interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).
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Articolo metodologico
Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo essenziale nella funzione di un organismo vivente. Una volta che l'interazione è stata identificata e convalidata è necessario caratterizzare al livello strutturale e meccanicistica. Esistono diversi metodi biochimici e biofisici per tale scopo. Tra questi, anisotropia di fluorescenza è una tecnica potente particolarmente utilizzata quando l'intensità di fluorescenza di una proteina fluoroforo marcato rimane costante mediante interazione proteina-proteina. In questa tecnica, una proteina fluoroforo marcato è eccitato con luce polarizzata verticalmente di opportuna lunghezza d'onda che eccita selettivamente un sottoinsieme dei fluorofori in base al loro orientamento rispetto al fascio in ingresso. L'emissione risultante ha anche una direzionalità cui rapporto in piani verticali e orizzontali definisce anisotropia (r) come segue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), dove Vv e
Introduzione
Le cellule contengono una moltitudine di biomacromolecole che interagiscono costantemente con l'altro. Questa associazione dà luogo a complessi che partecipano alle vie cellulari responsabili per il loro funzionamento nella trasduzione del segnale, regolazione dell'espressione genica e la migrazione delle cellule, tra gli altri. Tutte le interazioni proteina-proteina che si verificano in una cella comprendono una rete nota come dell'interattoma. In Saccharomyces cerevisiae hanno dimostrato più del 70% delle proteine di avere partner interagenti 1. Comprendere la interattoma di una cella e le loro funzioni di fornire informazioni pertin....
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Protocollo
1. SBDS-Flash etichetta proteine Espressione e purificazione
NOTA: Per gli esperimenti di anisotropia, un flash-tag corrispondente alla sequenza Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys stato aggiunto al C-terminale delle SBDS umani sequenza codificante mediante PCR. Questo costrutto è stato subclonato nel vettore di espressione pRSET-A e trasformato in celle C41 Escherichia coli per esprimere una proteina che codifica per un tag hexahistidine N-terminale (His-tag), i SBDS umani codificante sequenza e un C-terminale Flash etichetta 10.
- Espressione della proteina SBDS-FLASH
- Trasforma competente E. cellule ....
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Risultati
Per eseguire qualsiasi esperimento anisotropia è importante escludere grandi variazioni dell'intensità di fluorescenza del fluoroforo poiché l'anisotropia osservata di una miscela di specie è rappresentata dall'equazione 5:
dove F i rappresenta la fluorescenza frazionata.......
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Discussione
Maggior parte degli esperimenti biochimici con proteine richiedono non solo proteina pura, ma anche grandi quantità di loro, indipendentemente dalla tecnica utilizzata. Per questo motivo, le proteine utilizzate per questo tipo di esperimenti sono ottenuti mediante espressione eterologa, come era il caso qui presentato. spettroscopia Florescence richiede la presenza di un fluoroforo nella molecola studiata. residui aromatici costituiscono i fluorofori intrinseci di una proteina, tuttavia, utilizzando il segnale per s.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario dai numeri di progetto CONACyT 167359 e 177138 e dal numero di progetto DGAPA-UNAM IN201615.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 mm Perle di vetro Biospec | Prodotti | 11079105 | |
| Tris Base | Formedium | TRIS01 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| colorante 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceina | ThermoFischer Scientific | LC6090 | Questo kit contiene il colorante per etichettare un tag FlAsH |
| Ampicilina | IBI Shelton Scientific, Inc | IB02040 | |
| D(+)-glucosio anidro | per mezzo | GLU03 | |
| D(+)-galattosio | per medio | GAL03 | |
| L-leucina | per medio | DOC0157 | |
| L-triptofan | Formedium | DOC0189 | |
| Bezamidina cloridrato | Sigma-Aldrich | B6506-5G | |
| PMSF | Gold Biotechnology, Inc | P-470-25 | Fenilmetilsulfonilfluoruro |
| NaCl | Formedium | NAC02 | Cloruro di sodio |
| Glycerol | Tecsiquim, S.A. de C.V. | GT1980-6 | |
| MgCl2 | Merck Millipore Corporation | 1725711000 | Cloruro di magnesio |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399-500G | |
| 2-Mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786-500G | Fosfato di potassio dibasico |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139-500G | Fosfato di sodio monobasico |
| Base azotata di lievito senza aminoacidi | Formedium | CYN0410 | |
| Estratto di lievito | Formedium | YEM03 | Micro Granulated |
| L-Tyroisne | Formedium | DOC0193 | |
| Adenina solfato | Formedium | DOC0230 | |
| Casamino acidi | Formedium | CAS03 | |
| Triptone | IBI Shelton Scientific, Inc | IB49182 | |
| IPTG | Formedium | IPTG025 | |
| Unità di filtrazione | Merck Millipore Corporation | UFC901096 | Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10 kDa |
| Filtro a membrana | Merck Millipore Corporation | GSWP04700 | Filtro a membrana, esteri misti di cellulosa, idrofilo, 0,22 µ m, 47 mm, bianco, liscio |
| Ni2+ colonna di affinità | QIAGEN | 30760 | Cartuccia preriempita con 5 ml Colonna |
| scambiatore di cationi solfopropilico | GE Healthcare Life Science | 17-5157-01 | HiTrap SP Sepharose FF 5 ml |
| Colonna di esclusione dimensionale | GE Healthcare Life Science | 28989335 | HiLoad 16/600 Superdex 200 PG |
| Cella di fluorescenza | Hellma Analytics | 111-057-40 | |
| Spettrofotometro | Agilent Technologies | G6860AA | Agitatore UV-Vis Cary 60 |
| ThermoFischer Scientific | SHKA4000-7 | MaxQ 4000 Intervallo di temperatura da banco Da -15 a 60 gradi C | |
| Centrifuga | ThermoFischer Scientific | 75004271 | Heraeus Megafuge 16R |
| FPLC | Pharmacia Biotech | Fuori produzione | Sistema FPLC conducibilità UV-MM II monitor P500 frazione di pompa |
| Spettrofluorimetro | Olis | No applicabile | Olis DM 45 con Polarization Toolbox |
Riferimenti
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989). <....
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Ristampe e permessi
