I linfociti sono i principali attori nelle risposte immunitarie adattative. Qui, presentiamo un protocollo di purificazione dei linfociti per determinare le funzioni fisiologiche delle molecole desiderate nell'attivazione dei linfociti in vitro e in vivo. Le procedure sperimentali descritte sono adatte per confrontare le capacità funzionali tra linfociti di controllo e linfociti geneticamente modificati.
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Articolo metodologico
L'isolamento e l'attivazione di linfociti murini
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule B e T, con i loro repertori antigene-recettore estremamente diversi, hanno la capacità di montare risposte immunitarie specifiche contro quasi tutti i patogeni invasori1,2. Comprensibilmente, tali intricate capacità sono controllate da un gran numero di molecole coinvolte in vari processi cellulari per garantire risposte immunitarie tempestive e spazialmente regolate3. Qui, descriviamo le procedure sperimentali che consentono l'isolamento rapido di linfociti murini altamente purificati utilizzando la tecnologia di smistamento cellulare magnetico. I linfociti purificati risultanti possono quindi essere sottoposti a vari saggi funzionali in vitro o in vivo, come la determinazione della capacità di segnalazione dei linfociti dopo stimolazione mediante immunoblotting4 e lo studio delle capacità proliferative mediante incorporazione di 3H-timidina o marcatura dell'estere succinimidil (CFSE)5-7 della carbossifluoresceina diacetato (CFSE). Oltre a confrontare le capacità funzionali dei linfociti di controllo e dei linfociti geneticamente modificati, possiamo anche determinare la capacità stimolatoria delle cellule T delle cellule presentanti l'antigene (APC) in vivo, come mostrato nei nostri risultati rappresentativi utilizzando cellule T OT-I marcate con CFSE trapiantate.
Introduzione
I linfociti maturi generalmente esistono nello stato di riposo se non c'è un'infezione o un'infiammazione preesistente nell'individuo. Pertanto, è importante mantenere lo stato naïve dei linfociti durante il processo di isolamento prima di eseguire saggi funzionali in vitro o in vivo. La chiave per garantire risultati coerenti e riproducibili è limitare qualsiasi manipolazione non necessaria delle cellule.
La selezione magnetica delle cellule utilizza anticorpi e microsfere per marcare le cellule in modo da arricchire la popolazione cellulare di interesse. Con questo approccio, ci sono due strategie di purificazione: arri....
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Protocollo
Tutti i topi sono allevati e mantenuti in specifiche condizioni di assenza di patogeni e tutti i protocolli del mouse sono condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e uso istituzionale degli animali.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
- Preparare completa Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium (siero 10% inattivato al calore bovino fetale (FBS), 2 mM L-glutammina, penicillina (100 UI / ml) / streptomicina (100 mcg / ml), 55 mM 2-mercaptoetanolo ).
- Preparare 20x soluzione salina bilanciata (BSS) 1 Stock e della 2, separatamente.
- Preparare 20x BSS magazzino 1 (111 mm destrosio, potassi....
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Risultati
depurazione cellule magnetica dei linfociti consente di purificare una popolazione di cellule bersaglio in un tempo relativamente breve lasso di tempo. Utilizzando il nostro protocollo di esaurimento, siamo stati in grado di aumentare la percentuale di cellule T CD8 (OT-I in ricombinazione attivante del gene-1 (RAG-1) topi -carente) dal 72,8% (prima della depurazione) al 94,2% (dopo la depurazione; Figura 1A) 4,5. Questi linfociti purificati possono poi essere.......
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Discussione
In questo protocollo, dimostriamo una procedura per purificare i linfociti da organi linfoidi. la purificazione delle cellule usando magnetica ordinamento tallone è un metodo semplice e veloce che produce vitali, cellule bersaglio altamente purificate.
I passaggi critici all'interno del protocollo
La vitalità cellulare e la resa delle cellule
Il mantenimento di vitalità delle cellule lignaggio ematopoietiche in .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Lo studio è sostenuto dal Ministero della Pubblica Istruzione, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 e Tier2-MOE2013-T2-2-038). Il manoscritto è stato curato da Amy Sullivan da Obrizus Communications.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali | |||
| RPMI 1640 (senza L-Glutammina) | Gibco | 31870025 | |
| Siero | Inattivato al Calore | ||
| L-glutammina | Gibco | 25030024 | |
| Penicillina/Streptomicina | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoetanolo | Gibco | 21985023 | |
| Microsfere magnetiche anti-CD43 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Mescolare bene prima dell'uso |
| Microsfere di streptavidina | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Mescolare bene prima dell'uso |
| Perle magnetiche anti-annessina V | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Mescolare bene prima dell'uso |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| piastra di coltura sterile con fondo a U a 96 pozzetti | Greiner Bio-one | 650180 | |
| piastra di coltura sterile con fondo F a 96 pozzetti | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ m cell strainer mesh | Per sterilizzare utilizzando la radiazione UV prima dell'uso | ||
| 0,2 μ m unità filtranti sterili monouso | Nalgene | 567-0020 | Può essere sostituito con qualsiasi dispositivo filtrante sterile |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV in breve; alternativa a CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY in breve; alternativa a CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR in breve; alternativa a CFSE |
| Colorante per la proliferazione cellulare eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 in breve; alternativa a CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternativa a CFSE |
| strong>Nome | Azienda | >Numero di catalogo | Comments |
| Chemicals | |||
| Destrosio | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Fenolo Rosso | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Cloruro di calcio diidrato | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Cloruro di potassio | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Cloruro di sodio | Merck Millipore | S7653 | Può utilizzare da altre fonti |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Solfato di magnesio | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Cloruro di ammonio | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimetilsolfossido | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5-(e 6-) carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) | Sonde molecolari | C-1157 | Ricostituire in DMSO |
| Forbolo 12,13-dibutirrato (PBDU, Estere del forbolo) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (Ionoforo di calcio) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Anticorpi e proteina ricombinante | |||
| CD11b biotina (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| CD11c biotina (clone N418) | Biolegend | 117304 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| Biotina Gr-1 (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| Ter119 biotina (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| TCR-γ e delta; biotina (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| CD19 biotina (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| B220 biotina (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| CD49b biotina (clone DX5) | Biolegend | 108904 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| CD4 biotina (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | Cocktail di deplezione delle cellule T |
| CD8 biotina (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | cocktail di deplezione delle cellule T |
| F(ab')2 IgM anti-topo di capra (rivestite in piastra) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µ l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti) |
| Anti-topo CD40 mAb (rivestito su piastra) | Pharmingen | 553722 | 50 µ l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti) |
| IL-4 ProSpec ricombinante | Cyt-282 | ||
| LPS da E. coli Sierotipo 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (rivestito con piastra) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µ l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (rivestito su piastra) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µ l/pozzetto per rivestimento (96 pozzetti) |
| Albumina ricombinante IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| da albume d'uovo di gallina, Ovalbumina | Sigma Aldrich | A7641 |
Riferimenti
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoy....
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Ristampe e permessi
