Articolo metodologico

Microglia come un biosensore surrogato per determinare nanoparticelle neurotossicità

DOI:

10.3791/54662

⸱

25 ottobre 2016

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1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

In questo articolo

Sommario

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Le microglia (cellule immunitarie del cervello), vengono utilizzate come biosensore surrogato per determinare come le nanoparticelle influenzano la neurotossicità. Descriviamo una serie di esperimenti progettati per testare la risposta microgliale alle nanoparticelle e l'esposizione dei neuroni ipotalamici al surnatante della microglia attivata per determinare la neurotossicità.

Abstract

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Le nanoparticelle presenti negli inquinanti atmosferici possono alterare i profili dei neurotrasmettitori, aumentare la neuroinfiammazione e alterare la funzione cerebrale. Pertanto, il test qui descritto aiuterà a chiarire il ruolo della microglia nella neuroinfiammazione e nelle malattie neurodegenerative. L'uso delle microglia, cellule immunitarie residenti nel cervello, come biosensore surrogato fornisce nuove informazioni su come le risposte infiammatorie mediano gli insulti neuronali. Qui, utilizziamo una linea cellulare microgliale murina immortalizzata, designata BV2, e descriviamo un metodo per l'esposizione alle nanoparticelle utilizzando nanoparticelle d'argento (AgNP) come standard. Descriviamo come esporre la microglia alle nanoparticelle, come rimuovere le nanoparticelle dal surnatante e come utilizzare il surnatante dalla microglia attivata per determinare la tossicità, utilizzando la sopravvivenza delle cellule ipotalamiche come misura. Dopo l'esposizione ad AgNP, l'attivazione microgliale di BV2 è stata convalidata utilizzando un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) con fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α). Il surnatante è stato filtrato per rimuovere l'AgNP e per consentire alle citochine e ad altri fattori secreti di rimanere nel terreno condizionato. Le cellule ipotalamiche sono state quindi esposte al surnatante della microglia attivata da AgNP e la sopravvivenza dei neuroni è stata determinata utilizzando un test fluorescente a base di resazurina. Questa tecnica è utile per utilizzare la microglia come biomarcatore surrogato della neuroinfiammazione e determinare l'effetto della neuroinfiammazione su altri tipi di cellule.

Introduzione

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Inquinamenti ambientali, in particolare quelle della gamma di nanoparticelle (NP) (1 - 20 nm di diametro), sono stati collegati a obesità e altre malattie neurodegenerative dovute alla capacità di attraversare la barriera emato-encefalica 1-3. L'esposizione elevata a inquinamento può indurre l'infiammazione del sistema nervoso centrale, tra cui l'ipotalamo 1. Un potenziale meccanismo in cui questo si verifica potrebbe essere attraverso nanoparticelle indotta attivazione di microglia (cellule immunitarie del cervello) 4. Studi precedenti hanno usato modelli in vivo per studiare gli effetti delle NP sulla salute del cervello che sono in termini di tempo, costosa, e non direttamente rispondere alla domanda di come NP influenzano microglia. Microglia svolgono un ruolo poliedrico nel sistema nervoso centrale, compreso il mantenimento del microambiente cerebrale e comunicante con circostanti neuroni tramite il rilascio di fattori secreti e citochine. A seconda degli stimoli, microglia può essere attivato per un pr M1o-infiammatorie o uno stato antinfiammatorio M2. Ad esempio, M1 attivato microglia rilasciano citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-α), mentre M2 attivato rilascio microglia citochine anti-infiammatorie comprese interleuchina-4 (IL-4). Per convalidare la nostra surrogata in vitro biosensore per la determinazione neurotossicità degli inquinanti atmosferici, abbiamo misurato la risposta della microglia a 20 nm nanoparticelle d'argento (AGNPS). L'obiettivo di questo articolo è quello di descrivere come una linea di cellule microgliali in vitro può essere utilizzato come marcatore surrogato biosensore per testare la risposta della microglia murina di NP e come microglia attivazione colpisce le cellule ipotalamiche. Il lungo termine destinato applicazione di questo modello convalidato è quello di testare gli effetti delle sostanze inquinanti del mondo reale per la salute del cervello e le malattie neurodegenerative. Forniamo una descrizione dettagliata di un test in vitro formato da 96 pozzetti per la misura di attivazione della microglia e la sopravvivenza delle cellule ipotalamico dopo l'esposizione del microfono roglial mezzi condizionati.

attivazione della microglia è stato determinato a seguito di esposizione AgNP utilizzando un enzima TNF-α linked immunosorbent assay (ELISA). Per determinare l'effetto della microglia attivata su cellule ipotalamiche, i AGNPS sono stati rimossi dal surnatante microglia (mezzi condizionati) utilizzando un dispositivo di filtraggio. Il dispositivo di filtraggio mantiene citochine, escludendo i AGNPS in base alle dimensioni. Brevemente, surnatante dal microglia trattate con o senza AGNPS stato raccolto, aggiunto ai filtri, e centrifugato a 14.000 xg per 15 min. Siamo stati quindi in grado di determinare l'influenza delle citochine secrete microgliali sulla vitalità delle cellule ipotalamo. Tossicità cellulare a seguito di esposizione ai media condizionata (contenenti citochine) è stata determinata mediante un saggio resazurin basato come precedentemente descritto 5,6. Metabolicamente attive cellule riducono resazurin e producono un segnale fluorescente proporzionale al numero di cellule vitali 7.

nt "> Ci sono molti vantaggi di utilizzare questa tecnica rispetto ad altri (come co-coltura, messe a punto trans-bene, o esperimenti in vivo). Il nostro modello offre la possibilità di attivare direttamente microglia e determinare se i fattori secreti sono tossici per i neuroni 8 . L'attuale protocollo utilizza immortalato microglia BV2 stimolato con le nanoparticelle di diametro 20 nm, e immortalato cellule ipotalamiche murine (designato mHypo-A1 / 2) 9 per la determinazione della risposta successiva. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per queste condizioni specifiche, i metodi possono essere alterato per essere utilizzato in altri modelli di morte cellulare indotta microgliali, o con altri tipi di cellule inclusi microglia primaria e neuroni.

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Protocollo

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1. microglia Manutenzione Cell Culture

  1. terreno di coltura cellulare Warm (Dulbecco Modified Eagle Medium; DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina / neomicina (PSN) a 37 ° C.
  2. Ottenere Stock Frozen di cellule microgliali BV2 al passaggio 18 - 25 da stoccaggio a -80 ° C. Rapidamente scongelare le cellule a 37 ° C bagnomaria.
  3. Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato 75 centimetri 2 terreni di coltura contenente 10 ml di cellule.
  4. Incubare pallone in 5% di CO 2 a 37 ° C. mezzi Aspirare dopo 24 ore e sostituire con mezzi freschi. Crescere le cellule fino a circa 70 - 80% di confluenza.

2. Conteggio e cellule placcatura

  1. In un bagno d'acqua a 37 ° C, DMEM caldo e soluzione 1x-tripsina-EDTA.
  2. supporti Aspirare dalle cellule e aggiungere 500 ml di tripsina. Incubare a 37 ° C per 2 - 5 min.
  3. Utilizzando un raschietto, rimuovere le cellule dal pallone e sospendere in 5 mldi DMEM. Passare cellule attraverso un filtro 70 micron in un tubo da 50 ml tre volte.
  4. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e sementi 8.000 cellule / pozzetto in un nero murate piastra inferiore chiara in un volume finale di 200 microlitri DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
  5. Rimuovere la vecchia DMEM e sostituirlo con 200 ml di DMEM riscaldato integrato con 1% PSN al siero morire di fame microglia. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.

3. Attivazione microglia

  1. In tubi separati, diluire AGNPS (0,01, 0,05 o 0,1 mg / ml) e controllo del veicolo / neutro (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM senza siero addizionato con 1% PSN a concentrazioni finali di lavoro.
  2. Togliere 100 ml di mezzi di ogni bene e sostituirlo con 100 ml di composto trattamento appropriato.
  3. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.

4. Filtraggio media condizionata

  1. Raccogliere 200 ml di surnatante dei media da ogni pozzetto e trasferire in un filtro (cutoff peso molecolare di 10 kDa) con tubo di raccolta (1,5 a 2 ml).
  2. Centrifugare a 14000 xg a temperatura ambiente per 15 min.
  3. Gettare il flow-through (surnatante con particelle) e inserire il filtro a testa in giù in un nuovo tubo di raccolta.
  4. Centrifugare a 1000 xg a temperatura ambiente per 2 min.
    NOTA: I media filtrato risultante (contenente citochine secrete) è concentrata per sei volte.
  5. Portare il volume di concentrato a 400 ml con DMEM fresco supplementato con 10% FBS e 1% PSN e memorizzare sul ghiaccio.
    NOTA: Per assicurare AGNPS residui vengono rimossi dal supporto filtrati, genera una concentrazione AgNP sulla base del picco caratteristico a circa 390-420 nm 10. In breve, preparare aliquote di AGNPS non filtrati (0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, e 0.2 mg / ml come descritto al punto 3.1) e filtratacontrollo del veicolo (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM senza siero. Aliquota 50 ml di campioni e degli standard filtrati in un nero murate piastra inferiore chiaro. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'assorbanza a 390-410 nm e confrontare le letture per la curva di concentrazione AgNP. Se i campioni filtrati hanno lo stesso valore di assorbanza del campione di controllo del veicolo, si può presumere AGNPS residui vengono rimossi.
  6. Utilizzare la metà dei mezzi filtrati per determinare secrezione TNF-α seguenti istruzioni da un kit disponibile in commercio.

5. ipotalamico Manutenzione Cell Culture

  1. Warm mezzo di coltura cellulare DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN a 37 ° C.
  2. Ottenere Stock Frozen di ipotalamo (mHypo-A1 / 2) le cellule a passaggio 18 - 25 conservati a 80 ° C. Rapidamente scongelare le cellule a 37 ° C bagnomaria.
  3. Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato 75 centimetri 2 terreni di coltura contenente 10 ml di cellule.
  4. Incubare pallone in 5% di CO 2 a 37 ° C. mezzi Aspirare dopo 24 ore e sostituire con mezzi freschi. Crescere le cellule fino a circa a 70 - 80% di confluenza.

6. Determinazione ipotalamica cellulare Tossicità

  1. DMEM caldo e la soluzione 1x-tripsina-EDTA in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  2. supporti Aspirare dalle cellule ipotalamiche e aggiungere 500 ml di tripsina. Incubare a 37 ° C per 2 - 5 min. Rimuovere le cellule dal pallone con un raschietto come sopra descritto al punto 2.
  3. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e piastra cellule ipotalamiche a 5.000 cellule / pozzetto in un nero murate piastra inferiore chiara in un volume finale di 200 microlitri DMEM supplementato con 10% FBS e 1% PSN e incubare durante la notte in 5% CO 2 a 37 ° C .
  4. Togliere 100 ml di vecchi media con un pipetter multicanale e aggiungere 100 ml di mezzi condizionati concentrati filtrati, ad una concentrazione finale di 1x.
  5. Incubare la piastra in 5% CO 2 a 37 ° C per 24 ore.
  6. Aggiungere 221; l di reagente resazurina e incubare per 20 min piastra in 5% CO 2 a 37 ° C.
  7. Utilizzando uno spettrofotometro multimodale, registrare la fluorescenza (560 nm EX / 590 nm EM) per misurare la vitalità cellulare. Riportare i risultati come unità di fluorescenza relativa (RFU).

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Risultati

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Abbiamo dimostrato che la funzione microglia come un biosensore surrogato per la risposta del cervello alle nanoparticelle utilizzando il protocollo di cui sopra. I nostri risultati includono la misurazione degli effetti tossici di attivazione della microglia sulla morte delle cellule neuronali a valle. La Figura 1 mostra un flusso di lavoro del protocollo per attivare la microglia e determinare se le citochine secrete ridurre la vitalità dei neuroni ipotalamici. Secrezi...

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Discussione

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Studi recenti sostengono che l'esposizione ambientale contribuisce all'obesità e ad altre malattie neurodegenerative 11,12. Tuttavia, le tecniche utilizzate negli studi precedenti richiedono tempo e denaro. Considerazioni economiche, sistemi di somministrazione fisiologicamente rilevanti, questioni etiche con l'uso estensivo di modelli animali in vivo e difficoltà a tradurre i risultati in consigli sanitari significativi sono alcune delle principali sfide che hanno ostacolato i progressi nello studio ...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento degli Affari dei Veterani degli Stati Uniti BLR&D IK2 BX001686 (a TAB), e sovvenzioni dall'Università del Minnesota Healthy Foods, Healthy Lives Institute (a CMD, JPN, e TAB) e dalla Minnesota Veterans Medical Research & Education Foundation (a TAB). Ringraziamo i dottori Philippe Marambaud (Feinstein Institute for Medical Research, Manhasset, NY) e Weihua Zhao (Methodist Hospital, Houston, TX) per aver fornito la linea cellulare BV2.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cells/Reagenti
Linea cellulare microgliale di topo (BV2)Collezionelinee cellulari interlab (Genova, Italia)ATL03001
Linea cellulare di ipotalamo di topo adulto mHypoA-1/2 Cellutions Biosystems Inc.CLU172
Dulbecco' s Aquila modificata' s MediumInvitrogen10313-039
Siero fetale bovino PAA LabsA15-751
Penicillina/Streptomicina/NeomicinaThermo Fisher Scientific15640-055
Tripsina-EDTAThermo Fisher Scientific25200056
Nanoparticelle d'argento (20 nm)Sigma-Aldrich730793

PrestoBlue Cell Viability Reagent		InvitrogenA13262
Mouse TNF- &alfa; ELISA Max Delux Biolegend430904
LipopolisaccarideSigma-AldrichL4391
Citrato di sodioSigma-AldrichS4641
NomeCompanyNumero di catalogoComments
Equipment di fondo ottico strong>
96 W, polistirene nero, trattamento per colture cellulari, con coperchio,Thermo Fisher Scientific165305
Amicon Unità filtrante centrifuga Ultra-0.5 sterile con membrana Ultracel-10EMD MilliporeUFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode MicroplateMolecular DevicesM5
Falcon 50 ml Centrifuga conica TubiCorning, Inc
14-432-22
Filtri per celle Falcon 70 μ mCorning, Inc08-771-2
Centrifuga da tavolo 5430Eppendorf22620560
di

Riferimenti

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