Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.
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Articolo metodologico
Un
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In questo articolo
Sommario
Abstract
L'abbattimento della barriera emato-encefalica (BBB) è un passo fondamentale nello sviluppo di malattie autoimmuni come la sclerosi multipla (SM) e il suo modello animale di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo processo è caratterizzato dalla trasmigrazione delle cellule T attivate attraverso le cellule endoteliali cerebrali (EC), i principali costituenti della BEE. Tuttavia, le conseguenze sulla funzione EC cerebrale in seguito all'interazione con tali cellule T sono in gran parte sconosciute. Qui descriviamo un test che consente di valutare la funzione dell'EC microvascolare cerebrale primaria di topo (MBMEC) e l'integrità della barriera durante l'interazione con le cellule T nel tempo. Il test si avvale della spettroscopia cellulare ad impedenza, un potente strumento per studiare l'integrità e la permeabilità del monostrato EC, misurando le variazioni della resistenza elettrica transendoteliale (TEER) e della capacità dello strato cellulare (Ccl). A diretto contatto con le EC, le cellule T stimolate ma non naive sono in grado di indurre una disfunzione del monostrato EC, come dimostrato da una diminuzione del TEER e da un aumento del Ccl. Il test registra le variazioni dell'integrità del monostrato EC in modo continuo e automatizzato. È abbastanza sensibile da distinguere tra diverse intensità di stimoli e livelli di attivazione delle cellule T e consente di studiare le conseguenze di una modulazione mirata dell'interazione cellula T-EC utilizzando un'ampia gamma di sostanze come anticorpi, reagenti farmacologici e citochine. La tecnica può essere utilizzata anche come controllo di qualità per l'integrità delle EC nei saggi di trasmigrazione delle cellule T in vitro. Queste applicazioni lo rendono uno strumento versatile per studiare le proprietà della BBB in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.
Introduzione
La barriera emato-encefalica separa la circolazione sistemica del sistema nervoso centrale (CNS) 1 - 3. Esso fornisce una barriera fisica che inibisce la libera circolazione delle cellule e la diffusione delle molecole idrosolubili e protegge il cervello da agenti patogeni e sostanze potenzialmente nocive. Oltre alla sua funzione di barriera, la BBB consente la fornitura di ossigeno e nutrienti al parenchima cerebrale, che garantisce il corretto funzionamento del tessuto neuronale. Proprietà funzionali del BBB sono altamente regolamentati dai suoi componenti cellulari e acellulari, con EC altamente specializzato essendo il suo element....
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Protocollo
Per tutti gli esperimenti, i topi sono stati allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni nella struttura animali centrale presso l'Università di Münster, secondo le linee guida tedesche per la cura degli animali. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti secondo le linee guida del comitato etico degli animali sperimentali e approvati dalle autorità locali del Nord Reno-Westfalia, Germania (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).
1. MBMEC Isolamento e la coltura
NOTA: isolare MBMECs come precedentemente descritto in dettaglio 14 con le seguenti modifiche:
- Sacrificio 20 adulti C57BL 6 topi / (6-8 settimane) da C....
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Risultati
La figura 1 fornisce una panoramica generale del modello in vitro di BBB utilizzato per studiare l'interazione tra cellule T e le cellule endoteliali. L'esperimento consiste di tre fasi principali. Il primo passo è l'isolamento di MBMECs primari da cortecce cerebrali, e la loro cultura per cinque giorni. Quando raggiungono confluenza nella piastra di coltura cellulare, MBMECs vengono tripsinizzate e reseeded su inserti permeabili, che sono successiva.......
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Discussione
Diverse fasi del protocollo descritto sono essenziali per un esperimento riuscito. Durante l'isolamento MBMEC iniziale e cultura, è essenziale che il lavoro viene effettuato in condizioni sterili per quanto possibile, per evitare la contaminazione della coltura cellulare con spore fungine o batteri. Per ottenere una coltura pura di EC, si raccomanda di utilizzare un supporto contenente puromicina per i primi tre giorni, che consente la sopravvivenza di cellule endoteliali, ma non altri tipi di cellule (in particolar.......
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Dichiarazioni
I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl e L. Klotz non hanno nulla da rivelare. H.-J. Galla è consulente scientifico di nanoAnalytics GmbH, il produttore del monitor cellulare automatizzato.
Ringraziamenti
Siamo grati a Annika Engbers e Frank Kurth per il loro eccellente supporto tecnico e il Dr. Markus Schäfer (nanoAnalytics GmbH) per le discussioni utili per quanto riguarda le misure teer. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), SFB1009 progetto A03 di HW e LK, CRC TR128, progetti A08; Z1 e B01 LK e HW, e il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (Facoltà di Medicina di Münster) codice di autorizzazione KL2 / 2015/14 a LK.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| cellZscope | nanoAnalytics GmbH | www.nanoanalytics.com | tra cui: Modulo cella a 24 pozzetti, controller, PC con software cellZscope v2.2.2 |
| Ultracentrifuga | Thermo Scientific | www.thermoscientific.com | SORVALL RC 6+; rotore F21S-8x50y; per citometro a flusso di isolamento MBMEC |
| Beckman Coulter | per l'analisi della trasmigrazione delle cellule T | ||
| Software FlowJo7.6.5 | Tree Star | www.flowjo.com | per l'analisi della trasmigrazione delle cellule T |
| Provette per centrifuga Oak Ridge, PC | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 ml; per l'isolamento MBMEC |
| Inserti a membrana Transwell - dimensione dei pori 0,4 & micro; m | Corning | 3470 | per la misura TEER come lettura principale |
| Inserti a membrana Transwell - dimensione dei pori 3 & micro; m | Corning | 3472 | per la misurazione TEER come controllo di qualità prima del saggio di trasmigrazione delle cellule T |
| piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti | Greiner | 650 180 | a fondo piatto; per coltura MBMEC |
| piastra per coltura cellulare a 96 pozzetti | Costar | 3526 | a fondo tondo; per coltura cellulare immunitaria |
| Separatore QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | per l'isolamento di cellule T e cellule B; supporta Colonne MACS LS |
| OctoMACS Separatore | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | per l'isolamento di cellule dendritiche; supporta colonne MACS MS |
| Camera di conteggio Neubauer | Marienfeld | MF-0640010 | per il conteggio delle cellule |
| Filtro cellulare, 70 &; m | Corning | 352350 | per l'isolamento delle cellule immunitarie |
| Filtro cellulare, 40 & micro; m | Corning | 352340 | per l'isolamento delle cellule immunitarie |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | per l'isolamento delle cellule immunitarie |
| Colonne di separazione MACS LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | per l'isolamento delle cellule T e delle cellule B |
| Colonne di separazione MACS MS | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | per l'isolamento delle cellule dendritiche |
| Microsfere CD4 | di topoMiltenyi Biotec | 130-049-201 | per CD4+ Isolamento delle cellule T |
| Topo CD19 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-201 | per l'isolamento delle cellule B |
| Topo CD11c MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | per l'isolamento delle cellule dendritiche |
| Collagene di tipo IV da placenta umana | Sigma | C5533 | per soluzione di rivestimento MBMEC |
| Fibronectina da plasma bovino | Sigma | F1141-5MG | per soluzione di rivestimento MBMEC |
| Collagenasi 2 (CSL2) | Worthington | LS004176 | per isolamento MBMEC |
| Collagenasi/Dispasi (C/D) | Roche | 11097113001 | per isolamento MBMEC |
| DNasi I | Sigma | DN25 | per isolamento MBMEC |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F7524 | per isolamento MBMEC |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Amresco | 0332-100G | per isolamento MBMEC |
| Percoll | Sigma | P1644-1L | per isolamento MBMEC |
| DMEM (+ GlutaMAX) | Gibco | 31966-021 | per isolamento MBMEC e terreno di coltura MBMEC |
| Penicillina/streptomicina | Sigma P4333 | per isolamento MBMEC e terreno di coltura MBMEC | |
| tamponato con fosfato Soluzione salina (PBS) | Sigma | D8537 | per MBMEC e isolamento delle cellule immunitarie |
| Eparina | Sigma | H3393 | per terreno di coltura MBMEC |
| Fattore di crescita dei fibroblasti basici umani (bFGF) | PeproTech | 100-18B | per terreno di coltura MBMEC |
| Puromicina | Sigma | P8833 | per terreno di coltura MBMEC; solo per i primi tre giorni |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | per la raccolta di MBMEC |
| Collagenasi Tipo IA | Sigma | C9891 | per l'isolamento di cellule dendritiche |
| Soluzione di Trypan Blue, 0,4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | per la conta cellulare |
| EDTA | Sigma | E5134 | per l'isolamento di cellule immunitarie |
| IMDM + 1% L-Glutammina | Gibco | 21980-032 | per terreno di coltura di cellule T |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE04-418Q | proteggere dalla luce; per terreno di coltura di cellule B |
| β-mercaptoetanolo | Gibco | 31350-010 | per terreno di coltura di cellule B |
| L-Glutammina (100x Glutamax) | Gibco | 35050-061 | per terreno di coltura di cellule B |
| di topo MOG35— 55 peptide | Biotrend | BP0328 | per l'attivazione di cellule T antigene-specifiche |
| CD3 di topo purificato | BioLegend | 100302 | clone 145-2C11; per l'attivazione di cellule T policlonali, |
| CN/LE purificato anti-topo CD28 Ab | BD Pharmingen | 553294 | clone 37.51; per l'attivazione di cellule T policlonali, |
| IFN murino ricombinante-γ | PeproTech | 315-05 | per saggi di trasmigrazione di cellule T |
| TNF murino ricombinante-&alfa; | PeproTech | 315-01A | per saggi di trasmigrazione di cellule T |
| N/LE anticorpo purificato con IFN-&gamma nel topo | BD Biosciences | 554408 | clone XMG1.2; concentrazione finale consigliata: 20 µ g/ml |
| Granzyme B Inibitore II | Calbiochem | 368055 | concentrazione finale raccomandata: 10 µ |
| M PE anticorpo CD4 anti-topo | Biolegend | 116005 | clone RM4-4; per l'analisi della trasmigrazione delle cellule T |
Riferimenti
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
- Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain ....
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Ristampe e permessi
