Articolo metodologico

Studio in vivo di Human Interaction endoteliale-pericyte Utilizzando la matrice di gel Plug Assay nel topo

DOI:

10.3791/54617

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19 dicembre 2016

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1Division of Pulmonary and Critical Care Medicine, School of Medicine, Stanford University, 2Stanford Cardiovascular Institute, School of Medicine, Stanford University, 3VA Palo Alto Health Care System, Department of Cardiothoracic Surgery, School of Medicine, Stanford University

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo un protocollo per studiare le interazioni umane endoteliali-periciti in mouse utilizzando una variazione del saggio spina angiogenesi gel matrice.

Abstract

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L'angiogenesi è il processo attraverso il quale si formano nuovi vasi sanguigni da vasi esistenti. La crescita di nuovi vasi richiede la proliferazione, la migrazione e l'allineamento coordinati delle cellule endoteliali per formare strutture tubulari, seguite dal reclutamento di periciti per fornire supporto murale e facilitare la maturazione dei vasi. Gli attuali approcci di coltura cellulare in vitro non sono in grado di riprodurre completamente il complesso ambiente biologico in cui le cellule endoteliali e i periciti interagiscono per produrre vasi funzionali. Presentiamo una nuova applicazione del test in vivo su gel plug per matrice per studiare le interazioni endoteliale-pericitario e la formazione di vasi sanguigni funzionali utilizzando topi con grave mutazione combinata da immunodeficienza (SCID). In breve, il gel della matrice viene miscelato con una soluzione contenente cellule endoteliali con o senza periciti, seguito da un'iniezione nella parte posteriore di topi SCID anestetizzati. Dopo 14 giorni, i tappi in gel della matrice vengono rimossi, fissati e sezionati per l'analisi istologica. La lunghezza, il numero, le dimensioni e l'estensione della copertura pericitaria dei vasi maturi (definita dalla presenza di globuli rossi nel lume) possono essere quantificati e confrontati tra i gruppi sperimentali utilizzando piattaforme statistiche commerciali. Oltre al suo utilizzo come test di angiogenesi, questo test di tappo in gel per matrici può essere utilizzato per condurre studi genetici e come piattaforma per la scoperta di farmaci. In conclusione, questo protocollo consentirà ai ricercatori di integrare i saggi in vitro disponibili per lo studio delle interazioni endoteliale-pericitario e della loro rilevanza per l'angiogenesi sistemica o polmonare.

Introduzione

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L'angiogenesi è il processo attraverso il quale nuovi vasi sanguigni si formano da una rete vascolare preesistente 1 ed è il centro di ricerca in corso in molti settori che vanno dallo sviluppo normale alla malattia. Questo processo dinamico coinvolge la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali (EC) e reclutamento di periciti per costruire un tubo vascolare rivolta verso il sito che ha bisogno di ossigeno e nutrienti consegna 2. Per studiare questo processo richiede un saggio altrettanto dinamico, soprattutto uno che può riassumere la natura tridimensionale di formazione del tubo. In vitro matrice 3D sono state svilu....

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Protocollo

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Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Stanford University School of Medicine.

NOTA: Gli animali sono sotto anestesia con il 3% isoflurano vaporizzatore e fornitura 3% di O 2 gas. L'uso del veterinario pomata sugli occhi può aiutare a prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.

1. Preparazione delle cellule

  1. Crescere endoteliali e cellule pericyte culture umane in piastre da 100 mm con 10 ml di supporto appropriato. Sostituire 10 ml di mezzo fresco ogni 2 - 3 giorni fino cellule raggiungono l'80% di confluen....

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Risultati

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Rappresentante H & E e immunofluorescenza colorazione di sezioni spina gel matrice sono mostrati in Figura 2. Sezioni dalla CE solo spine mostrano alcune navi che non sono per lo più perfusi con il sangue (figura 2 in alto a sinistra, frecce nere), mentre le spine contenenti sia EC e periciti visualizzare diverse perfuso navi con diametri maggiori e copertura pericyte completo, come dimostra positivo SMA colorazione immediatamente adiacente alla EC C.......

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Discussione

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Il saggio spina gel matrice ha dimostrato di essere un metodo comodo e potente per valutare regolazione genica nell'angiogenesi, composti angiogenici e antiangiogenici in vivo, e per integrare test in vitro. Qui, descriviamo in dettaglio un romanzo spina saggio gel matrice dell'angiogenesi umana che indaga l'interazione tra cellule endoteliali e periciti durante la formazione dei vasi.

Ci sono alcuni punti nuovi e critici in questo protocollo. Le cellule in bass.......

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Dichiarazioni

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Non sono inclusi interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Il Dr. K. Yuan è stato supportato da un American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) e dal Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Il Dr. V. de Jesus Perez è stato supportato da un premio per lo sviluppo della carriera dalla Robert Wood Johnson Foundation, un premio NIH K08 HL105884-01, un premio dell'Associazione per l'ipertensione polmonare, un premio per la ricerca biomedica dall'American Lung Association e un premio per la ricerca traslazionale e la medicina applicata premio dell'Università di Stanford.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)Corning21-031-CV
0,25% tripsina/0,53 mM EDTACorning25-053-CI
Kit di terreni cellulari endoteliali (ECM)Sciencell1001include terreni, supplemento per la crescita EC e penicillina/streptomicina, ciascuno fornito al volume appropriato per una facile miscelazione
Kit di terreni pericitici (PM)Sciencell1201include terreni, integratore per la crescita dei periciti e penicillina/streptomicina, ciascuno fornito al volume appropriato per una facile miscelazione
cellule endoteliali microvascolari polmonari umane primariel'ipertensione polmonare Questotipo di cellula è disponibile anche in commercio. Cellule utilizzate al passaggio 1-4
periciti polmonari umani primarisvolta per l'ipertensione polmonareQuesto tipo di cellula non è disponibile in commercio, ma i pariciti cerebrali lo sono. Cellule utilizzate al passaggio 1-4
bFGF (fattore di crescita basico dei fibroblasti)Peprotech100-18Bla soluzione madre è 50 μ g/ml in 0,1% BSA in PBS, aliquote a 50 μ l e conservato a -20 gradi
Matrigel Basement Membrane MatrixBD356237
28 G 1 cc Insluin SiringaBD329410
SCID (Grave Combined Immune Deficiency) topiThe Jackson Laboratory5557NOD. Il ceppo SCID IL2R gamma knockout è il ceppo migliore; 4-6 settimane di età
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml, steriliThermo Fisher Scientific05-408-129
Provette con tappo a vite da 15 ml, steriliBD Biosciences352096
PAP penLife Technologies8899
emocitometroThermoFisher Scientific02-671-6
Crema depilatoria NairWalmart
anticorpo primario CD31 umanoLifeSpan BiosciencesLS-B4737la soluzione di lavoro è l'anticorpo fluorescente primario 1:50
anti-muscolo liscio umano actina CY3SigmaC6198anti-coniglio di capra 1:300
; 488/verdeThermoFisher ScientificA-11008è 1:250
Prolong Gold DAPIsolution Cell Segnalazione8961S
VWR48300-047
n. 1,5 vetrini coprioggettiThermo Fisher Scientific12-544-D
tampone citrato 10xMillipore21545
forbici chirurgiche extra finiFine Science Tools14084-08
Formalina (paraformaldeide)Thermo Fisher Scientific245-685
Cassette di tessutoSimportM492-12
siero di capraDakoX0907
delle Iniziativa rivoluzionaria per Iniziativa di La soluzione di lavoro è un anticorpo secondario La soluzione di lavoro Vetrini per microscopio

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
  2. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
  3. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E.

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Angiogenesi in vivocellule endoteliali umanecoltura cellulare di parassitimodello di topi SCIDanalisi istologicacopertura dei pericitimaturazione dei vasiformazione di vasi sanguigni

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