Articolo metodologico

Anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare le interazioni proteina-proteina

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DOI:

10.3791/54640

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21 ottobre 2016

 ,  , 
1Departamento de Química de Biomacromoléculas, Instituto de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Genética del Desarrollo y Fisiología Molecular, Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México

In questo articolo

Sommario

interazioni proteina sono al centro della funzione di una cellula. tecniche calorimetriche e spettroscopiche sono comunemente usati per caratterizzare loro. Qui si descrive anisotropia di fluorescenza come strumento per studiare l'interazione tra la proteina mutata nella sindrome di Shwachman-Diamond (SBDS) e il fattore di allungamento-simile 1 GTPase (EFL1).

Abstract

Le interazioni proteina-proteina svolgono un ruolo essenziale nella funzione di un organismo vivente. Una volta che l'interazione è stata identificata e convalidata è necessario caratterizzare al livello strutturale e meccanicistica. Esistono diversi metodi biochimici e biofisici per tale scopo. Tra questi, anisotropia di fluorescenza è una tecnica potente particolarmente utilizzata quando l'intensità di fluorescenza di una proteina fluoroforo marcato rimane costante mediante interazione proteina-proteina. In questa tecnica, una proteina fluoroforo marcato è eccitato con luce polarizzata verticalmente di opportuna lunghezza d'onda che eccita selettivamente un sottoinsieme dei fluorofori in base al loro orientamento rispetto al fascio in ingresso. L'emissione risultante ha anche una direzionalità cui rapporto in piani verticali e orizzontali definisce anisotropia (r) come segue: r = (I VV -I VH) / (I + 2I VV VH), dove Vv e

Introduzione

Le cellule contengono una moltitudine di biomacromolecole che interagiscono costantemente con l'altro. Questa associazione dà luogo a complessi che partecipano alle vie cellulari responsabili per il loro funzionamento nella trasduzione del segnale, regolazione dell'espressione genica e la migrazione delle cellule, tra gli altri. Tutte le interazioni proteina-proteina che si verificano in una cella comprendono una rete nota come dell'interattoma. In Saccharomyces cerevisiae hanno dimostrato più del 70% delle proteine di avere partner interagenti 1. Comprendere la interattoma di una cella e le loro funzioni di fornire informazioni pertinenti sulla complessità e la diversità degli organismi viventi. Diverse metodologie sono state descritte per identificare e caratterizzare le interazioni proteina-proteina. Diverso alto attraverso metodi messi come il lievito doppio ibrido 2, saggi di complementazione proteine frammento 3, affinità di purificazione 4 accoppiata alla spettrometria di massa e microarra proteineys vengono utilizzati per identificare una interazione 5,6. Una volta identificato, è necessario convalidare e puo variare caso per caso. Tipicamente, questi esperimenti comportano interrompere stessa interazione a livello dei singoli membri della coppia interazione, ad esempio, dalla delezione gene o sovraespressione di una delle proteine, e quindi cerca di cambiamenti nelle proprietà o funzione di un altro membro del livello cellulare. Successivamente, tecniche biofisiche 7 sono utilizzati per caratterizzare l'interazione proteina-proteina a livello molecolare. A tal fine, la struttura di complessi proteici sono determinati mediante cristallografia a raggi X, risonanza magnetica nucleare e la microscopia crioelettronica mentre calorimetria e spettroscopia di fluorescenza sono utilizzati per descriverli quantitativamente e meccanicamente.

In questo lavoro, anisotropia di fluorescenza è stato utilizzato come tecnica per caratterizzare l'interazione tra la GTPasi EFL1 e SBDS proteine. Queste proteine partecipano nella sintesi dei ribosomi promuovendo il rilascio di fattore di inizio eucariotico 6 dalla superficie 60S ribosomiale subunità 8. La proteina SBDS è mutato in una malattia nota come Shwachman-Diamond Sindrome 9 e agisce come un fattore di scambio guanina nucleotide per EFL1 diminuendo la sua affinità per guanosindifosfato 10,11. mutazioni malattia in SBDS abolire l'interazione con EFL1 e quindi impediscono la sua attivazione.

Fluorescenza anisotropia è comunemente usato in applicazioni biologiche per studiare la proteina-peptide o interazioni degli acidi nucleici proteine. Si basa sul principio che un fluoroforo eccitato con risultati luce polarizzata in una emissione parzialmente polarizzata. Anisotropia di fluorescenza è definito dall'equazione 1:

figure-introduction-1

dove ho vv e mi VH sono ilintensità di fluorescenza della verticale (VV) e in orizzontale (VH) polarizzati emissione quando il campione è eccitato con luce polarizzata verticalmente 12. Anisotropia di fluorescenza è sensibile a fattori che influenzano la velocità di diffusione rotazionale del fluoroforo e dipende dalla temperatura, la viscosità della soluzione e la dimensione molecolare apparente del fluoroforo così. La dimensione apparente di una proteina contenente un fluoroforo aumenta quando interagisce con un'altra proteina e tale modifica può essere valutato come un cambiamento di anisotropia. Più specificamente, un fluoroforo che ruota lentamente in soluzione rispetto alla sua durata fluorescente avrà un valore I VV e piccolo valore I VH e pertanto presentano una relativamente grande anisotropia. Per fluorofori che scendono rapidamente rispetto al loro ciclo di vita fluorescente, ho Vv e VH saranno simili e il loro valore anisotropia sarà piccolo 12 (Figura 1). Inoltre, per un buon segnale anisotropia di misura del rumore, è necessario avere un fluoroforo con una vita di fluorescenza simile al tempo di correlazione rotazionale della molecola di interesse. Altrimenti, non è possibile registrare accuratamente la differenza di anisotropia tra la proteina libero e che nel complesso. Ad esempio, l'anisotropia di una sonda fluorescente con una durata quasi 4 nsec come fluoresceina o rodamina collegati a un composto a basso peso molecolare di 100 Da è 0.05. Associazione a una molecola di 160 kDa aumenterà il suo valore anisotropia a 0,29; una differenza che può essere misurata con precisione. Al contrario, la stessa sonda fluorescente coinvolto in una reazione di legame cui incremento di peso molecolare varia da 65 a 1000 kDa comporterà solo un cambiamento anisotropia di 0,28 e 0,3, che è troppo piccola per essere misurata con precisione. In questo scenario, una sonda con una durata di 400 nanosecondi sarebbe più adatto 12.

figure-introduction-2
Figura 1. Rappresentazione schematica delle apparecchiature utilizzate per misurare anisotropia di fluorescenza e la procedura. Rappresentazione schematica dell'attrezzatura utilizzata per eseguire una anisotropia di fluorescenza misurazione proteina-proteina interazione esperimento. Fluorofori che scendono visualizzazione rapida piccolo anisotropia che aumenta dopo il legame a un partner di interazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

applicazioni fluorescenza richiedono la presenza di un fluoroforo in una qualsiasi delle molecole studiate. Per studiare le interazioni proteina-proteina ci sono tre tipi di fluorofori: 1) i residui di triptofano presenti nelle proteine, 2) fluorofori allegate chimicamente e 3) partner di fusione fluorescenti come la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua Derivative. La maggior parte delle proteine ​​hanno residui di triptofano sulla sua struttura, così il modo più semplice per misurare un'interazione è monitorando i cambiamenti nel corrispondente spettri di fluorescenza o monitorando i cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei residui di triptofano. Tuttavia, residui di triptofano possono essere presenti in entrambe le proteine ​​complicare l'analisi. D'altra parte, per un fluoroforo per modificare le proprietà fluorescenti dovuto all'interazione deve essere situato sopra o vicino al sito di legame e potrebbe interferire con l'interazione stessa. Questo richiede particolare attenzione quando si utilizza fluorofori ingombranti come GFP. Se nessuno di questi fluorofori può essere utilizzato per studi di legame è necessario, quindi, di introdurre fluorofori estrinseci a una delle proteine ​​coinvolte. Molti fluorofori sintetizzati chimicamente esistono e possono essere covalentemente attaccati alle proteine ​​attraverso i loro gruppi reattivi come i gruppi amminici (catena laterale di lisine o N-terminale) ei gruppi tiolici in cisteina. Fderivati luorophore con isotiocianato e succinimidyl esteri reagiscono con gruppi ammidici mentre Iodoacetamide e maleimmide sono gruppi tiolo-reattivi 13. I coloranti più comuni utilizzati in applicazioni in fluorescenza sono derivati ​​del fluoresceina ei coloranti verdi rodamina, cumarine, fluorofori BODIPY e coloranti Alexa Fluor. Un elenco dettagliato dei fluorofori disponibili in commercio e il loro uso può essere trovato in riferimenti 14,15. Per l'etichettatura di successo, il gruppo reattivo deve essere esposto sulla superficie della proteina, ma a causa del gran numero di gruppi funzionali reattivi tipicamente presenti in polipeptidi è molto difficile ottenere modificazioni sito-specifica. La proteina di interesse in questo studio, SBDS, contiene 5 cisteine ​​libere e 33 lisine che possono provocare l'etichettatura più siti. l'etichettatura non uniforme può influenzare il legame e complicherà l'analisi dei dati come diverse molecole fluorofori possono suscitare diversi segnali di intensità fluorescente su vincolante. a Overcome questo problema, abbiamo usato il fluoroforo flash, 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina all'etichetta sito-diretta la proteina SBDS. Questo è un colorante arsenoxide con alta affinità per quattro cisteine distanziati in un motivo conosciuto come FlAsH-tag costituito dalla CCXXCC sequenza in cui X è un qualsiasi amminoacido diverso cisteina 16,17. Questo motivo tetracysteine ​​viene aggiunto N- o C-terminale della proteina mediante ingegneria genetica insieme ad un linker opportuno evitare l'interruzione della piega complessiva della proteina. La coppia che consiste di Flash tintura e Flash-tag è stato originariamente progettato per le proteine di etichette site-specific nelle cellule viventi 17, ma può anche essere usato per etichettare le proteine purificate in vitro come è esemplificato qui. Inoltre, sono stati sviluppati strategie enzimatici per consentire funzionalizzazione site-specific di proteine 18.

In questo manoscritto descriviamo l'utilità di anisotropia di fluorescenza unTool SA per studiare le interazioni proteina-proteina. Binding può essere valutata semplice ispezione della forma vincolante curva mentre le informazioni quantitative può essere ottenuta dalla misura dei dati sperimentali.

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Protocollo

1. SBDS-Flash etichetta proteine ​​Espressione e purificazione

NOTA: Per gli esperimenti di anisotropia, un flash-tag corrispondente alla sequenza Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys stato aggiunto al C-terminale delle SBDS umani sequenza codificante mediante PCR. Questo costrutto è stato subclonato nel vettore di espressione pRSET-A e trasformato in celle C41 Escherichia coli per esprimere una proteina che codifica per un tag hexahistidine N-terminale (His-tag), i SBDS umani codificante sequenza e un C-terminale Flash etichetta 10.

  1. Espressione della proteina SBDS-FLASH
    1. Trasforma competente E. cellule coli C41 con il plasmide pRSET-HisSBDS-flash utilizzando un protocollo standard shock termico 19. Piastra le cellule in mezzi solidi Luria-Bertani (LB) integrato con 100 mg / ml di ampicillina. LB composizione mezzi solidi consiste di 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito, 10 g di triptone e 20 g di agar per il volume 1 L.
    2. Culture batteri trasformati a 37 ° C finoassorbanza a 600 nm (A 600) raggiunge 0,5-0,7 in 1 L di LB liquidi integrato con 100 ug / ml di ampicillina.
    3. Indurre l'espressione delle proteine ​​con l'aggiunta di 0,5 mm isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside alla cultura e continuare l'incubazione per ulteriori 5 ore.
    4. Raccogliere sospensione batterica mediante centrifugazione a 3.800 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante. A questo punto, sia immagazzinare il pellet cellulare a -20 ° C o utilizzare immediatamente per la purificazione della proteina.
  2. Purificazione della proteina SBDS-FLASH
    NOTA: Tutti i passaggi cromatografici sono eseguite utilizzando un sistema di cromatografia liquida (FPLC) veloce proteina o una pompa peristaltica. Ni 2+ -affinity cromatografia utilizza una colonna flusso veloce 5 ml. Cromatografia a scambio anionico utilizza una forte colonna di scambio cationico solfopropil 5 ml. Un flusso di 3 ml / min è stato usato per tutti i passaggi cromatografici.
    1. Risospendere le cellule in 35 ml di Lysis SBDS BUffer (50 mM tampone fosfato pH 7,5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo) supplementato con 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF) e lisi mediante sonicazione per un tempo totale di 4 min con cicli di 10 secondi ON e 30 secondi OFF, a 4 ° C.
    2. Centrifugare il campione a 9000 xg per 50 min a 4 ° C.
    3. Tenere il surnatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari.
    4. Equilibrare la colonna Ni 2+ affinità con 3 volumi di colonna (CV) di SBDS Lysis buffer e introdurre il tutto chiarito surnatante sulla colonna.
    5. Rimuovere la proteina non legato mediante lavaggio con 3 CV di SBDS Lysis buffer e eluire con 3 CV di tampone SBDS eluizione (50 mm tampone fosfato pH 7.5, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo).
    6. Diluire la proteina 6-fold eluita con 50 mM di tampone fosfato pH 6,5 e rimuovere eventuali aggregati di filtrazione attraverso una membrana da 0,22 micron cellulosa.
    7. Equilibrare la colonna solfopropil cazione scambiatore con 3 CV di mancanza sale colonna Stampone (50 mM tampone fosfato pH 6,5, 50 mM NaCl) e introdurre il campione di proteine ​​dal passaggio precedente.
    8. Lavare il materiale non legato con 3 CV di mancanza sale S buffer di colonna ed eluire la proteina in un unico passaggio con 50 mM tampone fosfato pH 6,5, 1 M NaCl.
    9. Diluire la proteina 3.3-fold eluita con tampone fosfato 50 mM pH 6.5. Concentrare la proteina con dispositivi di ultrafiltrazione per centrifugazione a 3.800 xg per 15 min. Flash congelare la proteina in azoto liquido e conservarlo a -80 ° C fino all'utilizzo.
    10. Verificare la purezza della proteina mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie 20.

2. EFL1 espressione della proteina e purificazione

NOTA: EFL1 è stata espressa ai sensi del regolamento del Gal 1/10 promotore divergenti 21 e il Saccharomyces cerevisiae MAT A 3'UTR nel pRS426 vettore. La proteina ricombinante codifica il EFL1 isoforma umana 1 fuso ad un virus proteasi Tobacco Etch (TEV) sito di riconoscimento e un tag hexahistidine al C-terminale.

  1. Espressione della proteina EFL1
    1. Trasforma S. cellule cerevisiae BCY123 con il plasmide pRS426-EFL1TevHis usando una batteria agli standard di acetato di protocollo 22. Piatto tutte le cellule trasformate a goccia sintetica su supporti senza uracile (SD-URA) addizionato con 2% (w / v) di glucosio. Composizione dei media SD-URA consiste di 8 g base azotata di lievito senza amminoacidi, acidi Casamino 11 g, 55 mg adenina solfato, 55 mg tirosina, 60 mg e 60 mg leucina triptofano per volume di 1 L.
    2. Culture trasformato lievito a 30 ° C fino a 600 raggiunge 1,8 in 1 L di supporti SD-URA integrato con 0,5% (w / v) di glucosio.
    3. Indurre l'espressione della proteina aggiungendo 2,8% (w / v) galattosio alla cultura e continuare l'incubazione per ulteriori 18 ore a 30 ° C.
    4. Raccogliere la sospensione di lievito per centrifugazione a 3.800 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.A questo punto, sia immagazzinare il pellet cellulare a -20 ° C o utilizzare immediatamente per la purificazione della proteina.
  2. Purificazione della proteina EFL1
    NOTA: Tutti i passaggi cromatografici sono eseguite utilizzando un sistema FPLC o una pompa peristaltica. Ni 2+ -affinity cromatografia utilizza una colonna flusso veloce 5 ml ad un flusso di 3 ml / min. esclusione dimensioni cromatografia utilizza una colonna di 125 ml di pre-compresso con Superdex 200 in resina ad un flusso di 1 ml / min.
    1. Risospendere le cellule in 50 ml di EFL1 Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo) supplementato con 1 mM PMSF e 1 mM benzamidine e disturbare le cellule attrito su un battitore tallone utilizzando perle di vetro (Ø = 0,5 mm) per un tempo totale di 6 min con cicli di 2 min oN e OFF 15 min, a 4 ° C.
    2. Centrifugare il campione a 9000 xg per 50 min a 4 ° C.
    3. Tenere il surnatante e scartare il pellet per rimuovere i detriti cellulari.
    4. Equilibrare la colonna affinità Ni 2+ con 3 CV di EFL1 Lysis buffer e inserire tutte le surnatante chiarificato sulla colonna.
    5. Rimuovere proteina non legata mediante lavaggio con 3 CV di EFL1 Lysis buffer ed eluire con 3 CV di tampone EFL1 eluizione (50 mM Tris-HCl pH 8, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo).
    6. Equilibrare la colonna esclusione dimensionale con 1,5 CV di tampone Anisotropia (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 10% glicerolo, 5 mM β-mercaptoetanolo).
    7. Concentrato a 1 ml della proteina EFL1 eluito dalla colonna di affinità Ni 2+ con dispositivi di ultrafiltrazione per centrifugazione a 3.800 xg al volume desiderato. Introdurre il campione sulla colonna delle dimensioni dell'esclusione.
    8. Raccogliere la proteina eluita e concentrare per ultrafiltrazione ad una concentrazione finale di circa 30 micron. Flash congelare la proteina in azoto liquido e conservare a -80 ° C fino all'utilizzo. Verifica °e la purezza della proteina mediante analisi SDS-PAGE e colorazione Coomassie 20.

3. Etichettatura di SBDS-flash con il flash colorante fluorescente 4 ', 5'-Bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina

  1. Mescolare 3 nmol della proteina SBDS-flash con 3 nmol di 4 ', 5'-bis (1,3,2 dithioarsolan-2-il) fluoresceina in 5 volumi microlitri di tampone Anisotropia.
  2. Lasciate che la reazione di proseguire per 8 ore a 4 ° C. Dializzare il campione contro il buffer di anisotropia durante la notte per rimuovere il colorante libero.
  3. Utilizzare la legge di Lambert-Beer per quantificare la% di proteina marcata. Misurare l'assorbanza a 280 nm e 508 nm in uno spettrofotometro utilizzando una cuvetta di quarzo di volume adeguato. NOTA: Considerare i seguenti coefficienti di assorbimento molari (M -1 cm -1):
    figure-protocol-1
  4. Calcolare la concentrazione di proteina etichettata SBDS-flash utilizzando Equazione 2.
    figure-protocol-2
  5. Calcolare la concentrazione di proteine totali SBDS usando Equazione 3 sostituendo il calcolato C SBDS-Flash da precedente passaggio.
    figure-protocol-3
  6. Calcolare la percentuale di proteina marcata usando l'equazione 4.
    figure-protocol-4

4. Esperimenti anisotropia di fluorescenza

NOTA: esperimenti anisotropia sono state fatte in un spettrofluorimetro attrezzato con una collezione di polarizzazione strumenti e dati è stata effettuata utilizzando il programma anisotropia fornita nel software dell'apparecchio. La lunghezza d'onda di eccitazione è stata fissata a 494 nm con una banda spettrale di 8 nm e l'emissione è stato registrato utilizzando un filtro passa-banda di 530 ± 25 nm. Le misurazioni sono state effettuate a 25 ° C in una cuvetta 200 microlitri con un 5 mm di traiettoria 10.

  1. In una vaschetta di fluorescenza, mettere 200 ml di 30 nm SBDS-Flash nel buffer di anisotropia e titolare di 2 ml di 30 micron EFL1. Mescolare accuratamente e lasciar riposare la reazione per 3 minuti prima di misurare il valore di anisotropia.
  2. È stato aggiunto Ripetere il punto 4.1 fino ad un volume totale di 40 microlitri di EFL1.

Analisi 5. I dati

  1. Montare i dati al modello di rilegatura appropriato utilizzando un algoritmo non lineare almeno quadrati di regressione. Equazioni per i modelli di attacchi più comuni sono riportati in Tabella 1.
  2. Valutare il miglior modello che descrive l'interazione tra le proteine ispezionando residui della misura 23. Sostenere il modello scelto con ulteriori esperimenti.

Tabella 1. Modelli di legame interazioni proteina-proteina comune e le equazioni matematiche che li descrivono.0 / 54640table1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
figure-protocol-5

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Risultati

Per eseguire qualsiasi esperimento anisotropia è importante escludere grandi variazioni dell'intensità di fluorescenza del fluoroforo poiché l'anisotropia osservata di una miscela di specie è rappresentata dall'equazione 5:

figure-results-1

dove F i rappresenta la fluorescenza frazionata...

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Discussione

Maggior parte degli esperimenti biochimici con proteine ​​richiedono non solo proteina pura, ma anche grandi quantità di loro, indipendentemente dalla tecnica utilizzata. Per questo motivo, le proteine ​​utilizzate per questo tipo di esperimenti sono ottenuti mediante espressione eterologa, come era il caso qui presentato. spettroscopia Florescence richiede la presenza di un fluoroforo nella molecola studiata. residui aromatici costituiscono i fluorofori intrinseci di una proteina, tuttavia, utilizzando il segnale per s...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare e non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono il sostegno finanziario dai numeri di progetto CONACyT 167359 e 177138 e dal numero di progetto DGAPA-UNAM IN201615.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5 mm Perle di vetro BiospecProdotti11079105
Tris BaseFormediumTRIS01
GliceroloSigma-AldrichG5516
colorante 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolan-2-il) fluoresceinaThermoFischer ScientificLC6090Questo kit contiene il colorante per etichettare un tag FlAsH
AmpicilinaIBI Shelton Scientific, IncIB02040
D(+)-glucosio anidroper mezzoGLU03
D(+)-galattosioper medioGAL03
L-leucinaper medioDOC0157
L-triptofanFormediumDOC0189
Bezamidina cloridratoSigma-AldrichB6506-5G
PMSFGold Biotechnology, IncP-470-25Fenilmetilsulfonilfluoruro
NaClFormediumNAC02Cloruro di sodio 
GlycerolTecsiquim, S.A. de C.V.GT1980-6
MgCl2Merck Millipore Corporation1725711000Cloruro di magnesio
ImidazoleSigma-AldrichI2399-500G
2-MercaptoetanoloSigma-AldrichM6250-100ML
K2HPO4Sigma-AldrichP3786-500GFosfato di potassio dibasico
NaH2PO4Sigma-AldrichS3139-500GFosfato di sodio monobasico
Base azotata di lievito senza aminoacidiFormediumCYN0410
Estratto di lievitoFormediumYEM03Micro Granulated
L-TyroisneFormediumDOC0193
Adenina solfatoFormediumDOC0230
Casamino acidiFormediumCAS03
TriptoneIBI Shelton Scientific, IncIB49182
IPTGFormediumIPTG025
Unità di filtrazioneMerck Millipore CorporationUFC901096Amicon Ultra-15, membrana PLGC Ultracel-PL, 10  kDa
Filtro a membranaMerck Millipore CorporationGSWP04700Filtro a membrana, esteri misti di cellulosa, idrofilo, 0,22  µ m, 47  mm, bianco, liscio
Ni2+ colonna di affinitàQIAGEN30760Cartuccia preriempita con 5  ml Colonna
scambiatore di cationi solfopropilicoGE Healthcare Life Science17-5157-01HiTrap SP Sepharose FF 5 ml
Colonna di esclusione dimensionaleGE Healthcare Life Science28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 PG
Cella di fluorescenzaHellma Analytics111-057-40
SpettrofotometroAgilent TechnologiesG6860AAAgitatore UV-Vis Cary 60
ThermoFischer ScientificSHKA4000-7MaxQ 4000 Intervallo di temperatura da banco Da -15 a 60 gradi C
CentrifugaThermoFischer Scientific75004271Heraeus Megafuge 16R
FPLCPharmacia BiotechFuori produzioneSistema FPLC conducibilità UV-MM II monitor P500 frazione di pompa
SpettrofluorimetroOlisNo applicabileOlis DM 45 con Polarization Toolbox
ultra puro per Ni-NTA Superflow

Riferimenti

  1. Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
  2. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340, 245-246 (1989).
  3. Michnick, S. W., Hien Ear, P., Landry, C., Malleshaiah, M. K., Messier, V. A toolkit of protein-fragment complementation assays for studying and dissecting large-scale and dynamic protein-protein interactions in living cells. Methods in Enzymology. 470, 336-366 (2010).
  4. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  5. Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng Bugs. 2 (5), 247-259 (2011).
  6. Snider, J., et al. Fundamentals of protein interaction network mapping. Mol Syst Biol. 11 (12), 848(2015).
  7. Fersht, A. Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. Baldwin, R. L. , W. H. Freeman and Company. 191-214 (2002).
  8. Menne, T. F., et al. The Shwachman-Bodian-Diamond syndrome protein mediates translational activation of ribosomes in yeast. Nat Genet. 39 (4), 486-495 (2007).
  9. Boocock, G. R., et al. Mutations in SBDS are associated with Shwachman-Diamond syndrome. Nat Genet. 33 (1), 97-101 (2003).
  10. Garcia-Marquez, A., Gijsbers, A., de la Mora, E., Sanchez-Puig, N. Defective Guanine Nucleotide Exchange in the Elongation Factor-like 1 (EFL1) GTPase by Mutations in the Shwachman-Diamond Syndrome Protein. J Biol Chem. 290 (29), 17669-17678 (2015).
  11. Gijsbers, A., Garcia-Marquez, A., Luviano, A., Sanchez-Puig, N. Guanine nucleotide exchange in the ribosomal GTPase EFL1 is modulated by the protein mutated in the Shwachman-Diamond syndrome. Biochem Biophys Res Commun. 437 (3), 349-354 (2013).
  12. Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Third, Springer US. (2010).
  13. Nishigaki, T., Treviño, C. L. Tools to understand protein-protein interactions. Gòmez, I. 37, Transworld Research Network. 1-14 (2012).
  14. Johnson, I. The Molecular Probes Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , 11th, Life Technologies Corporation. (2010).
  15. Sabnis, R. W. Handbook of Fluorescent Dyes and Probes. , Wiley. (2015).
  16. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  17. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  18. Rashidian, M., Dozier, J. K., Distefano, M. D. Enzymatic labeling of proteins: techniques and approaches. Bioconjug Chem. 24 (8), 1277-1294 (2013).
  19. Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  20. Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D., Ehrhardt, W. Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis. 9 (6), 255-262 (1988).
  21. West, R. W. Jr, Chen, S. M., Putz, H., Butler, G., Banerjee, M. GAL1-GAL10 divergent promoter region of Saccharomyces cerevisiae contains negative control elements in addition to functionally separate and possibly overlapping upstream activating sequences. Genes Dev. 1 (10), 1118-1131 (1987).
  22. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
  23. Eftink, M. R. Fluorescence methods for studying equilibrium macromolecule-ligand interactions. Methods Enzymol. 278, 221-257 (1997).
  24. Han, H., et al. Binding of Substrates to the Central Pore of the Vps4 ATPase Is Autoinhibited by the Microtubule Interacting and Trafficking (MIT) Domain and Activated by MIT Interacting Motifs (MIMs). J Biol Chem. 290 (21), 13490-13499 (2015).
  25. Sanchez-Puig, N., Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Binding of natively unfolded HIF-1alpha ODD domain to p53. Mol Cell. 17 (1), 11-21 (2005).
  26. Trusch, F., et al. The N-terminal Region of the Ubiquitin Regulatory X (UBX) Domain-containing Protein 1 (UBXD1) Modulates Interdomain Communication within the Valosin-containing Protein p97. J Biol Chem. 290 (49), 29414-29427 (2015).
  27. Kamp, F., Beyer, K. Binding of alpha-synuclein affects the lipid packing in bilayers of small vesicles. The Journal of Biological Chemsitry. 281, 9251-9259 (2006).
  28. Bujalowski, W. M., Jezewska, M. J. Fluorescence Intensity, Anisotropy, and Transient Dynamic Quenching Stopped-Flow Kinetics. Spectroscopic Methods of Analysis. 875, 105-133 (2012).
  29. Asano, N., et al. Direct interaction between EFL1 and SBDS is mediated by an intrinsically disordered insertion domain. Biochem Biophys Res Commun. 443 (4), 1251-1256 (2014).

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