Le sostanze otticamente controllate sono strumenti potenti per studiare le vie di segnalazione. Per ampliare lo spettro dei possibili esperimenti, abbiamo sviluppato un dispositivo per lo studio di sostanze otticamente controllate in tempo reale utilizzando la citometria a flusso: il LED Thermo Flow.
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Articolo metodologico
Thermo flusso LED - La combinazione Optogenetics con citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli strumenti optogenetici consentono indagini isolate e funzionali di quasi tutte le molecole di segnalazione all'interno di complesse vie di segnalazione. Uno dei principali ostacoli è l'erogazione controllata di luce al campione di cellule e quindi gli strumenti più popolari per gli studi optogenetici sono le analisi cellulari basate sulla microscopia e gli esperimenti in vitro. Il citometro a flusso presenta importanti vantaggi rispetto a un microscopio, tra cui la capacità di misurare rapidamente migliaia di cellule con risoluzione di una singola cellula. Tuttavia, non è ancora ampiamente utilizzato in optogenetica. Qui presentiamo un dispositivo che combina la potenza dell'optogenetica e della citometria a flusso: il LED Thermo Flow. Questo dispositivo illumina le cellule a lunghezze d'onda, intensità luminose e temperature specifiche durante le misure citofluorimetriche. Può essere costruito a basso costo ed essere utilizzato con i citometri a flusso più comuni. Per dimostrarne l'utilità, abbiamo caratterizzato la cinetica di fotocommutazione delle proteine Dronpa in vivo e in tempo reale. Questo protocollo può essere adattato a quasi tutte le sostanze controllate otticamente e amplia sostanzialmente l'insieme dei possibili esperimenti. Ancora più importante, semplificherà notevolmente la scoperta e lo sviluppo di nuovi strumenti optogenetici.
Introduzione
Strumenti optogenetic stanno guadagnando popolarità, in parte perché possono essere utilizzati per decifrare il cablaggio delle vie di segnalazione 1-4. Essi si basano sulla capacità delle proteine fotoattivabile di cambiare la loro conformazione e affinità di legame quando illuminato con luce. Fondendo queste proteine ad elementi di segnalazione consente la normativa specifica di un singolo giocatore all'interno di complesse vie di segnalazione intracellulare 5-12. Di conseguenza, un percorso di segnalazione può essere studiato con alta risoluzione temporale e spaziale.
La maggior parte degli studi optogenetic....
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Protocollo
1. Progettare e costruire il dispositivo
- esperimenti pilota
NOTA: L'intensità luminosa necessaria per uno specifico strumento e delle cellule di tipo optogenetic può variare in modo significativo. Esperimenti pilota con prototipi sono utili per stimare l'intensità luminosa minima necessaria. Lo strumento optogenetic utilizzato per i seguenti esperimenti è una fusione costrutto Dronpa-Linker-Dronpa. La sequenza è stata Dronpa commercialmente ottenuto (vedere elenco dei materiali). Un lungo linker è stato clonato tra due sequenze Dronpa per consentire il costrutto espresso per formare dimeri intramolecolari (e intermolecolari)....
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Risultati
Utilizzando il flusso Thermo LED con un citometro di flusso
Il nucleo funzionale del dispositivo è una camera cilindrica in cui LED sono disposti in modo circolare che punta verso l'interno. Questa camera può essere collegato alla rete idrica e la pompa, che consente il controllo della temperatura dei LED, così come il campione cellulare. I LED sono collegati ad un trasformatore e quindi l'intensità luminosa per ogni lunghezza d.......
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Discussione
La Thermo flusso LED è un dispositivo innovativo per studiare strumenti optogenetic in un citometro di flusso.
Finora, i campioni sono stati optogenetic illuminata solo con i laser microscopia o dispositivi torcia elettrica 11,12. A seconda dell'angolo e della distanza della torcia al campione, sostanziale variabilità nella quantità di illuminazione è previsto tra esperimenti. Inoltre, vi è un limite al numero di torce una singola persona può operare in un esperimento. Questo .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Ringraziamo J. Schmidt dell'Università di Friburgo per aver costruito il dispositivo. Ringraziamo P. Nielsen e D. Medgyesi per il loro sostegno e la lettura critica di questo manoscritto. Questo studio è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft attraverso SFB746 e dall'Excellence Initiative della German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tubo FACS in vetro | Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA | 14-961-26 | Tubi in vetro borosilicato 12x75 mm |
| Citometro a flusso | BD Bioscienceg; Heidelberg, Germania | Ordine speciale Fortessa II | |
| Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N | Addgene; Cambridge, Stati Uniti | 41645 | |
| PolyJet | SignaGen, Rockville, Stati Uniti | SL100688 | |
| LED 505 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germania | HLMP-CE34-Y1CDD | |
| LED 400 nm | Avago Technologies; Boeblingen, Germania | UV5TZ-400-15 | |
| Tubo in plexiglas 15 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 76999 | |
| Plexiglas 3 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 692230 | |
| Plexiglas 2,5 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 692225 | |
| Plexiglas 1,5 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 692215 | |
| Piastrella in PVC 5 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 690020.005 | |
| Piastrella in PVC 6 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 690020.006 | |
| Blocco PVC 50 mm | Maertin; Friburgo, Germania | 690020.050 | |
| RPMI | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germania | 61870-010 | |
| 2-Mercaptoetanolo | EMD; Germania | 805740 | |
| FCS | PAN Biotech; Aidenbach, Germania | P30-3302 | |
| Penicillina/Strptomicina (10.000 U/mL) | Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germania | 15140-122 | |
| Colla per plexiglas Acrifix | Evonic industries, Essen, Germania | 1R0192 | |
| Colla Tangit PVC-U | Henkel, Dü sseldorf, Germania |
Riferimenti
- Dugue, G. P., Akemann, W., Knopfel, T. A comprehensive concept of optogenetics. Prog Brain Res. 196, 1-28 (2012).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 551-558 (2014).
- Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Wein....
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Ristampe e permessi
