A basso costo, il sistema facile da usare e potente è stabilito per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero migliorare barriera emato-retinica violazione indotta da istamina. perdita dei vasi sanguigni, l'attivazione delle cellule Müller e la continuità dei processi neuronali sono utilizzati per valutare la risposta al danno e la sua inversione con un potenziale farmaco, Lipoxin A4.
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Articolo metodologico
Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un sistema modello a basso costo, facile da usare e potente è stato istituito per valutare potenziali trattamenti che potrebbero migliorare la violazione della barriera emato-retinica. È stato dimostrato che un fattore infiammatorio, l'istamina, compromette l'integrità dei vasi nella retina in coltura attraverso la colorazione positiva delle IgG al di fuori dei vasi sanguigni. Gli effetti dell'istamina stessa e quelli dei farmaci candidati per potenziali trattamenti, come la lipossina A4, sono valutati utilizzando tre parametri: perdita di vasi sanguigni tramite immunocolorazione IgG, attivazione delle cellule di Müller tramite colorazione GFAP e cambiamento nei dendriti neuronali attraverso la colorazione per MAP2. Inoltre, l'organizzazione stratificata della retina consente un'analisi dettagliata dei processi delle cellule di Müller e dei gangliari, come i cambiamenti di larghezza e continuità. Sebbene i dati presentati riguardino la coltura retinica suina, il sistema è applicabile a più specie. Pertanto, il modello fornisce uno strumento affidabile per studiare gli effetti precoci della compromissione dell'integrità dei vasi retinici su diversi tipi di cellule e anche per valutare potenziali farmaci candidati per il trattamento.
Introduzione
Un crescente corpo di prove sostiene l'esistenza di barriera retinica sangue (BRB) 1-5 e la sua somiglianza con la barriera emato-encefalica (BBB) 6,7. Compromesso della BBB è stata strettamente legata causalmente o come marcatore diagnostico per le malattie neurodegenerative croniche come il morbo di Alzheimer (AD) 8,9 e acuti condizioni come il delirio 10. intuizioni meccanicistici in queste patologie e scoperte per i potenziali bersagli farmacologici sono generalmente ostacolati dalla limitata accessibilità e network complessità del cervello. Alternative come l'imaging in vivo 11, cervello o....
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Protocollo
Tutti i protocolli sono stati effettuati nel rispetto delle norme del Comitato di cura e l'uso di animali istituzionale, se del caso.
1. Preparazione
- Preparare il supporto di stabilizzazione con il 75% di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), il 25% Hanks 'soluzione salina bilanciata (HBSS). Mescolare bene, aliquotare e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare il tampone fosfato (PBS) e sterilizzare in autoclave. Conservare la soluzione a temperatura ambiente. Riscaldare la PBS a 37 ° C prima dell'esperimento (5 ml per pozzetto).
- Preparare 10%, 20% e 30% di saccarosio in PBS.....
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Risultati
Vi presentiamo un basso costo, sistema di time-efficiente e facile da usare per valutare i potenziali trattamenti che potrebbero proteggere contro la violazione BRB indotta da istamina. IgG è vincolato all'interno dei vasi in retina di controllo (Figura 1A), ma le perdite fuori dei vasi sanguigni su esposizione istamina (Figura 1B), a conferma che il modello è stata stabilita.
LXA4 è stato.......
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Discussione
In questo rapporto, presentiamo un potente modello retinico acuto ex vivo di disfunzione BRB utilizzando la retina suina. Questo sistema modello non richiede strumenti speciali e può essere facilmente adattato nella maggior parte delle impostazioni di laboratorio. Tuttavia, per ottenere un risultato di successo, diversi passaggi richiedono molta attenzione. Dopo aver ottenuto i bulbi oculari dalla fonte, questi devono essere conservati a 4 °C o su ghiaccio e lavorati il prima possibile. Quando si analizza l'effe.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Bringhurst Meats (Berlino, NJ) è riconosciuta per il suo aiuto genuino nel fornire i bulbi oculari ai suini.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tecnologie DMEM | Life | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Saccarosio | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Istamina | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | ||
| PFA | Microscopia Elettronica Scienze | 15710 | |
| Mezzi di congelamento | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Siero di capra normale | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Anticorpo | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Anticorpo | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC coniugato Donkey anti-coniglio IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 coniugato Asino anti-topo IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| supporto di montaggio contenente DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Microscopio | Nikon | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
Riferimenti
- Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
- Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
- Kumagai, A. K.
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Ristampe e permessi
