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Articolo metodologico

Usando elettroforesi capillare per quantificare Acidi organici da tessuti vegetali: un banco di prova d'esame

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DOI:

10.3791/54611

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12 novembre 2016

 ,  , 
1Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, OARDC, 2Department of Plant Pathology, The Ohio State University, OARDC, 3Department of Horticulture and Crop Science, The Ohio State University, OARDC, 4OARDC Metabolite Analysis Cluster, The Ohio State University, OARDC

In questo articolo

Sommario

Questo articolo presenta un metodo per l'individuazione e la quantificazione di acidi organici provenienti da materiale vegetale che utilizzano gratuitamente zonale elettroforesi capillare. Un esempio del potenziale applicazione di questo metodo, determinare gli effetti di una fermentazione secondaria sui livelli di acidi organici in semi di caffè, è fornito.

Abstract

Acidi carbossilici sono acidi organici contenenti uno o più terminale carbossilico (COOH) gruppi funzionali. A catena corta acidi carbossilici (SCCAs; acidi carbossilici contenenti da tre a sei atomi di carbonio), come malato e citrato, sono fondamentali per il corretto funzionamento di molti sistemi biologici, in cui funzionano nella respirazione cellulare e può servire come indicatori di salute delle cellule. Negli alimenti, contenuto in acidi organici può avere un impatto significativo sul gusto, con un aumento dei livelli di SCCA risultante in un gusto "acide" acida o. Per questo motivo, i metodi per l'analisi rapida dei livelli di acidi organici sono di particolare interesse per le industrie alimentari e bevande. Sfortunatamente, tuttavia, la maggior parte dei metodi impiegati per SCCA quantificazione dipendono protocolli in termini di tempo che richiedono la derivatizzazione dei campioni con reagenti pericolosi, una costosa cromatografica e / o analisi di spettrometria di massa. Questo metodo dettagli un metodo alternativo per l'individuazione e la quantificazione dei orgGli acidi Anic da materiale vegetale e campioni di prodotti alimentari che utilizzano gratuitamente elettroforesi capillare zonale (CZE), a volte semplicemente indicato come elettroforesi capillare (CE). CZE fornisce un metodo conveniente per la misurazione SCCAs con un limite inferiore di rilevazione (0,005 mg / ml). Questo articolo descrive l'estrazione e la quantificazione dei SCCAs da campioni vegetali. Mentre il metodo fornito concentra sulla misura della SCCAs da chicchi di caffè, il metodo fornito può essere applicato a diversi materiali alimentari di origine vegetale.

Introduzione

Gli acidi carbossilici sono composti organici contenenti uno o più gruppi funzionali carbossilici terminali, ciascuno attaccato a un gruppo R contenente uno o più atomi di carbonio (R-C[O]OH). Gli acidi carbossilici a catena corta e a basso peso molecolare (acidi carbossilici a catena corta, SCCA) contenenti da uno a sei atomi di carbonio, sono componenti essenziali della respirazione cellulare e funzionano in diverse vie biochimiche necessarie per la crescita e lo sviluppo cellulare. Gli SCCA svolgono un ruolo critico nel metabolismo cellulare1, nella segnalazione cellulare2 e nelle risposte dell'organismo all'ambiente (come l'antibiosi3). Per questo motivo, gli SCCA possono fungere da utili indicatori delle interruzioni del metabolismo cellulare, delle risposte allo stress delle piante4,5 e della qualità dei frutti6,7. Ad oggi, gli SCCA sono stati quantificati principalmente attraverso tecniche cromatografiche come la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) o la gascromatografia-spettroscopia di massa (GC-MS). Sebbene questi metodi siano in grado di raggiungere limiti di rilevamento molto bassi, possono essere costosi, richiedere la derivatizzazione di SCCA target utilizzando reagenti caustici e/o tossici e includere lunghi cicli di separazione su GC o HPLC. Per questo motivo, l'interesse per l'uso dell'elettroforesi capillare zonale libera (CZE), che non richiede la derivatizzazione del campione, per quantificare gli acidi organici è aumentato costantemente8.

L'elettroforesi capillare zonale libera (CZE) è una metodologia di separazione cromatografica che, grazie all'elevato numero di piastre teoriche, alla velocità e alla relativa facilità d'uso, sta sostituendo sempre più sia la GC-MS che la cromatografia liquida ad alta pressione come metodo analitico per la quantificazione (in particolare per scopi di controllo qualità) di anioni, cationi, amminoacidi, carboidrati e acidi carbossilici a catena corta (SCCA)8,9,10. La separazione basata su CZE di piccole molecole, compresi gli SCCA, si basa su due principi primari: il movimento elettroforetico di ioni carichi in un campo elettrico stabilito attraverso il tampone che riempie il capillare; e il movimento elettro-osmotico dell'intero sistema tampone da un'estremità all'altra del capillare, generalmente verso l'elettrodo negativo. In questo sistema, piccole molecole si muovono verso l'elettrodo negativo a velocità variabili, con la velocità di ciascuna molecola determinata dal rapporto tra la carica netta della molecola e la massa molecolare. Poiché il movimento di ogni singola molecola in questo sistema dipende dallo stato di carica della molecola e dalla velocità complessiva del flusso elettro-osmotico (che a sua volta si basa sul contenuto di ioni del tampone utilizzato per riempire il capillare), il pH del tampone e la composizione ionica influiscono pesantemente sul grado in cui le molecole possono essere separate in modo efficiente utilizzando CZE. Per questo motivo, gli SCCA, con i loro rapporti carica/massa relativamente elevati, sono bersagli ideali per la separazione basata su CZE. I metaboliti separati utilizzando CZE possono essere rilevati utilizzando una varietà di metodi, tra cui l'assorbanza UV, l'assorbanza spettrale (che viene generalmente eseguita utilizzando un array di fotodiodi [PDA]) e/o la spettroscopia di massa (CE-MS o CE-MS/MS)8. La diversità dei metodi di separazione e rilevamento forniti da CZE la rende una tecnica estremamente flessibile e adattabile. Per questo motivo, la CZE è stata sempre più applicata come metodo standard di analisi nei settori della sicurezza e della qualità alimentare11,12, della ricerca farmaceutica13 e del monitoraggio ambientale13,14.

L'elettroforesi capillare è stata utilizzata per rilevare e quantificare gli acidi carbossilici a catena corta per quasi due decenni13. Il potere risolutivo (in particolare per piccole molecole cariche), il breve tempo di esecuzione e il basso costo per campione delle analisi CZE rendono CZE una tecnica ideale per la separazione e la quantificazione degli SCCA13. Questo metodo presenta un protocollo per utilizzare CZE per misurare la concentrazione di acidi organici dai tessuti vegetali. I dati di esempio sono stati generati attraverso l'implementazione di successo di questo protocollo per misurare la variazione dei livelli di acido organico nei semi di caffè a seguito di un trattamento di fermentazione secondaria. Il protocollo descrive in dettaglio i passaggi critici e gli errori comuni della separazione degli SCCA basata su CZE e discute i mezzi con cui questo protocollo può essere applicato con successo per quantificare gli SCCA in ulteriori tessuti vegetali.

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Protocollo

Preparazione 1. Esempio

  1. Montare campioni per acido carbossilico (SCCA) di estrazione a catena corta. Preparare 1,0 g di semi di caffè alla volta per assicurare che sufficiente campione rimarrà dopo l'elaborazione.
    1. Se i campioni sono stati congelati prima del processo di rettifica, mantenere il tessuto congelato durante la lavorazione per impedire il congelamento / disgelo danni e l'ossidazione del campione. Rimuovere il campione dal congelatore o sotto zero di stoccaggio solo se necessario per la macinazione.
    2. Flash congelare i campioni freschi in azoto liquido immediatamente prima di assaggiare la macinazione. Per ridurre al minimo la manipolazione del campione, congelare i campioni istantanei mettendoli in un mortaio pre-riempite con azoto liquido.
    3. Analizzare i campioni liquidi immediatamente dopo generazione, o congelare il flash in azoto liquido e conservare a -20 ° C o -80 ° C fino al momento dell'analisi. Prima di analisi, rimuovere i campioni congelati dallo stoccaggio e lasciar scongelare. Per i campioni di liquido procedere al punto (3,5) per l'elaborazione.
  2. indossare approdispositivi di protezione individuale oppor- (inclusi occhiali di protezione, guanti e camice da laboratorio) prima di intervenire con l'azoto liquido.
  3. Campioni di tessuto Triple-macinare una uniforme polvere fine (cioè, di uniformità delle particelle) in azoto liquido utilizzando una ceramica mortaio e pestello.
    NOTA: Il raggiungimento di una granulometria uniforme, è essenziale per massimizzare l'efficienza di estrazione SCCA.
    1. Pre-raffreddare la mortaio e pestello con azoto liquido prima dell'aggiunta del campione. Mantenere il mortaio riempito con un piccolo volume di azoto liquido viene aggiunto il campione.
    2. Utilizzando un mestolo, aggiungere abbastanza azoto liquido per la malta per sommergere completamente il campione.
    3. Aggiungere esempi facilmente terra, come foglie o caffè tostato, per l'azoto liquido e schiacciare con un movimento circolare di rettifica. Inizia a macinare campioni quando il livello di azoto liquido è diminuita al punto in cui esso copre appena i campioni.
    4. Aggiungere difficile da macinare campioni, come ad esempio uns semi del caffè crudo, per azoto liquido e consentire loro di congelare per 10-30 secondi (o fino a quando il azoto liquido smette vigorosamente bollente) prima della macinazione. Rompere il tessuto in frammenti più piccoli con un movimento di frantumazione in verticale, e il tessuto quindi completo di macinazione con un movimento circolare di rettifica.
    5. Ripetere passaggi 1.3.2-1.3.4 altre due volte, in modo che i campioni vengono macinati un totale di tre volte. Tipicamente, tre turni successivi di rettifica ridurranno campioni in polvere con una consistenza di farina simile.
    6. Se una consistenza farinosa non viene raggiunta, ripetere i punti 1.3.2-1.3.4 fino campioni vengono ridotti ad una polvere di dimensioni uniformemente piccole particelle (efficienza di estrazione è inversamente proporzionale alla dimensione delle particelle).
  4. Trasferimento in polvere a fiale di vetro o provette da 1,5 ml microcentrifuga. Iniziato il trattamento a valle subito dopo la macinazione (consigliato), o conservare i campioni a -80 ° C, finché i campioni sono pronti per l'estrazione.
    1. Se i campioni devono essere conservati primaanalisi, dividere il campione in 500 aliquote mg (o 500 aliquote microlitri per campioni liquidi) e dividere tra più tubi per lo stoccaggio. Evitare di sottoporre i campioni a cicli di gelo / disgelo ripetuti, in quanto questi possono alterare la composizione del campione e avere un impatto negativo misure dei campioni future.

2. Acido Organic Preparazione standard

  1. Montare gli standard autentici per i SCCAs di interesse. Questi saranno utilizzati per creare soluzioni standard interni ed esterni per l'uso per determinare le concentrazioni SCCA. Per i campioni di caffè includono citrico, malico, acetico e acido lattico come acidi di interesse e acido adipico come standard interno.
    1. Assicurarsi assicurarsi che lo standard interno selezionato non si trova naturalmente nel campione, e che la norma non co-eluire con altri picchi nel profilo campione.
    2. Eseguire le curve standard per ogni SCCA di interesse, e di determinare la gamma di risposta lineare per ogni SCCA (vedere la sezione 4 per l'esecuzione di istructions). Assicurarsi di eseguire curve standard per ogni SCCA da misurare nel campione.
      NOTA: Le curve standard possono essere eseguiti sia in tampone o lo sfondo del campione da dosare. Nel secondo caso ( "aggiunta standard"), i valori per l'area del picco di ciascun punto curva standard sarà determinato sottraendo via lo sfondo del campione.
    3. Pre-label tutti i tubi e vetreria necessari con il nome SCCA acido, la concentrazione e la data del test.
  2. Preparare soluzioni per ogni standard a concentrazione nota (10 mg / ml) utilizzando un pallone tarato per assicurare la precisione durante la preparazione standard.
    1. Sciogliere standard solidi SCCA (acido citrico e acido malico) in acqua ultrapura (18,2 MW) per raggiungere la concentrazione desiderata per la soluzione di riserva.
      1. Creare un 10 mg / ml soluzione madre con l'aggiunta di 100 mg di standard per un pallone tarato da 10 ml. Riempire il pallone tarato alla linea 10 ml di acqua ultrapura per dissolve l'acido.
      2. Creare una minore concentrazione di standard di acido o leggermente riscaldare i flaconi di guidare difficili da sciogliere standard SCCA, come l'acido adipico, in soluzione.
    2. Diluire standard acidi in fase liquida (acido acetico e acido lattico) in acqua ultrapura per ottenere la concentrazione desiderata.
      1. Pre-riempire un pallone tarato con 5 ml di acqua ultrapura. Aggiungere abbastanza acido per preparare una soluzione di 10 mg / ml (calcolata utilizzando la densità dell'acido fornito dal fornitore) al pallone e quindi aggiungere acqua sufficiente per portare il volume finale della soluzione a 10 ml.
  3. Trasferire ogni soluzione madre in una provetta pulita di vetro da 15 ml, con un politetrafluoroetilene (PTFE) rivestito tappo, e sigillare con la pellicola di paraffina plastica. Le soluzioni madre possono essere memorizzati in tubi sigillati a 4 ° C per 1 settimana.
    1. Garantire che le norme SCCA non hanno precipitato dalla soluzione prima dell'uso se soluzioni madre sono state in frigorifero dopo preparzione. Unità precipita di nuovo in soluzione attraverso il riscaldamento delicato.
  4. Preparare la soluzione di estrazione SCCA. Include standard interno ad una concentrazione sufficiente per la rilevazione nei campioni (0,05 mg / ml). Preparare abbastanza soluzione per estrarre tutti i campioni.
    1. Preparare 50 ml di soluzione di estrazione SCCA diluendo la soluzione madre standard interno a 0,05 mg / ml in acqua ultrapura. Aggiungere 250 ml di soluzione madre standard interno (10 mg / ml) a 49,75 ml di acqua.
    2. Se l'estratto deve essere diluito, regolare la concentrazione standard interno nella soluzione di estrazione in modo che la concentrazione finale rientrare nei limiti di quantificazione (dando un rilevabile, ma non troppo saturi, picco, vedi 5.2.2) del sistema CE dopo diluizione (0,05 mg / ml).
    3. Preparare la soluzione di estrazione fresca per ogni serie di estrazioni (cioè, per ogni serie sperimentale).
  5. Preparare i campioni della curva standard(Una serie di diluizioni appropriate) per SCCAs di interesse, utilizzando un minimo di almeno 5 punti. Le concentrazioni curva standard impiegate dovranno essere nell'intervallo risposta lineare per un dato SCCA, e misurano le concentrazioni SCCA attese nei campioni.
    1. Include standard interno selezionato nelle soluzioni curva standard per consentire la quantificazione dello standard interno in campioni. Lo standard interno sarà utilizzato per aiutare nella identificazione dei picchi e calcolando l'efficienza di estrazione (sezione 6).
    2. Diluire ciascun SCCA alle concentrazioni sopra determinato (0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08 mg / ml, vedi sopra, 2.4.2) in nuove provette da microcentrifuga (una per ciascuna concentrazione / punto curva standard) con acqua ultrapura. Preparare 1 ml di soluzione per ogni punto di concentrazione curva standard. Assicurarsi che ogni punto di concentrazione contiene tutti e quattro gli standard di acido e lo standard interno alla concentrazione corretta.
    3. Preparare nuovi punti curva standard per ogni setdi campioni da eseguire sul sistema elettroforesi capillare. Tenere i campioni standard curva SCCA a 4 ° C fino al momento dell'analisi, che avverrà dopo l'estrazione di SCCAs da tessuti bersaglio (sezione 3).

3. Organic Acid Extraction

  1. provette dei campioni pre-etichetta, la preparazione almeno un tubo per ogni campione da estrarre.
  2. Rimuovere i campioni da estrarre dal magazzino e disporli sul ghiaccio durante la pesatura fuori materiale per l'estrazione.
  3. Pesare 100 mg di campione per l'estrazione SCCA.
    1. Dopo la pesatura ogni campione, il trasferimento di tessuto ad un 1,5 ml provetta pulita. Misurare una quantità di campione più vicino alla massa bersaglio possibile per ridurre la variabilità.
    2. Tenere traccia della massa di ciascun campione misurato, come la quantità di SCCAs rilevati verranno normalizzati utilizzando la massa del campione (vedi 6.5.2, di seguito).
  4. Dopo aver soppesato tutti i campioni, aggiungere 1 ml di soluzione di estrazione (il water + miscela standard interno dal punto 2.4) a ciascuno dei tubi di campione. Mantenere il rapporto di soluzione di estrazione di massa del tessuto stesso in tutte le estrazioni (in questo caso 1 ml per 100 ± 5 mg di tessuto). Mescolare bene vortex per 10 secondi.
  5. Lasciare che i campioni di sedersi a temperatura ambiente per 1 ora. Durante questa ora, mescolare ogni tubo ogni 15 minuti come al punto 3.4.
  6. Dopo 1 ora di estrazione, mescolare i campioni un'ultima volta e trasferire le provette dei campioni a una microcentrifuga. Centrifugare i campioni a 4 ° C, 10.000 xg per 10 minuti per precipitare materiale solido (pareti cellulari, particelle, ecc).
    1. Durante l'elaborazione di campioni liquidi, aggiungere la giusta concentrazione dello standard interno, mescolare brevemente e centrifugare. Dopo centrifugazione, il trattamento di campioni liquidi identico al estratto da campioni solidi.
    2. Controllare il pH dei campioni per confermare che siano compatibili con l'intervallo di pH del tampone di corsa nel kit di rilevamento (passo 4.6) o un sistema tampone essendo employed. Poiché i volumi di campione sono di solito piuttosto piccola, pH può essere monitorato utilizzando carta pH.
  7. Preparatevi a filtrare i campioni utilizzando filtri a disco siringa montati (3.8).
    NOTA: Prevenire la perdita del campione, assicurando che ogni filtro sia correttamente collegato a una siringa prima di trasferire il surnatante. Preparare una siringa dotata di un filtro disco per ogni campione da analizzare (compresi i campioni curva standard).
  8. Dopo centrifugazione dei campioni e preparazione dei filtri per siringa, trasferire il supernatante da ogni campione a una siringa da 3 ml dotata di un filtro a siringa da 0,2 micron. Utilizzare un nuovo filtro e la siringa per ogni campione. Filtrare tutti i campioni, compresi i campioni curva standard e controlli tampone, prima esecuzione sul sistema CE.
  9. Filtrare il campione direttamente in una provetta pulita. Dopo il filtraggio, chiudere il tubo contenente filtrato e scartare l'apparato della siringa / filtro.
  10. Porre immediatamente campioni filtratinel sistema CE per il rilevamento SCCA; o campioni Conservare a 4 ° C durante la notte. Se i campioni devono essere conservati durante la notte, sigillare i tubi con la pellicola di paraffina plastica per evitare lo scambio di gas e l'evaporazione del campione.
    1. Se i campioni devono essere conservati più di un giorno dopo la filtrazione, estratti Flash congelare in azoto liquido o il congelamento a -20 ° C. Dopo lo scongelamento, tuttavia, garantire che ogni campione viene esaminato per la formazione precipitato e il filtro, se necessario (come nel passaggio 3.6).

4. Configurazione della SCCA Detection Run

  1. Consultare il manuale utente del CE per i dettagli specifici del software programming- e controllo.
  2. Preparare capillari vial elettroforesi (CE) per il rilevamento SCCA. Assicurarsi che le fiale siano adeguatamente etichettati, pulito e privo di difetti.
  3. Lavare e asciugare i tappi dei flaconi CE prima dell'uso.
    1. Lavare le protezioni da loro immergendo in acqua ultrapura e consentendo loro di ammollo durante la notte. Dopo l'immersione i tappi, scartare il immergereing soluzione e sciacquare i tappi per altre due volte con acqua ultrapura.
    2. Trasferimento risciacquato tappi per una superficie di essiccazione pulita foderato con tessuto privo di lanugine e lasciare asciugare all'aria. Assicurarsi che le protezioni sono completamente asciutti prima dell'uso, per evitare errori di pressione.
  4. Trasferire 1 ml di campione per ogni fiala CE, facendo attenzione ad evitare accidentalmente spruzzi il campione nel collo del flacone. Dopo il trasferimento, mettere un tappo CE su ogni fiala.
    1. Se è necessaria una diluizione, diluire i campioni di semi di caffè 1:10 o 1: 100 direttamente nella fiala CE con acqua ultrapura. Per diluizioni maggiori di 1: 100, creare un diluizione intermedia per evitare errori di pipettamento.
  5. Preparare un flacone per ogni punto curva standard con il trasferimento di soluzioni curva standard (1,0 ml) dal punto 2.5 a fiale CE. Cap ciascun tubo dopo il trasferimento.
  6. Preparare una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) 0,1 M aggiungendo 0,04 g di NaOH in un becher contenente 90 ml di acqua ultrapura e permettendo ai pellets to sciogliere. Trasferire la soluzione 0,1 M di NaOH in un pallone tarato ml 100 e portare il volume totale di 100 ml.
  7. Aggiungere 1 ml di soluzione 0,1 M di NaOH ad una fiala pulita e CE cap.
  8. Preparare fiale tampone CE per ogni lotto di campioni da eseguire sul sistema CE. Kit di separazione sono disponibili o tamponi personalizzati possono essere utilizzati 13.
    1. Preparare 1 flacone con 1 ml di soluzione tampone di partenza e cappuccio.
    2. Preparare tre fiale con 1 ml ciascuno di correre soluzione tampone e cappuccio. Sostituire il tampone di corsa prima di ogni lotto di campioni e dei punti della curva standard, o dopo 35 campioni, a seconda di quale si verifica prima.
    3. Riempire tre fiale supplementari con 1 ml di acqua ultrapura e tappare ogni fiala.
    4. Preparare 1 vuoto fiala di "rifiuto" con tappo.
  9. Dopo aver preparato le fiale descritti al punto 4.8, caricare le fiale contenenti i buffer e acqua, nonché le fiale rifiuti (da gradini 4.8.2-5) nella vasca del buffer dei SYS elettroforesi capillareTEM, come da istruzioni del produttore 15. nota con attenzione la posizione di ogni fiala per la programmazione automatica-campionatore.
  10. Caricare le fiale contenenti i punti della curva standard e le fiale contenenti i campioni da dosare nel vassoio campioni di ingresso, come descritto nelle istruzioni del produttore. Nota la posizione di ogni fiala per la programmazione automatica-campionatore (vedere i passaggi 4.11.1 sotto).
  11. Preparare condizionata e metodi di separazione del campione (programmi per questi sono forniti nelle tabelle, rispettivamente, 1 e 2,), e scrivere un file di sequenza di esempio come da istruzioni per l'uso dello strumento. Utilizzare il metodo di separazione descritto in Tabella 2: lavare la colonna con iniziatore (20 psi) per 0,2 min; lavare con acceleratore (20 psi) per 0,5 min, l'iniezione di campioni (0,5 psi) sulla colonna per 0,09 min, campioni separati a 20 kV per 12 min, lavare con NaOH (20 psi) per 0,5 min, ed infine risciacquare con acqua ( 20 psi) per 0,5 min.
    1. Using il software di controllo CE, prego scrivere la sequenza-campione esecuzione (cioè, l'elenco di lavoro; un file elenco dettagliato l'ordine in cui saranno analizzati i campioni, e il metodo da utilizzare per separare ogni campione) utilizzando l'interfaccia foglio "sequenza". Ogni riga sul foglio elettronico sarà conforme a una corsa del campione e produrre un singolo file di dati.
      1. Assicurarsi che durante la scrittura del file di sequenza, i campioni vengono identificati utilizzando la corretta posizione nel vassoio di campionamento. Assicurarsi che ogni file di dati ha un nome univoco per evitare che il software di sovrascrivere i file precedenti. capillare condizionamento programma viene eseguito CE come una sequenza separata prima della corsa sequenza contenente il metodo di separazione del campione.
    2. Iniziare la sequenza di campionamento eseguito con le soluzioni della curva standard, seguito da campioni SCCA, e terminare con una seconda serie di soluzioni curva standard. Ciò consentirà un calcolo del grado di perdita di segnale che si verifica durante analisi dei campioni.

    figure-protocol-1
    Tabella 1: Condizionata programma di metodo utilizzato per preparare il capillare per filiera corta separazione acido carbossilico tramite elettroforesi capillare a.

    figure-protocol-2
    Tabella 2: programma di metodo di separazione utilizzato per le analisi a catena corta acidi carbossilici tramite elettroforesi capillare a.

    5. SCCA Detection Run esecuzione e raccolta dati

    1. Avviare percorsi di condizionamento capillari. Aspettatevi di condizionare il capillare due o tre volte prima che la colonna è pronta per la separazione del campione. Colonna condizionamento deve essere eseguita come descritto in Tabella 1. Brevemente, risciacquare colonna con 0,1 M di NaOH (20 psi) per 1 min, lavare con acqua (20 psi) per1 min, risciacquare con iniziatore (20 psi) per 0,5 min, sciacquati con acceleratore (20 psi) per 0,5 min, acceleratore separato 30 kV per 10 minuti, risciacquare colonna con 0,1 M di NaOH (20 psi) per 0,5 min, ed infine lavare la colonna con acqua (20 psi) per 0,5 min.
      1. Condizionare la capillare prima di ogni esecuzione sequenza di campioni. Raggiungere condizionamento adeguato, mantenendo la tensione di separazione è costante per tutta la corsa e osservando una linea di base piatta sulla traccia fotodiodi.
    2. Dopo il condizionamento, avviare la separazione del campione aprendo il menu "controllo" del software e selezionare (ad esempio, cliccando su) "sequenza di esecuzione." Monitorare la traccia fotodiodi (PDA) per garantire la separazione corretta.
      1. Osservare la prima traccia e far sì che esso ha una linea di base piatta e pulita risolto (risoluzione di base), singoli picchi di acido. Over-caricati i campioni mostreranno coda lunga di picco, o di picco tailing, e dovranno essere diluito (figura 1).

    figure-protocol-3
    Figura 1:. Un confronto tra PDA tracce evidenziando un campione di sovraccarico Con l'aumento della concentrazione di analiti, la geometria picco individuo può cominciare a diventare asimmetrica. A (a) 0,05 mg / ml, acido acetico presenta un ben definito, picco simmetria bilaterale. Come aumenta la concentrazione di acido acetico (b) 0,07 mg / ml e (c) 0,10 mg / ml, si forma un picco di coda (frecce). Questo tailing picco è una buona indicazione che il campione è in sovraccarico. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    1. Al termine della corsa di sequenza, aprire i file di dati uno alla volta nel software di analisi CE e integrare i picchi.
      1. Integrare i picchi del campione.
        1. Aprire il primo filee impostare la procedura di integrazione automatici per escludere la prima 3 min della corsa (in cui la tensione, e quindi la direzione di flusso della colonna, viene invertito come descritto nella Tabella 1). Nello stesso menu, impostare i criteri di selezione di punta per una larghezza di picco minimo di 50 unità e l'area di picco di 100 unità (o le impostazioni di default del produttore) per fornire un moderatamente elevato livello di selettività, che separa i picchi di acido dal rumore di fondo nella traccia.
      2. Verificare manualmente i confini di punta e linee di base per ogni traccia PDA per garantire una corretta integrazione di picco. Picchi non correttamente integrati (per esempio, un picco SSCA leggermente asimmetrica che è stato integrato da due picchi separati da parte del software automatizzato) dovranno essere nuovamente integrati manualmente.
    2. Dopo l'integrazione, visualizzare il report zona per cento, quindi evidenziare e copiare il rapporto zona per cento e incollarlo in un foglio di calcolo separato. Ripetere l'operazione per ogni campione per costruire il picco RELAZIONE piena corsat con ogni riga rappresenta un singolo picco (es., ogni picco dovrebbe contenere un singolo composto se la separazione funziona bene).

    Analisi 6. Dati

    1. Preparare i dati per l'analisi utilizzando il foglio di calcolo costruito in (5.4). Iniziare analisi etichettando norme acido per ciascuno dei punti della curva standard, compreso lo standard interno.
    2. Calcolare un indice di conservazione per ogni picco dividendo il tempo di ritenzione per ogni picco del campione per il tempo di ritenzione dello standard interno in quel campione. Ordinare i set di dati per l'indice di ritenzione risultante per identificare i picchi di interesse in ogni campione.
    3. Dopo aver identificato il picco per ogni acido di interesse, costruire le curve standard per ogni acido utilizzando i punti della curva standard esterno.
      1. Generare una curva standard (concentrazione) per ciascuno standard SCCA determinando l'area di picco per ciascuna concentrazione degli standard SCCA, e riportando concentrazione sul xaxis vs area del picco sulla y. Tracciare la regressione lineare per ogni curva standard SCCA e definire l'equazione pendenza (y = mx + b).
      2. Assicurarsi che R 2 valori delle regressioni lineari sono 0,90 o superiore, come quantificazioni sono più accuratamente eseguite nella gamma lineare della curva standard.
    4. Calcolare la concentrazione di acido per un dato SCCA in un campione mediante l'area di picco e l'equazione pendenza della retta di regressione lineare della curva standard (calcolati in 6.3.2 sopra). Brevemente, dividere l'area del picco osservata per un dato acido dalla pendenza della linea di regressione per la curva standard di acido.
      1. Correggere i valori di concentrazione grezzi calcolati al punto 6.4 per la perdita di campione durante la lavorazione utilizzando lo standard interno (punto 6.5).
    5. Calcolare il fattore di correzione per ogni campione mediante standard interno.
      1. Dividere la concentrazione effettiva dello standard interno (cioè, il knoquantità wn aggiunto all'inizio dell'esperimento) dal valore osservato dello standard interno nel campione (cioè la quantità calcolata utilizzando l'equazione pendenza della curva standard per lo standard interno). Moltiplicare i valori di concentrazione prime di ciascun SCCA nel campione per questo fattore di correzione.
      2. Dividere la standard interno concentrazione corretta SCCA dalla massa del campione utilizzato per l'estrazione per correggere eventuali variazioni in massa del campione. Questo calcolo produce quantità di analita per massa del campione (mg per mg SCCA caffè macinato in questo esempio), che possono poi essere convertito nelle unità appropriate per il dato studio (mg / mg, mg / g, g / g, etc. ).
    6. Dopo aver calcolato concentrazioni SCCA (normalizzata a uno massa [per campioni solidi o liquidi] o volume [per campioni liquidi]), utilizzare questi valori per l'analisi statistica secondo le esigenze del disegno sperimentale e domande di interesse.

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Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato con successo per misurare gli effetti dei trattamenti di semi al contenuto SCCA di semi di caffè verde. In questo esperimento, i sei trattamenti erano: una sospensione microbica satura di Leuconostoc pseudomesenteroides ceppo GCP674 nel suo mezzo di coltura (1), una sospensione acquosa di GCP674 microbi in acqua (2), una soluzione acquosa di acido acetico e acido lattico (0,15 e 0,4 mg / ml) (3), un trascorso M1 trattamento terreno di crescit...

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Discussione

Come con qualsiasi tecnica analitica, ci sono diversi fattori critici che possono influenzare significativamente la qualità e l'affidabilità dei dati generati. In primo luogo, è importante trattare i campioni in modo efficiente, con un minimo di cicli di congelamento / scongelamento. Ripetuti di congelamento e scongelamento possono compromettere la composizione chimica del campione prima della trasformazione o analisi. In secondo luogo, è fondamentale applicare i passi di questo protocollo per tutti i campioni in mo...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano riconoscere il sostegno finanziario di questo progetto da parte della società J.M. Smucker.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Moarter e pestello in ceramicaCoorstek60310
Beckman Coulter P/ACE MDQ CE systemBeckman CoulterVarie
fiale per campioni in vetroFisher Inc.033917D
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml Fisher Inc.02-681-5
Acqua di grado LC/MSFisher Inc.W6-1Milli-Q acqua (18,2  MΩ · cm) è accettabile anche
tubo di vetro da 15 ml/ tappo foderato in teflon Fisher Inc.14-93331A
Parafilm MFisher Inc.13-374-12
Kit di rilevamento CElixirOA pH 5,4 Siringhe MicroSolv06100-5.4
BD Safety-LokFisher Inc.14-829-32
Filtro per siringa target da 17 mm, PTFEFisher Inc.
32 carati, V. 8.0 softwaredi controllo Beckman Coulter285512
fiale per campioni di elettroforesi capillare (CE) Beckman Coulter144980
tappi per fiale CE Beckman Coulter144648
Azoto liquidoN/AN/AL'azoto liquido è disponibile presso la maggior parte dei servizi delle strutture
3377154

Riferimenti

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