbH, il produttore del monitor cellulare automatizzato.

Ringraziamenti

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Siamo grati a Annika Engbers e Frank Kurth per il loro eccellente supporto tecnico e il Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) per le discussioni utili per quanto riguarda le misure teer. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 progetto A03 di HW e LK, CRC TR128, progetti A08; Z1 e B01 LK e HW, e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (Facoltà di Medicina di Münster) codice di autorizzazione KL2 / 2015/14 a LK.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.comtra cui: Modulo cella a 24 pozzetti, controller, PC con software cellZscope v2.2.2 
UltracentrifugaThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; rotore F21S-8x50y; per citometro a flusso di isolamento MBMEC
Beckman Coulterper l'analisi della trasmigrazione delle cellule T
Software FlowJo7.6.5Tree Starwww.flowjo.comper l'analisi della trasmigrazione delle cellule T
Provette per centrifuga Oak Ridge, PCThermo Fisher Scientific3118-005050 ml; per l'isolamento MBMEC
Inserti a membrana Transwell - dimensione dei pori 0,4 & micro; mCorning3470per la misura TEER come lettura principale
Inserti a membrana Transwell - dimensione dei pori 3 & micro; mCorning3472per la misurazione TEER come controllo di qualità prima del saggio di trasmigrazione delle cellule T
piastra per coltura cellulare a 24 pozzettiGreiner650 180a fondo piatto; per coltura MBMEC
piastra per coltura cellulare a 96 pozzettiCostar3526a fondo tondo; per coltura cellulare immunitaria
Separatore QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976per l'isolamento di cellule T e cellule B; supporta Colonne MACS LS
OctoMACS SeparatoreMiltenyi Biotec130-042-109per l'isolamento di cellule dendritiche; supporta colonne MACS MS
Camera di conteggio NeubauerMarienfeldMF-0640010per il conteggio delle cellule
Filtro cellulare, 70 &; mCorning352350per l'isolamento delle cellule immunitarie
Filtro cellulare, 40 & micro; mCorning352340per l'isolamento delle cellule immunitarie
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303per l'isolamento delle cellule immunitarie
Colonne di separazione MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401per l'isolamento delle cellule T e delle cellule B
Colonne di separazione MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201per l'isolamento delle cellule dendritiche
Microsfere CD4di topoMiltenyi Biotec130-049-201per CD4+ Isolamento delle cellule T
Topo CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201per l'isolamento delle cellule B
Topo CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001per l'isolamento delle cellule dendritiche
Collagene di tipo IV da placenta umanaSigmaC5533per soluzione di rivestimento MBMEC
Fibronectina da plasma bovinoSigmaF1141-5MGper soluzione di rivestimento MBMEC
Collagenasi 2 (CSL2)WorthingtonLS004176per isolamento MBMEC
Collagenasi/Dispasi (C/D)Roche11097113001per isolamento MBMEC
DNasi ISigmaDN25per isolamento MBMEC
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF7524per isolamento MBMEC
Albumina sierica bovina (BSA)Amresco0332-100Gper isolamento MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lper isolamento MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021per isolamento MBMEC e terreno di coltura MBMEC
Penicillina/streptomicinaSigma P4333per isolamento MBMEC e terreno di coltura MBMEC
tamponato con fosfato Soluzione salina (PBS)SigmaD8537per MBMEC e isolamento delle cellule immunitarie
EparinaSigmaH3393per terreno di coltura MBMEC
Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani (bFGF)PeproTech100-18Bper terreno di coltura MBMEC
PuromicinaSigmaP8833per terreno di coltura MBMEC; solo per i primi tre giorni
0,05% Tripsina-EDTAGibco25300-054per la raccolta di MBMEC
Collagenasi Tipo IASigmaC9891per l'isolamento di cellule dendritiche
Soluzione di Trypan Blue, 0,4%Thermo Fisher Scientific15250061per la conta cellulare
EDTASigmaE5134per l'isolamento di cellule immunitarie
IMDM + 1% L-GlutamminaGibco21980-032per terreno di coltura di cellule T
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qproteggere dalla luce; per terreno di coltura di cellule B
β-mercaptoetanoloGibco31350-010per terreno di coltura di cellule B
L-Glutammina (100x Glutamax)Gibco35050-061per terreno di coltura di cellule B
di topo MOG35— 55 peptideBiotrendBP0328per l'attivazione di cellule T antigene-specifiche
CD3 di topo purificatoBioLegend100302clone 145-2C11; per l'attivazione di cellule T policlonali,
CN/LE purificato anti-topo CD28 AbBD Pharmingen553294clone 37.51; per l'attivazione di cellule T policlonali,
IFN murino ricombinante-γPeproTech315-05per saggi di trasmigrazione di cellule T
TNF murino ricombinante-&alfa;PeproTech315-01Aper saggi di trasmigrazione di cellule T
N/LE anticorpo purificato con IFN-&gamma nel topoBD Biosciences554408clone XMG1.2; concentrazione finale consigliata: 20 µ g/ml
Granzyme B Inibitore IICalbiochem368055concentrazione finale raccomandata: 10 µ
M PE anticorpo CD4 anti-topoBiolegend116005clone RM4-4; per l'analisi della trasmigrazione delle cellule T
www.beckmancoulter.com ,,

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