Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

Annika Weigand; Justus P. Beier; Andreas Arkudas; Majida Al-Abboodi; Elias Polykandriotis; Raymund E. Horch; Anja M. Boos

doi:10.3791/54676

Articolo metodologico

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

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DOI:

10.3791/54676

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2 novembre 2016

Annika Weigand¹ , Justus P. Beier¹ , Andreas Arkudas¹ , Majida Al-Abboodi¹^,² , Elias Polykandriotis³ , Raymund E. Horch¹ , Anja M. Boos¹

¹Department of Plastic and Hand Surgery and Laboratory for Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital of Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nürnberg (FAU), ²Genetic Engineering and Biotechnology Institute for Postgraduate Studies, Baghdad University, ³Department of Plastic, Hand and Microsurgery, Sana Klinikum Hof GmbH

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un approccio microchirurgico per la generazione di un loop arterovenosa (AV) come un modello di analisi vascolarizzazione in vivo in un ambiente isolato e ben caratterizzato. Questo modello non è solo utile per l'indagine di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per l'ingegneria vascolarizzato assialmente e tessuti trapiantabili.

Abstract

Una rete di vasi sanguigni funzionale è un prerequisito per la sopravvivenza e la crescita di quasi tutti i tessuti e organi del corpo umano. Inoltre, in situazioni patologiche come il cancro, la vascolarizzazione gioca un ruolo di primo piano nella progressione della malattia. Di conseguenza, vi è una forte necessità di un modello in vivo standardizzato e ben caratterizzato al fine di chiarire i meccanismi della neovascolarizzazione e sviluppare diversi approcci di vascolarizzazione per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.

Descriviamo un approccio microchirurgico per un piccolo modello animale per l'induzione di un asse vascolare costituito da una vena e un'arteria che sono anastomizzate a un'ansa arterovenosa (AV). L'ansa AV viene trasferita in una camera di impianto chiusa per creare un microambiente isolato in vivo, che è collegato all'organismo vivente solo per mezzo dell'asse vascolare. Utilizzando l'imaging 3D (risonanza magnetica, micro-CT) e l'immunoistologia, il sistema vascolare in crescita può essere visualizzato nel tempo. Impiantando diverse cellule, fattori di crescita e matrici, la loro funzione nella formazione della rete di vasi sanguigni può essere analizzata senza alcuna influenza di disturbo dall'ambiente circostante in un ambiente ben controllabile.

Oltre agli studi di angiogenesi e antiangiogenesi, il modello AV loop è anche perfettamente adatto per l'ingegnerizzazione di tessuti vascolarizzati. Dopo un certo tempo di prevascolarizzazione, i tessuti generati possono essere trapiantati nel sito difettoso e collegati microchirurgicamente ai vasi locali, garantendo così l'immediato afflusso di sangue e l'integrazione del tessuto ingegnerizzato. Variando le matrici, le cellule, i fattori di crescita e l'architettura della camera, è possibile generare vari tessuti, che possono poi essere adattati alle esigenze del singolo paziente.

Introduzione

La maggior parte dei tessuti e organi del corpo umano sono dipendenti da una rete di vasi sanguigni funzionale che fornisce nutrienti, scambia gas e rimuove i residui. Malfunzionamento del sistema causati da problemi vascolari locali o sistemici può portare a una moltitudine di malattie gravi. Inoltre, in aree di ricerca quali l'ingegneria tissutale o medicina rigenerativa, una rete di vasi sanguigni funzionali all'interno dei tessuti generati artificialmente o organi trapiantati è indispensabile per l'applicazione clinica di successo.

Per decenni i ricercatori hanno studiato gli esatti meccanismi coinvolti nella crescita vascolare al fine di conoscere più a fondo le situazioni patologiche al fine di trovare nuovi interventi terapeutici e fornire una migliore prevenzione dei disturbi vascolari. Nella prima fase, processi di base quali le interazioni cellula-cellula o l'effetto di molecole sulle cellule del sistema vascolare sono solitamente studiati in vitro 2D o 3Desperimenti. modelli 2D tradizionali sono di facile esecuzione, sono ben noti e hanno contribuito notevolmente ad una migliore comprensione di questi processi. Per la prima volta nel 1980, Folkman et al. segnalato nell'angiogenesi vitro semina delle cellule endoteliali capillari sulla gelatina piastre rivestite ^1. Questo ha dato immediatamente modo per pubblicazione di una moltitudine di ulteriori esperimenti angiogenesi 2D su tubo cellule endoteliali formazione test ^2, dosaggio migrazione ³ e la co-coltura di tipi cellulari ^4, così come gli altri. Questi test sono ancora in uso oggi e accettato come standard metodi in vitro.

Tuttavia, questa configurazione sperimentale non è sempre appropriato per lo studio del comportamento delle cellule in vivo poiché la maggior parte tipi cellulari richiedono un ambiente 3D per formare pertinenti strutture dei tessuti fisiologici ^5. Si è potuto dimostrare che l'architettura della matrice 3D è decisiva per capillare morphogenesiS ⁶ e che le interazioni cellula-extra matrice extracellulare (ECM) e cultura 3D condizioni regolano importanti fattori coinvolti nella angiogenesi tumorale ^7. La matrice 3D fornisce ingressi meccanici complessi, in grado di legare le proteine effettrici e stabilire gradienti di concentrazione del soluto dei tessuti scala. Inoltre, si ritiene necessario per imitare in morfogenetica vivo e passaggi rimodellamento dei tessuti complessi ^5. In questi sistemi, sia angiogenesi e vasculogenesi possono essere studiate. Mentre angiogenesi descrive la germinazione dei capillari da vasi sanguigni preesistenti ^8, vasculogenesi si riferisce alla formazione de novo dei vasi sanguigni attraverso le cellule endoteliali o dei loro progenitori ^9,10. La maturazione dei vasi è descritto in un processo chiamato 'arteriogenesis' attraverso il reclutamento delle cellule muscolari lisce ^11. Un angiogenico tipico modello in vitro è la germinazione delle cellule endoteliali da monostrato esistentes testa di serie come un monostrato su superfici gel, sulla superficie di microsfere incorporati all'interno di un gel o con la costruzione di sferoidi di cellule endoteliali ^12. Nei modelli vascolare cellule endoteliali singoli sono intrappolate in un gel 3D. Essi interagiscono con le cellule endoteliali adiacenti per formare strutture e reti de novo vascolari, tipicamente in combinazione con cellule di supporto ^12.

Tuttavia, anche complessa in 3D in modelli in vitro non possono mimare nelle impostazioni vivo completamente dato il gran numero di cellula-cellula e cellula-ECM Interazioni ^13. Le sostanze con un'elevata attività in vitro non mostrano automaticamente gli stessi effetti in vivo e viceversa ^14. Per un'analisi completa di vascolarizzazione processi vi è un urgente bisogno di sviluppare modelli in vivo che meglio simulano la situazione nel corpo. Una vasta gamma di test in vivo di angiogenesi sono descritti in letteratura, tra cui lasaggio pulcino chorioallantoic membrana (CAM), il modello di pesce zebra, il saggio di angiogenesi corneale, il modello di sacca d'aria dorsale, la camera di dorsali plica, i modelli di tumore sottocutaneo ^14. Tuttavia, questi test sono spesso associate a limitazioni, come ad esempio i cambiamenti morfologici rapidi, i problemi nel distinguere nuovi capillari da quelli già esistenti nel test CAM, o lo spazio limitato nel saggio di angiogenesi corneale ^15. Inoltre, vengono utilizzati sistemi non mammiferi (ad es., Il modello zebrafish ^16), che porta a problemi xenotrapianto ^17. Nel modello di tumore sottocutaneo, angiogenesi originari soltanto dal tumore stesso non può essere analizzato in quanto il tessuto adiacente contribuisce notevolmente al processo di vascolarizzazione. Inoltre, il tessuto circostante può avere un ruolo decisivo nel plasmare il microambiente tumorale ^18.

Non solo per lo studio dell'angiogenesi o vasculogenesi c'è un forte NEEd un standardizzato e ben caratterizzato modello in vivo, ma anche per lo studio delle diverse strategie di vascolarizzazione in ingegneria dei tessuti e della medicina rigenerativa. Oggi, la generazione di organi artificiali complessi o tessuti è possibile sia in vitro che in vivo. 3D bioprinting fornisce una tecnica di fabbricazione on-demand per la generazione di tessuti viventi funzionale complesso 3D ^19. Inoltre, bioreattori possono essere utilizzati per generare tessuti ²⁰ o persino il proprio corpo può essere utilizzato come bioreattore ^21. Tuttavia, la barriera principale per applicazione di successo di tessuti generati artificialmente è la mancanza di vascolarizzazione all'interno dei costrutti ingegnerizzati. collegamento immediato vascolare dell'ospite dopo il trapianto è un presupposto fondamentale per la sopravvivenza, specialmente nel caso di tessuti artificiali larga scala o organi.

Diverso in vitro o in vivo strategie prevascularization erano develpato per stabilire una microcircolo funzionale costrutti prima dell'impianto ^22. L'impianto di un ponteggio con in vitro capillari ingegnerizzati preformati sulla pelle dorsale di topi ha portato ad una rapida anastomosi vascolare topi entro un giorno ^23. Al contrario, una co-coltura sferoide costituito da cellule staminali mesenchimali umane della vena ombelicale e cellule endoteliali umane assemblate in una rete prevascolare tridimensionale sviluppato ulteriormente dopo l'impianto in vivo. Tuttavia, anastomosi con il sistema vascolare host è stato limitato ^24. Soprattutto, in difetti poco vascolarizzati, come le aree necrotiche o irradiate, questa cosiddetta estrinseca vascolarizzazione - la crescita interna dei vasi della zona circostante in patibolo - spesso non riesce. Vascolarizzazione intrinseca, invece, si basa su un asse vascolare come fonte di nuovi capillari germinazione nella scaffold ^25. Utilizzando l'approccio vascolarizzazione assiale, L'ingegneria tessutale può essere trapiantato con il suo asse vascolare e collegato alle navi locali nel sito ricevente. Immediatamente dopo il trapianto, il tessuto è adeguatamente supportato da ossigeno e sostanze nutritive, che crea le condizioni per l'integrazione ottimale.

A causa della limitata disponibilità di modelli per lo studio dell'angiogenesi in vivo e in riconoscimento della crescente importanza di generare tessuti assialmente vascolarizzato, abbiamo sviluppato l'approccio microchirurgico di Erol e Spira ulteriormente per generare un loop (AV) artero nel modello animale ^26. L'uso di una camera di impiantazione completamente chiusa rende questo metodo molto adatto per studiare la formazione di vasi sanguigni in "controllata", ben caratterizzata in condizioni in vivo (Figura 1). Questo modello non è utile solo per le indagini di angiogenesi, ma è anche perfettamente adatto per la vascolarizzazione assiale di ponteggi per Engin tessutofini eering.