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Summary

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

Abstract

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

Introduction

Strumenti optogenetic stanno guadagnando popolarità, in parte perché possono essere utilizzati per decifrare il cablaggio delle vie di segnalazione ^1-4. Essi si basano sulla capacità delle proteine ​​fotoattivabile di cambiare la loro conformazione e affinità di legame quando illuminato con luce. Fondendo queste proteine ad elementi di segnalazione consente la normativa specifica di un singolo giocatore all'interno di complesse vie di segnalazione intracellulare ^5-12. Di conseguenza, un percorso di segnalazione può essere studiato con alta risoluzione temporale e spaziale.

La maggior parte degli studi optogenetic basati su celle utilizzano metodi di microscopia a base combinati con coltura in presenza di luce, seguita da analisi biochimiche ^11,12. Al contrario, un flusso singolarizza citometro celle lungo un capillare e misura la dimensione della cella, granularità e intensità di fluorescenza. Questo metodo ha importanti vantaggi rispetto microscopia o biochimici metodi, tra cui la capacità di analizzare thousands di cellule alla risoluzione di una singola cellula vivente in un tempo molto breve. Quindi, è desiderabile combinare optogenetics con citometria di flusso.

A nostra conoscenza, non vi è alcun protocollo stabilito per citometria a flusso optogenetic. Una procedura largamente accettata è di illuminare manualmente le cellule da fuori tubo di reazione con i dispositivi torcia elettrica. Tuttavia, illuminazione manuale nel flusso richiede citometro alla luce di passare attraverso il tubo di reazione e, per l'imaging cellulare dal vivo, cilindrica, camera di acqua riscaldata. Ciò causa sostanziale dispersione della luce e la perdita di luce. Inoltre, l'intensità della luce fornita da illuminazione manuale non è riproducibile tra esperimenti (angolo, distanza, ecc) e vi è un limite pratico al numero di lunghezze d'onda in un esperimento.

Con la costruzione del dispositivo Thermo flusso LED, siamo stati in grado di superare questi limiti. Con questo dispositivo, le cellule possono essere illuminati con specifiche lunghezze d'onda in una temperaturaerature controllato modo durante le misure di citometria a flusso. Questo permette di quantità precise e riproducibili di luce all'interno e tra esperimenti.

Per dimostrare l'utilità del nostro dispositivo in vivo, abbiamo registrato il segnale di fluorescenza di Dronpa nelle cellule Ramos B durante photoswitching. le cellule Ramos B sono derivati ​​da un linfoma di Burkitt umana. Dronpa è una proteina fluorescente che esiste come monomero, dimero o tetramero. Nella sua forma monomerica, è non fluorescente. Illuminazione con 400 nm luce induce dimerizzazione e tetramerizzazione e rende fluorescente proteina Dronpa. Questo processo può essere invertito illuminazione con 500 luce nm. La proteina Dronpa è stato usato per controllare la funzione e la posizione di segnalazione proteine ^4,13.

Qui, abbiamo espresso una proteina Dronpa-Linker-Dronpa nelle cellule Ramos B per studiare photoswitching di Dronpa in un citofluorimetro. Utilizzando il nostro dispositivo, siamo stati in grado di efficienza eFOTOINTERRUTTORE riproducibile Dronpa durante la registrazione la sua intensità di fluorescenza in tempo reale. Questo metodo fornisce vantaggi sostanziali rispetto protocolli illuminazione attuale con illuminazione manuale e amplia notevolmente il repertorio sperimentale per strumenti optogenetic e composti gabbia. Utilizzando il nostro dispositivo semplificherà e accelerare la scoperta e lo sviluppo di strumenti innovativi optogenetic in modo significativo.

Protocol

1. Progettare e costruire il dispositivo

1. esperimenti pilota
   NOTA: L'intensità luminosa necessaria per uno specifico strumento e delle cellule di tipo optogenetic può variare in modo significativo. Esperimenti pilota con prototipi sono utili per stimare l'intensità luminosa minima necessaria. Lo strumento optogenetic utilizzato per i seguenti esperimenti è una fusione costrutto Dronpa-Linker-Dronpa. La sequenza è stata Dronpa commercialmente ottenuto (vedere elenco dei materiali). Un lungo linker è stato clonato tra due sequenze Dronpa per consentire il costrutto espresso per formare dimeri intramolecolari (e intermolecolari). I passi descritti di seguito possono essere adattati a molti altri strumenti optogenetic o sostanze otticamente controllate.
   1. Trasdurre linfociti B Ramos con un Dronpa-Linker-Dronpa contenente costrutto seguendo le istruzioni del produttore per la trasduzione usando il surnatante retrovirale contenente da cellule di imballaggio. Harvest e le cellule di conteggio secondo un preprecedentemente pubblicato protocollo ^13.
   2. Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 x 10 ⁶ / ml in mezzo (RPMI 1640, 10% FCS inattivato al calore, 2 mM L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 U / mL di streptomicina, e 50 mM 2-mercaptoetanolo) e trasferirli ad un tubo di vetro FACS.
   3. Inserire il tubo in un citofluorimetro e misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa (canale GFP) ^14,15.
   4. Indossare occhiali di protezione per tutte le ulteriori passi per proteggere gli occhi da lunghezze d'onda possibilmente dannose.
   5. inserire manualmente una luce 500 nm LED sulla parte esterna del tubo e continuare a misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa.
   6. Aumentare il numero e / o intensità delle luci a LED fino intensità di fluorescenza Dronpa diminuisce.
   7. inserire manualmente una luce 400 nm LED sulla parte esterna del tubo e continuare a misurare l'intensità di fluorescenza di Dronpa.
   8. Aumentare il numero e / o intensità delle luci a LED fino a quando il fluo Dronparescence intensità aumenta.
   9. Utilizzare almeno tante luci a LED per la costruzione del dispositivo come predetto di essere necessario dal photoswitching in passi 1.1.5 e 1.1.7.
2. La costruzione del dispositivo
   NOTA: Il dispositivo è stato costruito da un negozio di lavorazione professionale, la Arbeitsgruppe Technik presso l'Università di Friburgo. La maggior parte dei pezzi sono realizzati su misura e non disponibili in commercio. Le esatte dimensioni di ciascuna parte sono raffigurati nelle figure 1 e 2. Per chiarire il montaggio di questo dispositivo, complementare Video 1 è fornito e si descrivono le fasi essenziali di seguito.
   1. Mill piece A da cloruro di polivinile (PVC) con le esatte misure indicate in figura 1A.
   2. Inserire luci a LED nei fori di pezzo A e sigillare ogni foro con colla per PVC per evitare perdite d'acqua.
   3. Collegare i LED ad un trasformatore multicanale (ogni lunghezza d'onda dovrebbe occupare una chann separatael) con potenza di uscita regolabile da 0-29 mA.
   4. Fissare la guaina esterna (B) con 3 viti per pezzo A come raffigurato per proteggere i LED da danni fisici.
   5. Per poter collegare il dispositivo ad una pompa dell'acqua, colla nelle clip tubo (C) nei fori del pezzo A (mostrato in Figura 1a, sezione trasversale Y: 9 mm e 61,5 millimetri) utilizzando colla PVC.
   6. Tagliare un tubo di plexiglas lungo 58,5 millimetri (D1).
   7. Fabbricazione pezzi D2 e D3 di plexiglas come illustrato nella Figura 2.
   8. piece colla D3 al fondo D1 con colla plexiglas.
   9. Collegare un O-ring di gomma per pezzo D2 e ​​la colla in cima D1 con la colla plexiglas.
      NOTA: I pezzi D1, D2 e ​​D3 insieme formano pezzo D.
   10. Inserire pezzo D in pezzo A con 3 viti.
   11. Testare il dispositivo per perdite d'acqua prima di applicare l'alimentazione al trasformatore.

2. Misurare la cinetica di uno strumento optogenetic

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preparare le cellule

1. Culture cellule Ramos B in RPMI-mezzo (RPMI 1640, 10% FCS inattivato al calore, 2 mM L-glutammina, 100 U / mL di penicillina, 100 U / mL di streptomicina, e 50 mM 2-mercaptoetanolo) ad una densità di 3- 10 x 10 ⁶ cellule / ml a 37 ° C e 5% CO _2.
2. Harvest Ramos B cellule per centrifugazione a 350 xg e 4 ° C per 5 min.
3. Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Neubauer seguito le istruzioni del produttore e risospendere 1-5 x 10 ⁶ cellule in 600 microlitri di media.
4. Trasferire le cellule in una provetta di vetro FACS, metterli su ghiaccio e proteggerli dalla luce fino alla misura.

Preparare il citometro di flusso e il dispositivo.

1. Collegare il dispositivo ad una pompa acqua riscaldata e regolare la temperatura a 37 ° C.
2. Quando si utilizzano tubi di vetro FACS, scambiare l'O-ring nero del citofluorimetro con un O-ring di gomma e di applicare in aggiunta gr di siliciofacilità.

misurazione

1. Inserire con cura il tubo di vetro FACS nel dispositivo e collegarlo al citofluorimetro (Figura 3).
2. Avviare la misurazione e registrare Dronpa intensità fluorescente (GFP canale).
3. Illuminare il campione di cellule con 400 nm o 500 nm luce, rispettivamente, e registrare l'intensità di fluorescenza Dronpa (canale GFP).

Analisi dei dati

1. Analizzare i dati sperimentali con flusso adeguato citometro software. Grafico a dispersione in avanti contro dispersione laterale e porta le cellule viventi. Tracciare l'intensità di fluorescenza Dronpa nel corso del tempo.

Representative Results

Discussion

La Thermo flusso LED è un dispositivo innovativo per studiare strumenti optogenetic in un citometro di flusso.

Finora, i campioni sono stati optogenetic illuminata solo con i laser microscopia o dispositivi torcia elettrica ^11,12. A seconda dell'angolo e della distanza della torcia al campione, sostanziale variabilità nella quantità di illuminazione è previsto tra esperimenti. Inoltre, vi è un limite al numero di torce una singola persona può operare in un esperimento. Questo limita il repertorio sperimentale e riproducibilità. Queste limitazioni sono state affrontate durante lo sviluppo del nostro dispositivo, che può essere utilizzato per caratterizzare la cinetica photoswitching tempo reale in cellule viventi. A nostra conoscenza, non esiste alcun dispositivo analogo.

Nella configurazione attuale, fino a 30 LED possono essere integrati in una camera Thermo Flow. Pertanto, a seconda delle intensità luminose richieste per ciascuna lunghezza d'onda, un singolo dispositivo può essere noiED per una vasta gamma di strumenti optogenetic. I protocolli stabiliti photoswitching possono essere ottimizzate per letture funzionali, per esempio, misurazioni di flusso di calcio. Il nostro dispositivo può essere adatto per altre sostanze otticamente controllate, come i composti in gabbia o fluorofori fotoattivabile.

A seconda della domanda scientifica e campioni utilizzati, protocolli individualizzati possono essere stabiliti rapidamente. L'impiego di tubi di vetro invece di provette di polistirene o polipropilene raccomanda di limitare citotossicità indotta dalla luce a lunghezze d'onda tra 400-500 nm. Tutte le linee cellulari testate sono sopravvissuti illuminazione (360 nm, 400 nm o 500 nm) per un massimo di un'ora in tubi di vetro. Abbiamo cercato di indagare sulle cause di morte delle cellule durante l'illuminazione a tubi di plastica effettuando esperimenti di trasferimento. Abbiamo illuminati cellule in PBS o RPMI con la luce di diverse lunghezze d'onda e quindi trasferito il surnatante alle cellule non illuminati per misurare la morte cellulare. Nessuno della raccoltasurnatanti causato significativo morte cellulare nelle cellule riceventi (dati non riportati). Inoltre, la temperatura di illuminata PBS in polistirene, o tubi di polipropilene è quasi identica alla temperatura in tubi di vetro. Quindi, possiamo solo speculare sulla causa della morte cellulare. plastica illuminato può rilasciare una sostanza instabile o radiazione di lunghezza d'onda che è tossico per le cellule.

La scelta del mezzo utilizzato per ciascun esperimento è importante. Il potere tampone deve essere considerato e diversi reagenti, come pH-indicatori, assorbono diverse lunghezze d'onda di diversi gradi. Inoltre, la sopravvivenza cellulare differisce notevolmente, per esempio, quando si confrontano-FCS libere di FCS contenenti media.

L'obiettivo di titolazione luce è di utilizzare la minima quantità di luce necessaria per la massima photoswitching. Per la maggior parte degli esperimenti, è favorevole per massimizzare la velocità del photoswitch e quindi massimizzare l'intensità luminosa. Ma, a seconda del wavelength e tipo di cellula, la luce può avere effetti diretti sul comportamento di segnalazione, che è il motivo per cui l'illuminazione eccessiva dovrebbe essere evitato.

È possibile programmare orari di luce per il dispositivo e per collegarlo ad un computer come è comune per altri dispositivi luminosi. Tuttavia, poiché la maggior parte citometri a flusso sono in posti di lavoro comuni condivisi da numerosi laboratori differenti, è preferibile mantenere il dispositivo più piccolo e portabile possibile. Inoltre, la movimentazione manuale del nostro dispositivo per una configurazione a due colori, come presentato qui è così semplice, che la programmazione sarebbe solo marginalmente migliorare la procedura sperimentale.

Nel loro insieme, presentiamo qui un dispositivo innovativo che combina la potenza di strumenti optogenetic e citometria a flusso. Questo semplifica notevolmente la caratterizzazione e sviluppo di strumenti optogenetic in vivo ed espandere il repertorio sperimentale.

Materials

Glass FACS tube	Thermo Fisher Scientific; Waltham, USA	14-961-26	Borosilicate glass tubes 12×75 mm
Flow Cytometer	BD Bioscienceg; Heidelberg, Germany	Fortessa II	Special Order
Dronpa: pcDNA3-mNeptune2-N	Addgene; Cambridge, USA	41645
PolyJet	SignaGen, Rockville, USA	SL100688
LED 505 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	HLMP-CE34-Y1CDD
LED 400 nm	Avago Technologies; Boeblingen, Germany	UV5TZ-400-15
Plexiglas tube 15 mm	Maertin; Freiburg, Germany	76999
Plexiglas 3 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692230
Plexiglas 2.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692225
Plexiglas 1.5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	692215
PVC tile 5 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.005
PVC tile 6 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.006
PVC block 50 mm	Maertin; Freiburg, Germany	690020.050
RPMI	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	61870-010
2-Mercaptoethanol	EMD; Germany	805740
FCS	PAN Biotech; Aidenbach, Germany	P30-3302
Penicillin/Strptomycin (10,000 U/mL)	Invitrogen, Life Technologies; Darmstadt, Germany	15140-122
Acrifix plexiglas glue	Evonic industries, Essen, Germany	1R0192
Tangit PVC-U glue	Henkel, Düsseldorf, Germany