Presentiamo protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging di ovociti maturi di Drosophila. Questi metodi consentono la visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio e della funzione del fuso durante la meiosi.
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Articolo metodologico
Tecniche di Imaging Prometafase e metafase della meiosi I nel fisso
In questo articolo
Sommario
Abstract
La segregazione cromosomica negli ovociti umani è soggetta a errori, con conseguente aneuploidia, che è la principale causa genetica di aborto spontaneo e difetti alla nascita. Lo studio del comportamento cromosomico negli ovociti di organismi modello è molto promettente per scoprire le basi molecolari della suscettibilità degli ovociti umani alle aneuploidia. La Drosophila melanogaster è suscettibile di manipolazione genetica, con oltre 100 anni di ricerca, comunità e sviluppo di tecniche. La visualizzazione del comportamento cromosomico e dell'assemblaggio del fuso negli ovociti di Drosophila presenta sfide particolari, tuttavia, principalmente a causa della presenza di membrane che circondano l'ovocita che sono impenetrabili agli anticorpi. Descriviamo qui i protocolli per la raccolta, la preparazione e l'imaging dell'assemblaggio del fuso della meiosi I e del comportamento cromosomico negli ovociti di Drosophila, che consentono la dissezione molecolare della segregazione cromosomica in questo importante organismo modello.
Introduzione
Lo studio della meiosi è talvolta descritto come la "genetica della genetica". Questo perché le proprietà fondamentali dell'ereditarietà cromosomica e dell'assortimento indipendente vengono svolte attraverso la segregazione dei cromosomi durante la produzione di gameti. Un'importante dimostrazione della teoria cromosomica dell'ereditarietà venne nel 1916 dal lavoro di Calvin Bridges in Drosophila melanogaster1. Questo e altri studi di genetica classica sulla Drosophila hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione della genetica. L'esame citologico dei cromosomi meiotici negli ovociti di Drosophila, tuttavia, è stato imp....
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Protocollo
Nota: Le procedure sono eseguite a temperatura ambiente salvo diversamente indicato. incubatori a temperatura controllata sono utilizzati per mantenere temperature per volare allevamento e attraversa se non diversamente specificato.
1. preparati
- Preparare mosche.
- Prometafase arricchito collezioni ovocita.
- Cancella adulto vola da sani, giovani stock o trasversali culture. bottiglie di età per due giorni a 25 ° C.
NOTA: Generalmente due bottiglie sani sarà sufficiente, anche se più può essere necessaria per alcune culture trasversali. - Dopo due giorni, raccogliere ~ 100 a 300 femmine (che vanno da 0 a 2 giorni di età....
- Cancella adulto vola da sani, giovani stock o trasversali culture. bottiglie di età per due giorni a 25 ° C.
- Prometafase arricchito collezioni ovocita.
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Risultati
I metodi che abbiamo descritto qui comporterà la raccolta di fase tardo-ovociti Drosophila che rappresentano tre fasi della meiosi (Figura 1). Gli ovociti in profase si distinguono per la presenza della membrana nucleare, che è visibile dalla mancanza di segnale di tubulina nella regione circostante il cariosoma (Figura 1A). Prometafase è il periodo dopo la rottura membrana nucleare durante il quale le assembla mandrino. Durante prometafase, il .......
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Discussione
Messa in scena Drosophila ovociti
Anche se un cariosoma allungata è spesso visto in ovociti prometafase, utilizzando cariosoma forma di distinguere prometafase da ovociti in metafase può essere problematico. Durante prometafase, il cariosoma inizia come una forma rotonda, si allunga, e poi si ritrae ad una forma rotonda come l'ovocita si avvicina l'arresto metafase. Ciò significa che molti ovociti prometafase non hanno un cariosoma allungata. Inoltre, se gli.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Christian Lehner per aver fornito l'anticorpo CENP-C e Eric Joyce per le raccomandazioni sulla FISH. Il lavoro nel laboratorio McKim è stato finanziato da una sovvenzione del NIH (GM101955).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubi conici da 15 ml | Vari | ||
| 16% formaldeide | Ted Pella, Inc. | 18505 | PERICOLOSO; una volta aperto, scartare dopo un mese |
| becher da 250 ml | Vari | ||
| tubi da 5 ml | Vari | ||
| lieviti attivi secchi | Vari | miscelare con acqua per ottenere una pasta della consistenza del burro di arachidi | |
| anticorpo anti-alfa--tubulina coniugato al clone FITC | Sigma | F2168 | DM1A |
| Binucleina 2 | Sigma | B1186 | PERICOLOSO |
| frullatore | Vari | ||
| siero bovino albumina | Sigma | A4161 | |
| cloruro di calcio Vari | |||
| colchicina | Sigma | C-9754 | |
| PERICOLOSO vetrini coprioggetti | VWR | 48366-227 | No. 1 1/2 |
| destrano solfato | Vari | ||
| DMSO | Vari | ||
| EGTA | Etanolo vario | ||
| Varie | |||
| pinze | Ted Pella, Inc. | 5622 | Dumont pinzette di alta precisione grado stile 5 |
| formamide | Sigma | 47670-250ML-F | |
| vetrini VWR | 48312-003 | ||
| glucosio | Vari | ||
| tubi graduati da 1,5 ml | Vari | ||
| HEPES | VWR | EM-5330 | disponibili da diversi venditori |
| Hoechst 33342 | Vari | ||
| cloruro di magnesio | Vari | ||
| metanolo | Varie | ||
| maglie di grandi dimensioni (~1.500 µ m) | VWR | AA43657-NK | varietà di formati e altri fornitori, 12 o 14 maglie |
| a maglia piccola (~300 &300 &; m) | Spectrum labs | 146 424 | varietà di formati, es., 146 422 o 146 486 |
| nutator | Varie | ||
| pipette di Pasteur | Varie | ||
| acetato di potassio | Varie | ||
| Acido cacodilico | Sigma | C0125 | PERICOLOSO; in alternativa, il cacodilato di sodio può essere sostituito dal |
| potassio Idrossido | Vari acetato | ||
| di sodio | Vari | ||
| cloruro di sodio | Vari | ||
| citrato di sodio | Vari | ||
| idrossido di sodio | Vari | ||
| Taxolo | |||
| vari (paclitaxel) | Sigma | T1912 | PERICOLOSO |
| Triton X-100 | Fisher | PI-28314 | |
| Tween 20 | Fisher | PI-28320 | |
| vortex | Vari |
Riferimenti
- Bridges, C. B. Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity. Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Theurkauf, W. E., Ha....
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Ristampe e permessi
