Qui descriviamo una tecnica basata sul microscopio per visualizzare e quantificare le prime cascate di eventi durante la fagocitosi di agenti patogeni come i funghi Candida albicans e particolati che sono più grandi di 0,5 μm, inclusi zimosani e perle rivestite di IgG.
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Articolo metodologico
Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il corpo dei mammiferi è dotata di vari strati di meccanismi che contribuiscono a difendersi dalle invasioni patogeni. Fagociti professionali del sistema immunitario - come i neutrofili, cellule dendritiche e macrofagi - mantengono la capacità innata di rilevare ed eliminare tali patogeni attraverso fagocitosi 1. La fagocitosi coinvolge eventi coreografia di riorganizzazione della membrana e actina rimodellamento sulla superficie delle cellule 2, 3. I fagociti interiorizzare con successo e sradicare molecole estranee solo quando sono soddisfatte tutte le fasi della fagocitosi. Questi passaggi includono il riconoscimento e vincolante del patogeno dai recettori pattern recognition (PRR) che risiede sulla superficie cellulare, formazione di tazza di fagocitosi attraverso actina-arricchito sporgenze membranose (pseudopodi) a circondare il particolato, e scissione della phagosome seguito da phagolysosome maturazione che risultati dellauccidendo del patogeno 3, 4.
Imaging e quantificazione delle varie fasi della fagocitosi è strumentale per chiarire i meccanismi molecolari di questo processo cellulare. La presente manoscritto riporta metodi per studiare le diverse fasi della fagocitosi. Descriviamo un approccio microscopio-based per visualizzare e quantificare la formazione coppa fagocitica vincolante, e l'interiorizzazione di particolato dai fagociti. Come si verifica quando la fagocitosi recettori innate su fagociti incontrano ligandi su una particella bersaglio più grande di 0,5 micron, le analisi che presentiamo qui comprendono l'uso di patogeni funghi Candida albicans e altre particelle, come zymosan e perline IgG-rivestite.
Introduzione
Nonostante la continua esposizione agli agenti patogeni come batteri, virus e funghi, il nostro corpo è ben attrezzata con sistema immunitario che forniscono protezione contro le infezioni. Il sistema immunitario innato è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori e si basa principalmente su fagociti che riconoscono e interiorizzano obiettivi stranieri.
La fagocitosi è un processo cellulare evolutivamente conservato che racchiude il engulfment di particelle indesiderate superiori a 0,5 micron. Fagociti esprimono una vasta gamma di recettori del sistema immunitario (noto anche come recettori pattern recognition, PRR) sull....
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Protocollo
1. Preparazione di DC2.4 e RAW 264.7 cellule Lines
NOTA: La linea cellulare di macrofagi come RAW 264.7 e la linea di cellule dendritiche DC2.4 sono sia di origine murina, e le seguenti condizioni sono stati usati per far crescere le cellule.
- Grow RAW 264.7 cellule in DMEM (Minimal mezzo di Eagle Dulbecco) supplementato con 10% inattivato siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO 2.
- Crescere le cellule DC2.4 in condizioni simili a quello di RAW 264.7 cellule, tranne l'uso di media RPMI (Roswell Park Memorial Institute) integrata con L-glutammina, invece di DMEM. <....
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Risultati
Metodo Microscopio a base di monitorare le diverse fasi della fagocitosi è presentato. Vengono visualizzati i diversi eventi durante la fagocitosi delle varie particelle fluorescenti da parte delle cellule DC2.4. Utilizzando le tecniche qui descritte, abbiamo studiato il ruolo degli sfingolipidi nelle prime fasi della fagocitosi. A questo scopo, DC2.4 cellule dendritiche geneticamente carenti di Sptlc2, l'enzima che catalizza la prima e limitante passo nella via di biosintesi degli sfingolipidi, sono stati utilizzati. R.......
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Discussione
fagociti professionali, come i macrofagi e le cellule dendritiche, inghiottire e di eliminare gli agenti patogeni d'invasione rendendo quindi la fagocitosi una componente importante del sistema di difesa dell'ospite. Durante questo processo fagociti vengono sottoposti a riorganizzazione membrana e riarrangiamento citoscheletro alla loro superficie cellulare 8, 19, 20. Per comprendere meglio questo processo dinamico, vis.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo Wendy salmone e Nicki Watson della struttura Keck al Whitehead Institute del MIT per l'imaging.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| β-mercaptoetanolo | AppliChem | A1108 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 9998 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dilattato) | ThermoFisher | D3571 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | ThermoFisher | BP-231-1 | |
| DMEM (Dulbecco' s Minimal Eagle' | Gibco | 11965 | |
| PBS, 1x (soluzione salina tamponata con fosfato) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| Siero fetale bovino | Sigma Aldrich | 12003C | |
| Perle di lattice rivestite di IgG accoppiate a FITC | Cayman | 500290 | |
| L-Glutammina 200 mM (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| Soluzione di paraformaldeide (4% in PBS) | Affymetrix | 19943 1 LT | |
| Penicillina-streptomicina (10.000 U/ml) | ThermoFisher | 15-140-122 | |
| Falloidina-Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A12379 | |
| RAW 264,7 celle | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI (Roswell Park Memorial Institute) | Gibco | 61870 | |
| Saponina | Sigma Aldrich | S7900 | |
| Soluzione di blu di tripano (0,4% (p/v) in PBS) | Corning cellgro | MT25900CI | |
| Tripsina-EDTA (1x) (0,05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Tween 20 Surfact-Amps Soluzione detergente | ThermoFisher | 85114 | |
| Zymosan-Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | Z23374 | |
| Sistema di copertura in borosilicato camerato 1.0 (8 camere) | ThermoFisher | 155361 | |
| Vetrino in vetro 10 con griglie | Hycor | 87144 |
Riferimenti
- Janeway, C. A. Jr, Medzhitov, R. Innate immune recognition. Annu. Rev. Immunol. 20, 197-216 (2002).
- Underhill, D. M., Goodridge, H. S. Information processing during phagocytosis. Nat. Rev. Immunol. 12, 492-502 (2012).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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Ristampe e permessi
