l'occlusione chirurgica di un ramo distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) è un modello di uso frequente nella ricerca ictus sperimentale. Questo manoscritto descrive la tecnica base di MCAO permanente, combinata con l'inserimento di una finestra cranica laterale, che offre la possibilità di longitudinale microscopia intravitale nei topi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Laterale cronica cranica finestra Preparazione Attiva In Vivo Condizioni seguito distale Medio occlusione dell'arteria cerebrale nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ischemia cerebrale focale (cioè, ictus ischemico) può causare gravi lesioni cerebrali, portando ad una grave perdita della funzione neuronale e di conseguenza ad una serie di motore e disabilità cognitive. La sua alta prevalenza pone un grave onere di salute, come l'ictus è tra le principali cause di disabilità a lungo termine e morte nel mondo 1. Recupero della funzione neuronale è, nella maggior parte dei casi, solo parziale. Finora, le opzioni di trattamento sono molto limitate, in particolare a causa della finestra temporale ristretta per la trombolisi 2,3. Che determina i metodi per accelerare il recupero da ictus rimane un obiettivo medico prime; tuttavia, questo è stato ostacolato dalla insufficienti intuizioni meccanicistici nel processo di recupero. ricercatori ictus sperimentali utilizzano spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. Al di là della fase acuta, la ricerca corsa è sempre più focalizzata sulla fase sub-acuta e cronica dopo ischemia cerebrale. applicare la maggior parte dei ricercatori ictus permanente o tranl'occlusione sient del MCA nei topi o ratti. Nei pazienti, occlusioni di MCA sono tra le più frequenti cause di ictus ischemico 4. Oltre l'occlusione prossimale del MCA utilizzando il modello filamento, l'occlusione chirurgica del distale MCA è probabilmente il modello più utilizzato nella ricerca ictus sperimentale 5. L'occlusione di un distale (la ramificazione delle arterie lenticulo-striate) ramo MCA risparmia tipicamente striato e colpisce soprattutto la neocorteccia. Vessel l'occlusione può essere permanente o transitorio. Alta ripetibilità volume lesione e mortalità molto bassi rispetto al risultato a lungo termine sono i principali vantaggi di questo modello. Qui, dimostriamo come eseguire una cronica finestra del cranio (CW) la preparazione lateralmente al seno sagittale, e poi come chirurgicamente indurre un ictus distale sotto la finestra utilizzando un approccio craniotomia. Questo approccio può essere applicato per l'imaging sequenziale di alterazioni acute e croniche seguente ischemia viaepi-illuminante, confocale a scansione laser, e due fotoni microscopia intravitale.
Introduzione
L'ictus è tra le principali cause di disabilità e morte a lungo termine in tutto il mondo1, al secondo posto dopo la malattia coronarica. Inoltre, l'ictus è la causa principale della disabilità a lungo termine, sottolineando il suo enorme impatto socioeconomico6-8. Al di là del trattamento acuto, lo studio di nuovi approcci e meccanismi per accelerare e migliorare il recupero dopo l'ictus rimane un obiettivo medico primario7.
Negli ultimi decenni, i dati della ricerca sperimentale sull'ictus hanno contribuito in modo sostanziale alla comprensione delle complesse cascate fisiopatologiche innescate dall'ischemia9,10. L'eccitotossicità, l'apoptosi, la depolarizzazione peri-infartuale e l'infiammazione sono stati identificati come i mediatori più rilevanti della morte cellulare a seguito di ischemia cerebrale focale. Inoltre, utilizzando modelli animali di ischemia cerebrale, sono stati sviluppati e validati importanti concetti, modalità diagnostiche e approcci terapeutici (ad esempio, "penombra" e trombolisi)11.
La disponibilità di modelli sperimentali di ictus, combinata con modalità di imaging non invasive (ad esempio, risonanza magnetica (MRI), tomografia computerizzata o analisi laser speckle contrast analysis), consente al ricercatore di indagare i cambiamenti fisiopatologici iperacuti e cronici indotti dall'insulto ischemico in modo longitudinale12. Oltre a studiare il profilo spazio-temporale della lesione in evoluzione, è possibile studiare i cambiamenti che assomigliano alla plasticità neuronale e correlarli agli esiti funzionali e ai risultati istologici. Negli ultimi anni, sono stati compiuti ulteriori progressi metodologici utilizzando la combinazione di modelli di ischemia cerebrale e microscopia in vivo tramite finestre craniche13. Queste nuove tecniche consentono ai ricercatori di analizzare l'unità neurovascolare a livello cellulare e molecolare, con grande potenza analitica nelle fasi acuta, subacuta e cronica successive all'ischemia cerebrale focale14. Inoltre, l'imaging al microscopio in vivo della dinamica microcircolatoria ha rivelato nuovi aspetti della funzione microvascolare cerebrale e dell'angioarchitettura, con una significativa rilevanza fisiopatologica15-17.
In questo protocollo, presentiamo come eseguire una preparazione cronica di CW lateralmente al seno sagittale e come indurre chirurgicamente un ictus distale sotto la finestra. Questo modello murino può essere applicato all'imaging sequenziale di cambiamenti acuti, subacuti e cronici a seguito di ischemia cerebrale focale tramite epi-illuminazione, scansione laser confocale e microscopia intravitale a due fotoni.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
ETICA DICHIARAZIONE: Gli esperimenti che coinvolgono soggetti animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla Landesamt fuer Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania (G0298 / 13) ei criteri arrivano, a seconda dei casi. Per questo studio, 10 a 12 settimane di età maschi C57Bl / 6J sono stati utilizzati.
1. laterale cronica cranica finestra Preparazione
- Eseguire anestesia con una iniezione sottocutanea di ketamina (90 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). Test per la sedazione adeguata con uno stimolo dolore.
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici e campo chirurgico con il 70% di etanolo.
- Rimuovere il cuoio capelluto dal collo agli occhi con un rasoio roditore.
- Fissare la testa in un frame stereotassico.
- Utilizzare Dexpantenolo pomata occhio su entrambi gli occhi per evitare la disidratazione.
- Pulire l'area chirurgica per rimuovere tutti i peli e sterilizzare con 3 strati di 74,1% di etanolo e 10% 2-propanololo.
- Eseguire un linea medianaincisione dal collo agli occhi utilizzando un bisturi.
- Coprono l'lembo cutaneo con 4 punti di sutura in tenda.
- Rimuovere il periostio attentamente l'emisfero sinistro raschiando via con un bisturi al punto in cui inizia il muscolo temporale.
NOTA: Questa preparazione serve anche per creare una buona zona adesione per la colla dentale, che fissa il vetro di copertura. - Eseguire una craniotomia fronto-parietale con un diametro di 4 mm da diradamento cranio sul bordo del lembo osseo utilizzando un microtrapano. Applicare la soluzione salina durante la perforazione per evitare lesioni di calore.
- Elevare il lembo osseo con cannule e rimuoverlo con microforceps.
- Irrigare accuratamente e ampiamente con soluzione fisiologica.
- Mescolare la colla dentale fino ha la consistenza adeguata e non è fluido (cioè, la colla deve produrre fili più). Posizionarlo sul tessuto osseo intorno alla craniotomia.
- Posizionare un vetro di copertura con un diametro di 6 mm sulla colla preparata e fissarlo con the resto della colla dentale. Assicurarsi che sia a tenuta stagna. Attendere che la colla viene essiccato e duro provandola con una pinza.
NOTA: L'irrigazione ulteriore accelera il processo di polimerizzazione. - Rimuovere i punti di sutura in tenda e chiudere la ferita con punti di sutura della pelle.
- Tirare la pelle del fianco del mouse. Inserire una via sottocutanea ago e sostituire delicatamente 0,5 ml di sterile per via sottocutanea salina per l'equilibrio dei fluidi.
- Dopo l'intervento chirurgico, tenere gli animali in gabbia recupero riscaldato per 90 min. Attendere fino a quando gli animali sono completamente sveglio prima di lasciare incustoditi. Attendere fino a quando gli animali sono completamente recuperati prima di tornare in una gabbia con altri animali.
- Ripetere la sostituzione del volume di soluzione salina per via sottocutanea dopo circa 12 ore, come descritto al punto 1.16.
- Sempre applicare analgesia mediante sonda gastrica o direttamente nella cavità orale dopo l'intervento (ad esempio, paracetamolo (10 mg / ml) o altri farmaci anti-infiammatori non steroidei).
- Controlla il condizioni degli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico, e sempre forniscono schiacciate cibo animale sul pavimento in una piastra di Petri per fare mangiare semplice e per evitare la perdita di peso dopo l'intervento critico.
NOTA: microscopia intravitale può essere effettuata sul primo giorno dopo la preparazione finestra del cranio. - Applicare isoflurano anestesia e fissare l'animale in un supporto testa. Aprire la sutura della pelle e pulire la finestra con bastoncini di cotone e soluzione salina sterile. Dopo 24 ore, la finestra del cranio deve essere riempito con liquido cerebrospinale da quel punto di tempo, che permette l'imaging. Eseguire l'imaging utilizzando protocolli di microscopia stabiliti 18.
2. distale MCAO
NOTA: La procedura MCAO deve essere eseguita su 5 d dopo la preparazione CW. Ciò minimizza l'interferenza dalla reazione immunitaria causata dalla preparazione CW con la reazione immunitaria ictus indotta.
"Src =" / files / ftp_upload / 54701 / 54701fig1.jpg "/>
Figura 1. Panoramica distale MCAO. R. Questa è una bella panoramica sui vasi prima della op. B. I vasi dopo il primo contatto bipolare. C. I vasi dopo secondo contatto bipolare. D. La panoramica sui vasi, che sono completamente chiuse oggi. E. panoramica finale con ingrandimento minore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Anestetizzare il topo, utilizzando una maschera di anestesia e un regime anestetico adeguato, in consultazione con il personale veterinario (ad esempio, induzione con 1,5-2% isoflurano e manutenzione con 1,0-1,5% isoflurano in 2/3 N 2 O e 1/3 O 2 via un vaporizzatore).
- Shave e rimuovere i capelli e disinfettare la pelle e pelliccia circostante con un agente appropriato (ad esempio, il 70% di alcol etilico), e asciugare dopo.
- Mantenere la temperatura corporea dei topi a 36,5 ° C ± 0,5 ° C durante l'intervento chirurgico. Una piastra elettrica risposte controllato, riscaldato secondo la temperatura rettale del mouse, è altamente raccomandato.
- Posto l'animale in posizione laterale. Fissare il naso nella maschera anestesia e regolare la concentrazione isoflurano a 1,0 - 1,5%.
- Applicare una pomata bagnato (Dexpantenolo) per entrambi gli occhi.
- Utilizzare l'incisione cutanea fatta per la preparazione CW.
- Delicatamente separare la pelle e identificare il muscolo temporale sottostante.
- Regolare l'energia del generatore ad alta frequenza (5 - 7 W) e usare la modalità bipolare.
- Utilizzare le pinze elettrocoagulazione e rimuovere con attenzione il muscolo temporale dal cranio, la creazione di un lembo di muscolo, senza rimuovere completamente il muscolo.
- Identificare la MCA sotto il cranio trasparente nella parte rostrale della zona temporale, dorsale per la retro-orbital seno. Se la biforcazione MCA non può essere identificato, cercare di identificare la nave più rostrale.
- Sottile il teschio sopra il ramo MCA con un microtrapano mentre continua irrigazione per evitare danni dovuti al calore.
- Sollevare l'osso con cannule e rimuoverlo con microforceps.
- Diminuire l'energia del generatore ad alta frequenza 3 - 5 W.
- Avvicinatevi l'arteria dall'alto e toccare delicatamente con le pinze bipolari su entrambi i lati senza sollevare la nave.
- Coagulare dell'arteria prossimale e distale alla biforcazione nave.
- Attendere 30 sec, quindi toccare delicatamente l'arteria per garantire che il flusso di sangue è permanentemente interrotta. Ripetere l'elettrocoagulazione, se si osserva una ricanalizzazione.
- Fissare il muscolo temporale di 1 o 2 punti all'inserzione muscolare per coprire il difetto osseo, se possibile.
- Suturare la ferita e posizionare l'animale nella casella di recupero riscaldato. In generale, il recupero animali subito dopo Anest volatilihesia.
- Per la sostituzione del volume, applicano 0,5 ml di soluzione sterile salina per via sottocutanea, come descritto al punto 1.16.
- Dopo l'intervento chirurgico, consentono agli animali di rimanere nella gabbia di recupero riscaldato per 90 min. Attendere fino a quando gli animali sono coscienti prima di lasciare incustoditi. restituirli solo a una gabbia con altri animali quando sono completamente recuperati.
- Ripetere la sostituzione del volume, come spiegato al punto 1.16, dopo 12 ore.
- Applicare l'analgesia postoperatoria con acqua potabile (ad esempio, il paracetamolo (10 mg / ml) o altri farmaci anti-infiammatori non steroidei).
- Controllare la condizione medica degli animali ogni giorno dopo l'intervento chirurgico. Fornire cibo animale schiacciato in una piastra di Petri sul pavimento per semplificare mangiare e per ridurre al minimo la perdita di peso post-operatorio.
3. Trattamento Sham
- Eseguire tutte le procedure in modo identico ai punti 1 e 2, sopra descritti, tra cui la preparazione CW, tranne non coagulare il ar cerebrale media espostobatteria.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La linea temporale e risultati rappresentativi sono mostrati nelle figure 2 e 3. La preparazione finestra del cranio, con una piccola finestra laterale cranica al seno longitudinale superiore (Figura 2 B, C, D) comporta un basso tasso di mortalità e morbilità quando eseguita da un chirurgo esperto. Tutti i 10 animali sopravvissuti, e tutto CW cronico potrebbe essere utilizzato per l'imaging di alta qualità, anche 28 giorni dopo l'interve...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
L'ictus è tra le principali cause di disabilità a lungo termine e morte nel mondo 1. Al di là di trattamento acuto, indagare nuovi approcci e meccanismi per accelerare e migliorare il recupero dopo l'ictus rimane un obiettivo medica primaria 7. ricercatori ictus sperimentali utilizzano spesso modelli di roditori di ischemia cerebrale focale. Infatti, modelli inducono transitoria o permanente MCAO imitano uno dei tipi più comuni di ischemia cerebrale focale in pazienti 4. Oltre l&...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
VP partecipa al Programma Charité Clinical Scientist, finanziato dalla Charité - Universitätsmedizin Berlin e dall'Istituto di Salute di Berlino. TB è un borsista di mobilità post-dottorato del FNS. Gli autori ricevono sovvenzioni da EinsteinStiftung/A-2012-153 a PV.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio chirurgico binoculare | Zeiss | Stemi 2000 C | |
| Sorgente luminosa per microscopio | Zeiss | CL 6000 LED | |
| Piastra riscaldante con sonda rettale | FST | 21061-10 | |
| Telaio stereotassico | Kopf | Modello 930 | |
| Sistema di anestesia per isoflurano | Draeger | ||
| Isoflurano | Pinza Abott | ||
| Dumont #5 | FST | 11251-10 | |
| Pinza Dumont #7 | FST | 11271-30 | |
| Pinza bipolare | Erbe | 20195-501 | |
| Pinza bipolare | Erbe 20195-022 | ||
| Microtrapano | FST 18000-17 | ||
| Porta aghi | FST | 12010-14 | |
| 5-0 sutura di seta | Feuerstein, | ||
| 7-0 | Feuerstein, | ||
| 8-0 | Feuerstein, Suprama | ||
| Camera di recupero veterinaria | Peco Services | V1200 |
Riferimenti
- Mukherjee, D., Patil, C. G. Epidemiology and the global burden of stroke. World Neurosurg. 76 (6), Suppl 85-90 (2011).
- Ebinger, M., Prüss, H., et al. Effect of the use of ambulance-based thrombolysis on time to thrombolysis in acute ischemic stroke: a randomized clinical trial. JAMA. 311 (16), 1622-1631 (2014).
- Ebinger, M., Lindenlaub, S., et al. Prehospital thrombolysis: a manual from Berlin. J vis Exp. (81), e50534(2013).
- Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne Stroke Registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model. J Vis Exp. (47), (2011).
- Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
- Meairs, S., Wahlgren, N., et al. Stroke research priorities for the next decade--A representative view of the European scientific community. Cerebrovasc Dis. 22 (2-3), 75-82 (2006).
- Rosamond, W., Flegal, K., et al. Heart disease and stroke statistics--2007 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 115 (5), 69-171 (2007).
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The science of stroke: mechanisms in search of treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22 (9), 391-397 (1999).
- Dirnagl, U., Endres, M. Found in Translation: Preclinical Stroke Research Predicts Human Pathophysiology, Clinical Phenotypes, and Therapeutic Outcomes. Stroke. , (2014).
- Prinz, V., Hetzer, A. -M., et al. MRI heralds secondary nigral lesion after brain ischemia in mice: a secondary time window for neuroprotection. J Cereb Blood Flow Metab. , (2015).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. (61), (2012).
- Holtmaat, A., Bonhoeffer, T., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Iadecola, C., Dirnagl, U. The microcircualtion--fantastic voyage: introduction. Stroke. 44 (6), Suppl 1 83(2013).
- Blinder, P., Tsai, P. S., Kaufhold, J. P., Knutsen, P. M., Suhl, H., Kleinfeld, D. The cortical angiome: an interconnected vascular network with noncolumnar patterns of blood flow. Nat Neurosc. 16 (7), 889-897 (2013).
- Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Drew, P. J., Nishimura, N., Schaffer, C. B., Kleinfeld, D. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Cabrales, P., Carvalho, L. J. M. Intravital microscopy of the mouse brain microcirculation using a closed cranial window. J Vis Exp. (45), (2010).
- Rosell, A., Agin, V., et al. Distal occlusion of the middle cerebral artery in mice: are we ready to assess long-term functional outcome. Transl Stroke Res. 4 (3), 297-307 (2013).
- Dorand, R. D., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3 (2), (2014).
- Balkaya, M., et al. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (3), 330-338 (2013).
- Balkaya, M., Kröber, J., Gertz, K., Peruzzaro, S., Endres, M. Characterization of long-term functional outcome in a murine model of mild brain ischemia. J Neurosci Methods. 213 (2), 179-187 (2013).
- Freret, T., Bouet, V., et al. Behavioral deficits after distal focal cerebral ischemia in mice: Usefulness of adhesive removal test. Beh Neurosci. 123 (1), 224-230 (2009).
- Liu, S., Zhen, G., Meloni, B. P., Campbell, K., Winn, H. R. RODENT STROKE MODEL GUIDELINES FOR PRECLINICAL STROKE TRIALS (1ST EDITION). J Exp Stroke Trans Med. 2 (2), 2-27 (2009).
- Florian, B., Vintilescu, R., et al. Long-term hypothermia reduces infarct volume in aged rats after focal ischemia. Neurosci Lett. 438 (2), 180-185 (2008).
- Noor, R., Wang, C. X., Shuaib, A. Effects of hyperthermia on infarct volume in focal embolic model of cerebral ischemia in rats. Neurosci Lett. 349 (2), 130-132 (2003).
- Barber, P. A., Hoyte, L., Colbourne, F., Buchan, A. M. Temperature-regulated model of focal ischemia in the mouse: a study with histopathological and behavioral outcomes. Stroke. 35 (7), 1720-1725 (2004).
- Shin, H. K., Nishimura, M., et al. Mild induced hypertension improves blood flow and oxygen metabolism in transient focal cerebral ischemia. Stroke. 39 (5), 1548-1555 (2008).
- Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism. Neuroreport. 13 (11), 1431-1435 (2002).
- Gertz, K., Priller, J., et al. Physical activity improves long-term stroke outcome via endothelial nitric oxide synthase-dependent augmentation of neovascularization and cerebral blood flow. Circ Res. 99 (10), 1132-1140 (2006).
- Dirnagl, U. Bench to bedside: the quest for quality in experimental stroke research. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (12), 1465-1478 (2006).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
