Il danno mirato al DNA può essere ottenuto legando un agente dannoso al DNA a un oligonucleotide (TFO) che forma un triplex. Utilizzando TFO modificati, l'associazione proteica specifica per il danno al DNA e la modifica della topologia del DNA possono essere studiate nelle cellule umane utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina modificata e saggi di superavvolgimento del DNA qui descritti.
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Articolo metodologico
Strumenti per studiare il ruolo di architettura HMGB1 proteine nella lavorazione di Helix deformante, DNA specifiche per sito interstrand Crosslinks
In questo articolo
Sommario
Abstract
casella di gruppo ad alta mobilità 1 proteine (HMGB1) è una proteina di architettura non-istone che è coinvolto nella regolazione di molte funzioni importanti nel genoma, come la trascrizione, la replicazione del DNA, e la riparazione del DNA. HMGB1 si lega al DNA strutturalmente distorto con maggiore affinità rispetto alla canonica B-DNA. Ad esempio, abbiamo scoperto che HMGB1 si lega al DNA interstrand legami crociati (ICL), che collegano covalentemente i due filamenti del DNA, causa la distorsione dell'elica, e se non riparati può causare la morte delle cellule. A causa della loro potenziale citotossico, diversi agenti ICL-inducono sono attualmente utilizzati come agenti chemioterapici in clinica. Mentre gli agenti ICL-formatura mostrano preferenze per alcune sequenze di base (ad esempio, 5'-TA-3 'è il sito di reticolazione preferito per psoraleni), che in gran parte inducono danni al DNA in modo indiscriminato. Tuttavia, covalentemente accoppiando l'agente ICL induce ad un oligonucleotide triplex-formatura (TFO), che si lega al DNA in una sequenza specificamodo, il danno al DNA mirato può essere raggiunto. Qui, usiamo un TFO covalente coniugata sulla 'fine a una 4'-idrossimetil-4,5' la 5 (HMT) psoralen, 8-trimethylpsoralen per generare un ICL site-specific su un plasmide mutazione giornalista da utilizzare come strumento di per studiare la modifica architettonica, trasformazione e riparazione delle lesioni del DNA complessi HMGB1 in cellule umane. Descriviamo tecniche sperimentali per preparare ICL TFO-dirette sui plasmidi reporter, e di interrogare l'associazione di HMGB1 con le ICL TFO-orientate in un contesto cellulare utilizzando saggi di immunoprecipitazione della cromatina. Inoltre, descriviamo saggi superavvolgimento DNA per valutare specifica modifica architettonica del DNA danneggiato misurando la quantità di giri superelica introdotte sul plasmide psoralen-reticolato da HMGB1. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare i ruoli di altre proteine coinvolte nella trasformazione e riparazione di ICL TFO-dirette o altri danni al DNA mirato in qualsiasi linea cellulare di interesse.
Introduzione
Triplex di formazione oligonucleotidi (TFOS) DNA legano duplex in modo specifico per la sequenza tramite incollaggio Hoogsteen-idrogeno per formare strutture a tripla elica 1-5. La tecnologia Triplex è stata usata per interrogare una varietà di meccanismi biomolecolari, come la trascrizione, il DNA riparazione dei danni, e gene targeting (rivisto in riferimenti 6-8). TFOS sono stati ampiamente utilizzati per indurre un danno site-specific su plasmidi reporter 9,10. Il nostro laboratorio e altri hanno utilizzato in precedenza un TFO, AG30, legato ad una molecola psoraleni per indurre site-specific legami crociati interstrand DNA (ICL) ....
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Protocollo
1. Preparazione di ICL TFO-dirette sui plasmidi Substrati
- Incubare quantità equimolari di plasmide pSupFG1 10,11 DNA (DNA plasmide 5 mg è un buon punto di partenza) con psoraleni coniugato TFO AG30 in 8 ml di triplex tampone di legame [50% glicerolo, 10 mM Tris (pH 7,6), 10 mM MgCl 2] e dH 2 O ad un volume finale di 40 microlitri in un tubo ambra. Mescolare accuratamente pipettando su e giù. Incubare la reazione a 37 ° C bagnomaria per 12 ore.
- Riscaldare la lampada UVA per garantire la piena potenza. Posizionare la reazione triplex su pellicola di paraffina, e posizionare il film di paraffina sul ghiaccio sotto la....
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Risultati
Formazione del ICL TFO-diretta è critica per la metodica plasmidi basati, che vengono utilizzati per interrogare i ruoli delle proteine architettoniche nella lavorazione ICL in cellule umane. Denaturazione agarosio elettroforesi su gel è un modo facile per determinare l'efficienza della formazione ICL TFO-diretto. I plasmidi che ospitano ICL TFO-diretti migrano con una mobilità più lenta attraverso la matrice gel (Figura 1A, corsia 3) se confrontato con i plasmidi .......
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Discussione
La formazione efficiente ICLs TFO-diretti dipende da due fattori fondamentali: in primo luogo, i componenti corretta tampone (per esempio, MgCl 2) e il tempo di incubazione del TFO con il suo substrato DNA bersaglio (dipende l'affinità di legame del TFO al suo obiettivo duplex, e le concentrazioni utilizzate); e in secondo luogo, la corretta dose di UVA (365 nm) irradiazione per formare legami crociati psoraleni efficiente. formazione triplex ottimale può essere ottenuto utilizzando HPLC o gel TF.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Vasquez per le discussioni utili. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA097175, CA093279 per KMV]; e la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas [RP101501]. Il finanziamento per la carica di accesso aperto: National Institutes of Health / National Cancer Institute [CA093279 per KMV].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5'HMT Psoralen-AG30 | Midland Certified Reagent Co., Midland, TX | Ordine personalizzato | HPLC (o gel) purificato |
| Simple ChIP Kit IP per cromatina enzimatica | Segnalazione cellulare Inc. | 9003 | Il protocollo suggerito dal produttore è ottimizzato per l'IP della cromatina e non per l'IP del plasmide. Gli anticorpi IgG e H3 di controllo, nonché le perle di proteina G e la nucleasi micrococcica sono forniti dal produttore. |
| GoTaq Green | Promega | M7122 | PCR master mix |
| HMGB1 anticorpo | Abcam | Ab18256 | |
| Wizard Gel e kit di pulizia PCR | Promega | A9281 | |
| sale di clorochina-difosfato | Sigma | C6628-50G | Per elettroforesi bidimensionale su gel di agarosio |
| EcoRI | New England BioLabs | R0101S | |
| Reagente di trasfezione GenePORTER | Genlantis | T201015 | |
| Vaccinia Topoisomerasi I | Invitrogen | 38042-024 | |
| Lampada ultravioletta a onde lunghe Blak-Ray | Upland, CA | B 100 AP | Lampada UVA |
| EpiSonic Bioprocessore multifunzionale 1100 | Epigentek | EQC-1100 | Sonicatore a bagnomaria |
| Filtro Mylar | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A6111 | |
| BIO-RAD Chemidoc | BIO-RAD | XRS+ sistema | di imaging del DNA |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-500 | |
| 37% Formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775-25ML | Utilizzato per la reticolazione |
| Proteinasi K | New England Biolabs | P8107S | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965092 | Terreni di coltura cellulare |
| PBS | ThermoFisher | 70013073 | Colture cellulari |
| Tripsina-EDTA | ThermoFisher | 25200056 | Colture cellulari |
| Verde di bromocresolo | Sigma-Aldrich | 114-359 | Colorante di caricamento del DNA |
| Provette siliconate | Fisher Scientific | 02-681-320 | Provetta per microfuge a bassa ritenzione |
| Base Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Acido borico | Fisher Scientific | A74-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific Fotometro | BP24731 | |
| InternationalLight Technologies | ILT1400-A | Misurazione della dose UVA | |
| Linee cellulari | |||
| Osteosarcoma umano U2OS | ATCC ATCC | HTB-96 | Coltivato secondo il fornitore La raccomandazione |
| dell'adenocarcinoma cervicale umano HeLa | ATCC | ATCC-CCL-2 | Coltivato secondo il fornitore' s raccomandazione Primer |
| anteriore prossimale | 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac | ||
| Primer inverso prossimale | 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg | ||
| Primer anteriore distale | 5′-aat acc gcg cca cat agc ag | ||
| Primer inverso distale | 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc |
Riferimenti
- Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
- Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses tran....
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Ristampe e permessi
