Articolo metodologico

Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine ​​nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks

DOI:

10.3791/54678

⸱

10 novembre 2016

 , 
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

In questo articolo

Sommario

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Il danno mirato al DNA può essere ottenuto legando un agente dannoso al DNA a un oligonucleotide (TFO) che forma un triplex. Utilizzando TFO modificati, l'associazione proteica specifica per il danno al DNA e la modifica della topologia del DNA possono essere studiate nelle cellule umane utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA qui descritti.

Abstract

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casella di gruppo ad alta mobilità 1 proteine ​​(HMGB1) è una proteina di architettura non-istone che è coinvolto nella regolazione di molte funzioni importanti nel genoma, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA. HMGB1 si lega al DNA strutturalmente distorto con maggiore affinità rispetto alla canonica B-DNA. Ad esempio, abbiamo scoperto che HMGB1 si lega al DNA interstrand legami crociati (ICL), che collegano covalentemente i due filamenti del DNA, causa la distorsione dell'elica, e se non riparati può causare la morte delle cellule. A causa della loro potenziale citotossico, diversi agenti ICL-inducono sono attualmente utilizzati come agenti chemioterapici in clinica. Mentre gli agenti ICL-formatura mostrano preferenze per alcune sequenze di base (ad esempio, 5'-TA-3 'è il sito di reticolazione preferito per psoraleni), che in gran parte inducono danni al DNA in modo indiscriminato. Tuttavia, covalentemente accoppiando l'agente ICL induce ad un oligonucleotide triplex-formatura (TFO), che si lega al DNA in una sequenza specificamodo, il danno al DNA mirato può essere raggiunto. Qui, usiamo un TFO covalente coniugata sulla 'fine a una 4'-idrossimetil-4,5' la 5 (HMT) psoralen, 8-trimethylpsoralen per generare un ICL site-specific su un plasmide mutazione giornalista da utilizzare come strumento di per studiare la modifica architettonica, trasformazione e riparazione delle lesioni del DNA complessi HMGB1 in cellule umane. Descriviamo tecniche sperimentali per preparare ICL TFO-dirette sui plasmidi reporter, e di interrogare l'associazione di HMGB1 con le ICL TFO-orientate in un contesto cellulare utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina. Inoltre, descriviamo saggi superavvolgimento DNA per valutare specifica modifica architettonica del DNA danneggiato misurando la quantità di giri superelica introdotte sul plasmide psoralen-reticolato da HMGB1. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare i ruoli di altre proteine ​​coinvolte nella trasformazione e riparazione di ICL TFO-dirette o altri danni al DNA mirato in qualsiasi linea cellulare di interesse.

Introduzione

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Triplex di formazione oligonucleotidi (TFOS) DNA legano duplex in modo specifico per la sequenza tramite incollaggio Hoogsteen-idrogeno per formare strutture a tripla elica 1-5. La tecnologia Triplex è stata usata per interrogare una varietà di meccanismi biomolecolari, come la trascrizione, il DNA riparazione dei danni, e gene targeting (rivisto in riferimenti 6-8). TFOS sono stati ampiamente utilizzati per indurre un danno site-specific su plasmidi reporter 9,10. Il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato in precedenza un TFO, AG30, legato ad una molecola psoraleni per indurre site-specific legami crociati interstrand DNA (ICL) nel gene supF sul plasmide pSupFG1 5,10-12. ICL sono altamente citotossico come queste lesioni reticolazione covalente i due filamenti di DNA, e se non riparati, possono bloccare la trascrizione del gene e impedire il meccanismo di replicazione del DNA 13,14. A causa della loro potenziale citotossico, agenti ICL-induttori sono stati utilizzati come farmaci chemioterapici nel trattamentodi cancro e altre malattie 15. Tuttavia, la trasformazione e la riparazione di ICL in cellule umane non è ben compreso. Così, una migliore comprensione dei meccanismi coinvolti nella trasformazione di ICLs in cellule umane può contribuire a migliorare l'efficacia dei regimi chemioterapici ICL-base. ICL TFO-indotte e dei loro intermedi di riparazione hanno il potenziale di causare notevoli distorsioni strutturali per l'elica del DNA. Tali distorsioni sono obiettivi probabili per le proteine di architettura, che si legano al DNA distorto con maggiore affinità rispetto a B-forma canonica duplex DNA 16-20. Qui, abbiamo studiato l'associazione di una proteina architettonica altamente abbondanti, HMGB1 con ICL in cellule umane tramite immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) saggi su plasmidi psoraleni reticolato e identificato un ruolo per HMGB1 nel modulare la topologia del DNA plasmide psoralen-reticolato in umana lisati cellulari di cancro.

HMGB1 è altamente abbondante e ubiquitariamente espresso non suatono proteina architettonica che si lega al DNA danneggiato e substrati di DNA in alternativa strutturati con affinità maggiore di B-forma canonica DNA 17-20. HMGB1 è coinvolta in numerosi processi metabolici del DNA, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA 16,21-23. Abbiamo precedentemente dimostrato che HMGB1 si lega al ICL TFO-diretti in vitro con alta affinità 20. Inoltre, abbiamo dimostrato che la mancanza di HMGB1 aumentato il trattamento mutageno di ICL TFO-diretti e HMGB1 identificato come una riparazione per escissione di nucleotidi (NER) co-fattore 23,24. Recentemente, abbiamo scoperto che HMGB1 è associata con ICL TFO-diretti nelle cellule umane e la sua assunzione di tali lesioni dipende dalla proteina NER, XPA 16. Superavvolgimento negativo del DNA ha dimostrato di promuovere la rimozione efficiente di lesioni del DNA da NER 25, e abbiamo scoperto che HMGB1 induce superavvolgimento negativo preferenzialmente su TFO-diretti plas ICL contenentisubstrati metà (relativi ai substrati non danneggiati plasmidi) 16, fornendo una migliore comprensione del ruolo potenziale (s) di HMGB1 come cofattore NER. Il trattamento dei ICLs non è pienamente compresa in cellule umane; in tal modo, le tecniche e le analisi sviluppate sulla base degli strumenti molecolari qui descritte potrebbe portare all'identificazione di proteine ​​supplementari coinvolte nella riparazione ICL, che a loro volta possono servire come bersagli farmacologici che possono essere sfruttate per migliorare l'efficacia dei regimi chemioterapici cancro.

Qui, un approccio efficace per valutare l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto nel DNA plasmidico da denaturazione agarosio elettroforesi su gel è stato discusso. Inoltre, utilizzando i plasmidi contenenti le ICL TFO-diretti, le tecniche per determinare l'associazione di HMGB1 con plasmidi ICL-danneggiati in un contesto cellulare utilizzando saggi ChIP modificati sono stati descritti. Inoltre, un metodo facile per studiare modifiche topologiche introdotte da the HMGB1 proteine ​​architettonico, in particolare su substrati plasmide ICL-danneggiati in lisati cellulari umane è stata determinata eseguendo saggi superavvolgimento tramite elettroforesi bidimensionale agarosio. Le tecniche descritte possono essere utilizzate per favorire la comprensione del coinvolgimento di riparazione del DNA e delle proteine ​​architetturali nel trattamento dei danni DNA mirate su plasmidi in cellule umane.

Descriviamo protocolli dettagliati per la formazione di TFO-diretti ICLs psoraleni sito-specifici sul DNA plasmidico, e successiva ChIP plasmid e superavvolgimento saggi per identificare le proteine ​​che associano con le lesioni e proteine ​​che alterano la topologia DNA, rispettivamente. Questi test possono essere modificati per eseguire con altri agenti che danneggiano il DNA, TFOS, substrati plasmidi, e linee cellulari di mammiferi di interesse. Infatti, abbiamo dimostrato che non vi è almeno un potenziale unico e ad alta affinità sito TFO vincolante all'interno di ogni gene annotata nel genoma umano 26. Comemai, per chiarezza, abbiamo descritto queste tecniche per l'uso di un TFO specifica psoralen-coniugato (pAG30) su uno specifico plasmide mutazione giornalista (pSupFG1) in cellule umane U2OS abbiamo utilizzato in Mukherjee & Vasquez 2016 16.

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Protocollo

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1. Preparazione di ICL TFO-dirette sui plasmidi Substrati

  1. Incubare quantità equimolari di plasmide pSupFG1 10,11 DNA (DNA plasmide 5 mg è un buon punto di partenza) con psoraleni coniugato TFO AG30 in 8 ml di triplex tampone di legame [50% glicerolo, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] e dH 2 O ad un volume finale di 40 microlitri in un tubo ambra. Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la reazione a 37 ° C bagnomaria per 12 ore.
  2. Riscaldare la lampada UVA per garantire la piena potenza. Posizionare la reazione triplex su pellicola di paraffina, e posizionare il film di paraffina sul ghiaccio sotto la (nm 365) lampada UVA. Collocare un filtro Mylar tra la lampada e la reazione.
  3. UVA irradiare per una dose totale di 1,8 J / cm 2. Conservare i campioni a 4 ° C per un ulteriore uso.
    Attenzione: Indossare occhiali protettivi corretta e abbigliamento con UVA irradiazione.
  4. Linearizzare 200 ng del plasmide sopra preparato con il restriction enzima Eco R1 in un volume totale di 20 microlitri con il produttore fornito 10x tampone. Calore denaturare l'enzima per 20 minuti a 65 ° C. Spin i campioni per 10 minuti a 10.000 xg e conservare a 4 ° C.
  5. Preparare 50x tampone alcalino [1,5 M di NaOH, 50 mM etilendiamminotetraacetico acido (EDTA)]. Aggiungere 0,5 mg di agarosio a 50 ml dH 2 O. Far bollire per sciogliere l'agarosio e metterlo in un bagno d'acqua a 50 ° C.
  6. Dopo che la temperatura del agarosio disciolto è fino a 50 ° C, aggiungere 1 ml di tampone 50x alcalina, mescolare e poi versare il gel nel vassoio gel. Attendere che il gel di solidificare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  7. Aggiungere 4 ml di 0,5 M EDTA ai 20 ml di campione di DNA linearizzato e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
  8. Aggiungere 6x tampone di gel loading alcalina (300 mM NaOH, 6 mM EDTA, 18% (w / v) ad alto peso molecolare polisaccaride, 0,06% verde di bromocresolo in dH 2 O) per campioni e ad una scaletta DNA 1 kb.
    NOTA: E 'importante utilizzare 6x tampone di caricamento del gel alcalino, si prega di consultare la discussione.
  9. Caricare i campioni sul gel nella stanza fredda e correre durante la notte in un tampone alcalina 1x (12-16 ore) a 3,2 volt per cm. Una volta che i campioni sono entrati nel gel, posizionare una lastra di vetro sulla superficie del gel per evitare che galleggianti.
  10. Neutralizzare i campioni immergendo il gel in tampone di neutralizzazione [1 M Tris-Cl (pH 7,6), 1,5 M NaCl, 3 M acetato di sodio (pH 5,2)] per 45 min a temperatura ambiente.
  11. Macchia il gel per il DNA con 4 ml di 1% etidio bromuro (EtBr) in 50 ml di acqua per 1 ora a temperatura ambiente. Decolorare con acqua per 15 minuti. Visualizzare il DNA utilizzando un sistema di imaging.
    Attenzione: EtBr è un agente mutageno potente e può essere assorbito attraverso la pelle. Evitare il contatto diretto con EtBr.

2. Trasfezione e immunoprecipitazione di TFO diretti da plasmidi ICL contenenti in cellule umane

  1. Piastra 400.000 cellule di mammifero (ad esempio, U2OS Ocellule steosarcoma) per piatto di 60 millimetri in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) senza antibiotici 24 ore prima della trasfezione. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C con 5% di CO 2.
  2. Prima di trasfezione, mezzi di crescita caldo e tampone fosfato isotonico (PBS) a 37 ° C in un bagno d'acqua. Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente.
  3. Incubare 30 ml di reagente di trasfezione con 500 ml di terreni di crescita 1x (Mix 1) e 2 mg di TFO-diretti ICL contenenti plasmidi in 500 ml di 1x terreni di crescita (mix 2) in separati 14 ml provette con fondo arrotondato per 10 min a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere mix 1 a mescolare 2, mescolare bene pipettando su e giù. Incubare per 25-30 minuti a temperatura ambiente.
  5. Lavare le cellule due volte con PBS caldo. Aggiungere la miscela trasfezione in modo goccia a goccia distribuendo uniformemente tutta la piastra di cellule. Aggiungere 1 ml di terreni di crescita alla piastra e portare il volume finale a 2 ml. mescolare noill. Posizionare le piastre di coltura nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per 4 ore.
  6. Sostituire il supporto con i media da 3 ml crescita supplementato con 10% FBS e incubare ulteriormente per 16 ore. Non usare antibiotici.
  7. Trattare cellule con 80 ml di 37% di formaldeide fresco per piastra ad una concentrazione finale di circa 1% e incubare per 10 min a temperatura ambiente in assenza di luce.
    Attenzione: La formaldeide è tossica e deve essere maneggiato secondo le istruzioni di sicurezza. esposizione alla formaldeide può causare danni alla pelle, degli occhi e delle vie respiratorie.
  8. Quench formaldeide reticolazione aggiungendo 300 ml di glicina refrigerati (fornito nel kit disponibili in commercio) per piastra e incubando per 5 min. Rimuovere il supporto e lavare due volte con PBS freddo, e poi raccogliere le cellule raschiando in 1 ml freddo (4 ° C) PBS in una provetta. Mantenere i campioni in ghiaccio in ogni momento.
  9. Preparare pellet cellulari mediante centrifugazione a 4 ° C per 5 min at 13.400 xg con un tavolo refrigerata centrifuga. Pipettare il supernatante e posizionare il pellet di cellule in ghiaccio.
  10. Omogeneamente risospendere il pellet in 1 ml freddo (4 ° C) tampone A (in dotazione nel kit disponibili in commercio) e incubare in ghiaccio per 10 min. Mescolare di tanto in tanto invertendo il tubo. Cellule pellet come prima (vedi al punto 2.9).
  11. Omogeneamente risospendere il sedimento in 1 ml di freddo (C 4 °) Buffer B (in dotazione nel kit disponibili in commercio) e incubare in ghiaccio per 10 minuti con miscelazione occasionale invertendo. Cellule pellet per centrifugazione come prima (vedi sopra punto 2.9).
  12. Risospendere nuovamente le cellule in 200 microlitri refrigerati tampone B. Aggiungere 2 ml di micrococcica nucleasi (MNase) ed incubare a temperatura ambiente per 10 min. Mescolare di tanto in tanto la reazione muovendo il tubo. Arrestare la reazione MNase ponendo la provetta in ghiaccio e aggiunta di 40 mM EDTA. Cellule pellet come prima (vedi al punto 2.9).
  13. Risospendere le cellule in 100 microlitri 1x immunopr cromatinaecipitation tampone (chip) di buffer (in dotazione nel kit disponibili in commercio) integrato con cocktail inibitore della proteasi.
  14. Mettere le cellule risospese in una provetta per microcentrifuga a parete sottile. Sonicare i campioni da loro galleggia sull'acqua bagno sonicatore per 20 secondi seguita da 20 sec incubazione in ghiaccio. Ripetere i passaggi da sonicazione 9 volte per generare ~ 800-1.200 frammenti bp.
    1. A 20 ml di campioni sonicati aggiungere 3 ml 5 M NaCl e 1 ml RNasi A. Mescolare bene nel vortex e incubare a 37 ° C per 30 min. Successivamente, aggiungere 2 ml proteinasi K e incubare per 2 ore a 65 ° C. Purificare i campioni utilizzando un kit di purificazione PCR. Esegui campioni su 1% gel e visualizzare con EtBr.
      NOTA: Intensità massima del DNA risultante dovrebbe essere pari o inferiore a 1.000 bp.
  15. In tre tubi separati, aggiungere 30 ml di lisato in un tubo siliconato pre-raffreddata e quindi aggiungere 70 ml di tampone ChIP refrigerata 1x con inibitori della proteasi aggiunto. Aggiungere 1 μg di anti-immunoglobulina G (IgG), H3 anti-istone (come controllo positivo), o anti-HMGB1 alle rispettive provette. Incubare per una notte in una camera fredda con rotazione continua.
  16. perline risospendere proteina G in modo omogeneo nella cella frigorifera. Aggiungere 4 ml di proteine ​​G perline per provetta e incubare per un altro 2-4 ore in cella con rotazione.
  17. Utilizzando un sostegno magnetico, agglomerare le perline e rimuovere il surnatante. Aggiungere 200 microlitri 1x tampone ChIP mescolato con cocktail di inibitori delle proteasi al pellet e lavare per 5 min in cella con rotazione. Ripetere il lavaggio due volte.
  18. Eseguire un lavaggio supplementare con sale alta 1x chip di buffer (contenente 70 mM NaCl).
  19. Risospendere il pellet con tampone di eluizione 160 microlitri (fornita in kit disponibili in commercio) e incubare a 37 ° C con rotazione per 30 min.
  20. Agglomerare le perline e raccogliere il surnatante in una nuova provetta. Aggiungere 6 ml di 5 M NaCl e 2 ml di proteinasi K, e incubare una notte a 65° C.
  21. Purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione prodotto di PCR ed eluire il DNA utilizzando 50 ml dH 2 O.
  22. Eseguire la PCR 16 reazioni utilizzando set di primer alla regione (s) di interesse, e risolvere i prodotti su un gel di agarosio 1% colorato con EtBr.

3. superavvolgimento Assay e 2-dimensionale in Gel di Agarosio

  1. Preparare DNA tampone di sintesi di riparazione (45 mm Hepes-KOH, pH 7,8; 70 mm KCl; 7,4 mm MgCl 2; 0,9 mm DTT; 0,4 mm EDTA; 2 mM ATP, 20 mM dNTP, 3,4% glicerolo e 18 mg albumina sierica bovina) . Conservare a -80 ° C. Scongelare su ghiaccio e prima dell'uso aggiungere 40 mM fosfocreatina e 2,5 microgrammi creatinfosfochinasi.
  2. Preparare 10x tampone superavvolgimento [500 mm Tris (pH 8,0), 500 mM NaCl, 25 mM MgCl 2, 1 mM EDTA], e conservare a temperatura ambiente.
  3. Linearizzare 300 ng di DNA pSupFG1 plasmide supercoiled completamente con 1 ml Vaccinia topoisomerasi I (5-15 U / ml) con 1xtampone superavvolgimento in una reazione 10 ml. Incubare la miscela a 37 ° C per 1 ora.
  4. Scongelare HeLa cell-free estratto 24 sul ghiaccio. Per i plasmidi completamente rilassato, aggiungere 25 ml estratto cellulare HeLa e buffer di sintesi di riparazione del DNA. Mescolare bene. Aggiungere ulteriori 1 ml di vaccinico topoisomerasi I del mix, e incubare per 1 ora a 37 ° C.
  5. Terminate le reazioni aggiungendo sodio dodecil solfato (SDS) (1% concentrazione finale) e proteinasi K (0,25 mg / ml concentrazione finale). Incubare a 65 ° C per 2 ore.
  6. Cast un gel di agarosio 1% con 1x Tris Borato EDTA (TBE) buffer. Aggiungere DNA colorante carico e caricare le reazioni direttamente sul gel almeno 4 corsie a parte. Eseguire il gel per 8-10 ore a 2 V / cm a 1x TBE (dimensione 1) a temperatura ambiente per risolvere i topoisomero.
    NOTA: Preparare una soluzione madre 5x TBE in 1 L di dH 2 O con l'aggiunta di 54 g di Tris base. 27,5 g di acido borico e 20 ml di 0,5 M EDTA (pH 8,0).
  7. Preparare 2 L di 1xTBE con 3 mg / ml clorochina fosfato. Immergere il gel in 200 ml di questa soluzione per 20 min. Coprire il vassoio gel con un foglio di alluminio.
  8. Per elettroforesi il gel nella seconda dimensione, ruotare il gel 90 ° in senso orario ed eseguirlo per 4-6 ore a 2 V / cm in clorochina contenente 1x TBE per risolvere i supercoils positivi e negativi.
  9. Macchia gel con EtBr per 1 ora su una sedia a dondolo. Decolorare il gel con dH 2 O per 15 minuti e successivamente visualizzare la distribuzione termica dei topoisomero usando un imager.

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Risultati

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Formazione del ICL TFO-diretta è critica per la metodica plasmidi basati, che vengono utilizzati per interrogare i ruoli delle proteine ​​architettoniche nella lavorazione ICL in cellule umane. Denaturazione agarosio elettroforesi su gel è un modo facile per determinare l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto. I plasmidi che ospitano ICL TFO-diretti migrano con una mobilità più lenta attraverso la matrice gel (Figura 1A, corsia 3) se confrontato con i plasmidi di c...

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Discussione

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La formazione efficiente ICLs TFO-diretti dipende da due fattori fondamentali: in primo luogo, i componenti corretta tampone (per esempio, MgCl 2) e il tempo di incubazione del TFO con il suo substrato DNA bersaglio (dipende l'affinità di legame del TFO al suo obiettivo duplex, e le concentrazioni utilizzate); e in secondo luogo, la corretta dose di UVA (365 nm) irradiazione per formare legami crociati psoraleni efficiente. formazione triplex ottimale può essere ottenuto utilizzando HPLC o gel TF...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Vasquez per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 per KMV]; e la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas [RP101501]. Il finanziamento per la carica di accesso aperto: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 per KMV].

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5'HMT Psoralen-AG30Midland Certified Reagent Co., Midland, TXOrdine personalizzatoHPLC (o gel) purificato
Simple ChIP Kit IP per cromatina enzimaticaSegnalazione cellulare Inc.9003Il protocollo suggerito dal produttore è ottimizzato per l'IP della cromatina e non per l'IP del plasmide. Gli anticorpi IgG e H3 di controllo, nonché le perle di proteina G e la nucleasi micrococcica sono forniti dal produttore.
GoTaq GreenPromegaM7122PCR master mix
HMGB1 anticorpoAbcamAb18256
Wizard Gel e kit di pulizia PCRPromegaA9281
sale di clorochina-difosfatoSigmaC6628-50GPer elettroforesi bidimensionale su gel di agarosio
EcoRINew England BioLabsR0101S
Reagente di trasfezione GenePORTERGenlantisT201015
Vaccinia Topoisomerasi IInvitrogen38042-024
Lampada ultravioletta a onde lunghe Blak-RayUpland, CAB 100 APLampada UVA
EpiSonic Bioprocessore multifunzionale 1100EpigentekEQC-1100Sonicatore a bagnomaria
Filtro MylarGE Healthcare Life Sciences
AgarosioSigma-AldrichA6111
BIO-RAD ChemidocBIO-RADXRS+ sistemadi imaging del DNA
GlycineFisher ScientificBP381-500
37% FormaldeideSigma-AldrichF8775-25MLUtilizzato per la reticolazione 
Proteinasi KNew England BiolabsP8107S
DMEMThermoFisher11965092Terreni di coltura cellulare
PBSThermoFisher70013073Colture cellulari
Tripsina-EDTAThermoFisher25200056Colture cellulari
Verde di bromocresoloSigma-Aldrich114-359Colorante di caricamento del DNA
Provette siliconateFisher Scientific 02-681-320Provetta per microfuge a bassa ritenzione
Base TrisFisher ScientificBP152-1
Acido boricoFisher ScientificA74-1
EDTAFisher Scientific FotometroBP24731
InternationalLight TechnologiesILT1400-AMisurazione della dose UVA
Linee cellulari
Osteosarcoma umano U2OSATCC ATCCHTB-96Coltivato secondo il fornitore La raccomandazione
dell'adenocarcinoma cervicale umano HeLaATCCATCC-CCL-2Coltivato secondo il fornitore' s raccomandazione Primer
anteriore prossimale5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Primer inverso prossimale5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Primer anteriore distale5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Primer inverso distale5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc
80112939

Riferimenti

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