Lo sviluppo di cellule staminali derivate antigene-specifiche cellule T regolatorie contro autoimmunità

Summary

Presentiamo qui un metodo per sviluppare cellule T regolatorie (Treg) specifiche per l'antigene funzionale (Ag) da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) per l'immunoterapia dell'artrite autoimmune in un modello murino.

Abstract

Malattie autoimmuni insorgono a causa della perdita di immunologica auto-tolleranza. cellule T regolatorie (Tregs) sono importanti mediatori di immunologica auto-tolleranza. Tregs rappresentano circa il 5 - 10% del maturo sottopopolazione di cellule T CD4 ⁺ in topi e nell'uomo, con circa 1 - 2% di tali Tregs circolanti nel sangue periferico. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) possono essere differenziati in Tregs funzionale, che hanno un potenziale da utilizzare per le terapie a base di cellule di malattie autoimmuni. Qui, vi presentiamo un metodo per sviluppare antigene (Ag) Treg specifico d'da iPSCs (vale a dire, IPSC-Tregs). Il metodo si basa sulla incorpora il fattore di trascrizione FoxP3 e un recettore delle cellule T Ag-specifica (TCR) in iPSCs e differenziazione di cellule stromali OP9 esprimenti Notch ligandi delta-simili (DL) 1 e DL4. A seguito di differenziazione in vitro, l'IPSC-Treg esprimono CD4, CD8, CD3, CD25, FoxP3, e Ag-specifici TCR e sono in grado di rispondere alla stimolazione Ag.Questo metodo è stato applicato con successo a terapia cellulare di artrite autoimmune in un modello murino. trasferimento adottivo di questi Ag-specifici iPSC-Tregs in artrite Ag-indotta (AIA) topi -bearing ha la capacità di ridurre l'infiammazione articolare e gonfiore e per prevenire la perdita ossea.

Introduction

L'artrite autoimmune è una malattia sistemica caratterizzata da iperplasia del tessuto sinoviale e progressiva distruzione della cartilagine articolare, dell'osso e dei legamenti¹. La generazione o la funzione difettosa delle Treg nell'artrite autoimmune contribuisce all'infiammazione cronica e al danno tissutale perché le Treg svolgono un ruolo cruciale nel prevenire lo sviluppo di cellule immunitarie auto-reattive.

La manipolazione delle Treg è una strategia ideale per lo sviluppo di terapie per sopprimere l'infiammazione in modo Ag-dipendente. Per l'immunoterapia a base di Treg, la specificità delle Treg trasferite è importante per il trattamento dell'autoimmunità in corso². Per esibire l'attività soppressiva, le Treg devono migrare ed essere trattenute nella regione colpita, il che può essere diretto dalla specificità del TCR per l'Ag in quella posizione³. Sebbene le Treg policlonali possano contenere una piccola popolazione contenente questa specificità Ag dai loro TCR, il numero di queste Treg Ag-specifiche è solitamente basso. Di conseguenza, le terapie cellulari che utilizzano Treg policlonali contro le malattie autoimmuni richiedono il trasferimento adottivo di un gran numero di Treg^4,5. Poiché le cellule staminali pluripotenti (PSC) hanno la capacità di svilupparsi in qualsiasi tipo di cellula, le PSC-Treg Ag-specifiche possono rivelarsi buoni candidati per l'immunoterapia basata sulle Treg. Studi precedenti hanno dimostrato il successo dello sviluppo di cellule T derivate da PSC, tra cui le Treg^6-8.

Qui, descriviamo un protocollo per sviluppare iPSC-Treg specifici per l'Ag. Descriviamo inoltre una terapia cellulare dell'artrite autoimmune in un modello murino utilizzando tali Treg. Questo metodo si basa sulla modifica genetica di iPSC murine con TCR Ag-specifici e il fattore trascrizionale FoxP3. Le iPSC ingegnerizzate si differenziano quindi in Treg Ag-specifiche sulle cellule stromali OP9 che esprimono le molecole Notch ligando DL1, DL4 e MHC-II (I-A^b) in presenza di citochine mFlt3L e mIL-7. Queste iPSC-Treg Ag-specifiche possono produrre citochine soppressive, come TGF-β e IL-10, quando stimolate con l'Ag, e il trasferimento adottivo di tali Treg ha la capacità di sopprimere lo sviluppo di AIA in un modello murino. Il protocollo descritto può essere utilizzato per sviluppare Treg Ag-specifiche derivate da cellule staminali per potenziali interventi terapeutici.

Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono approvati dalla Pennsylvania State University College of Comitato Animal Care Medicine (IACUC protocollo # 45470) e sono condotte in conformità con le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento del laboratorio Animal Care.

1. Stem Cell Culture

1. Incubare un piatto 10 centimetri con 10 ml di 0,1% di gelatina per almeno 30 min a 37 ° C (incubatore) al fine di rivestire la piastra.
2. Rimuovere la gelatina dal piatto e la piastra 3 x 10 ⁶ irradiato SNL76 / 7 cellule e incubare per un giorno a 37 ° C (incubatore) utilizzando 10% DMEM supporti (10% FBS e 1% di penicillina streptomicina).
3. Rimuovere il supporto dalla piastra e cultura scongelato iPSCs il / 7 strato di alimentatore di cellule SNL76 usando iPSC supporti (supporto DMEM contenente il 15% di siero fetale bovino, 0,1 mmol / L aminoacidi non essenziali, 1 mmol / L di L-glutammina, e 0,1 mmol / L β-mercaptoetanolo) ^9. Il li cellule di topo iPS-MEF-Ng-20D-17ne, che è stato indotto da fibroblasti embrionali di topo di retrò trasfezione virale di Oct3 / 4, Sox2, Klf4, e c-Myc, è stato ottenuto dal Dr. Shinya Yamanaka (Institute for Frontier Medical Sciences, Università di Kyoto, Kyoto, Giappone).
4. Modificare i media il giorno 3 con mezzi freschi e osservare colonie IPSC al microscopio.
   NOTA: Queste colonie sono piccoli, cluster lucide o cellule rotonde con una demarcazione chiara che mostra l'espressione della GFP sotto un microscopio a fluorescenza.

2. La differenziazione in vitro di Ag-specifici IPSC-Tregs

1. Generare i costrutti da utilizzare nella trasduzione retrovirale da sub-clonazione dei geni OT-II TCR e FoxP3 nel plasmide MIDR ¹⁰ collegato con l'auto-scissione peptide 2A per fare il costrutto MIDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3.
2. Eseguire trasduzione retrovirale ⁹ di iPSCs utilizzando cellule Plat E come la linea cellulare di confezionamento.
3. Al giorno 0, seme OP9-DL1-DL4-IA ^b celle ata densità minima di 10 ⁴ cellule / cm ² utilizzando OP-9 supporti (α-MEM supporto contenente il 20% di FCS e 2,2 g / l di sodio bicarbonato. Piastra 1 x 10 ⁶ cellule per 10 centimetri piatto.
4. Il giorno 3, quando le cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA diventano 80-90% confluenti, rimuovere il supporto e seminare 0.5 - 1 x 10 ⁵ iPSCs sopra OP9-DL1-DL4 - cellule IA ^b in OP-9 dei media.
   NOTA: Questo stabilisce la co-coltura di iPSCs sulle cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA ed è considerato come giorno 0 di differenziazione ^9.
5. Il giorno 5, rimuovere il supporto dal 10 centimetri piatto per aspirazione, lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x, e aspirare il PBS. Aggiungere 4 ml di 0,25% tripsina e incubare a 37 ° C per 10 min. Aggiungere altri 8 ml di COPSI media per le cellule, risospendere e centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   1. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 ml di IPSC media. Incubare queste cellule ri-sospeso su un fresco piatto di 10 centimetrie tornare alla incubatore per 30 min.
      NOTA: rimuovere le cellule ^B di alimentazione OP9-DL1-DL4-IA e mantenere i iPSCs differenzianti che galleggiano nei media. Mantenere le cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA continuamente per raggiungere 80-90% di confluenza per un ulteriore co-coltura.
   2. Dopo 30 minuti, raccogliere le cellule galleggianti, filtrarli attraverso un colino cella di 70 micron, e contare le cellule con un emocitometro.
6. Seme di 5 x 10 ⁵ di iPSCs ad un fresco 80-90% confluenti di cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA nei media OP9. Supplemento media con mFlt-3L ad una concentrazione finale di 5 ng / ml.
7. Il giorno 8, raccogliere iPSCs parzialmente dissociati lavando il piatto con il supporto dal piatto stesso con una pipetta 10 ml. Utilizzare altri 5 ml di OP-9 supporti nel piatto per lavare delicatamente le cellule semi-aderenti mediante attenta, pipettando forza in modo da non rompere il monostrato OP9 sul fondo del piatto. Ripetere il lavaggio con 10 ml di PBS per raccogliere tutti i semi-annuncioherent differenziazione delle cellule.
   1. Combinare due lavaggi, centrifugare a 400 xg per 5 min a temperatura ambiente, risospendere in 10 ml di mezzi OP9 contenente mFlt-3L (5 ng / ml) e MIL-7 (1 ng / ml), e filtrare 70 colino cellule micron.
8. Trasferire le cellule in una piastra di coltura 6-pozzetti contenenti 80-90% confluenti OP9-DL1-DL4-IA ^b cellule, come al punto 1.1. Trasferire le cellule raccolte da un piatto 10 centimetri in un pozzetto della piastra da 6 pozzetti.
9. Il giorno 10, modifica la metà dei mezzi da cellule ai media OP9 fresco supplementato con mFlt-3L (5 ng / ml) e MIL-7 (1 ng / ml). Ripetere questa operazione ogni due giorni.
10. Ogni 4-6 giorni, a seconda della crescita, ri-seme le iPSCs differenziazione su piastre con un nuovo strato di cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA, come descritto al punto 1.1.

3. Valutazione delle Treg in vitro differenziazione e maturazione

1. cambiamenti morfologici del iPSCs di differenziazione.
   1. momentoNitor la co-coltura di iPSCs con cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA di tutti i giorni, osservando le cellule vive sotto un microscopio campo chiaro convenzionale (20X). Di giorno 5, osservare le colonie con caratteristiche simili a mesoderma, come le cellule appiattite. Di giorno 8, osservare piccoli ammassi di cellule rotonde, che rappresentano le cellule differenzianti.
   2. Utilizzare l'esclusione Metodo Trypan Blue per contare le cellule per rilevare il numero e la percentuale di cellule vive. Calcolare la vitalità cellulare come il numero di cellule vitali diviso per il numero totale di cellule nei quattro griglie sul emocitometro. Se le cellule prendono trypan blu, li considerano morti o non vitali. Registrare il numero di cellule vive raccolte dalla cultura.
2. Citometria a flusso analisi della differenziazione iPSCs.
   1. Nei giorni 5, 7, 11, 15, 19, 21, e 28 di co-coltura, rimuovere le cellule con 0,25% tripsina come nella fase 25.
   2. Prima della colorazione della superficie con diversi anticorpi coniugati a fluorocromi, incubate 1 x 10 ⁶ cellule con 100 ml di Fc blocker 2.4G2 diluito in PBS (concentrazione finale 10 ug / ml) a 4 ° C per 20 min per impedire il legame dell'anticorpo al recettore Fc sulla superficie cellulare.
   3. Nei giorni 5, 7, 11, 15, 19, 21, e 28, usare 1 x 10 ⁶ cellule per la citometria a flusso con diversi anticorpi coniugati a fluorocromi per rilevare i marcatori di superficie delle cellule, tra cui CD3, TCRβ, CD4, CD8, CD25, e CTLA4.
   4. A seguito di blocco Fc, lavare le cellule con 10 ml di PBS e macchia con diversi anticorpi coniugati a fluorocromi per 20 minuti a 4 ° C, e quindi eseguire l'analisi di citometria di flusso con il 15-colore citofluorimetro. Utilizzare 0,200 mg di anticorpo per 10 ⁶ cellule diluite in 100 ml di PBS.
   5. Il giorno 28, analizzare le cellule mediante citometria di flusso ¹¹ e la porta su CD8 ⁺ cellule CD4 ⁺ che utilizzano CD4 e CD8 coniugato a un fluorocromo colorazione; analizzare per l'espressione di TCRVα2, TCRVβ5, CD25, CTLA-4, E FoxP3 (Figura 1). Per FoxP3 colorazione, fissare le cellule e li permealize e quindi eseguire colorazione anticorpale ^11.
3. In stimolazione antigenica in vitro di iPSCs.
   1. Il giorno 28 di co-coltura, raccolto iPSC-Tregs da culture attraverso la raccolta delle cellule galleggianti. Trypsinize il resto delle cellule con tripsina 0,25% (come nel passaggio 2,5) e risospendere le cellule in 8 ml di COPSI media. Centrifugare per 5 minuti a 400 xg a temperatura ambiente, aspirare i mezzi di comunicazione, e di nuovo risospendere le cellule in 10 ml di media.
      1. Incubare le cellule risospese in un nuovo 10 centimetri piatto a 37 ° C per 30 minuti e raccogliere le cellule galleggianti. Lavare le cellule con PBS freddo.
   2. Incubare 3 x 10 ⁶ splenociti da milze di topi C57BL / 6 Rag1 - / - topi con 5 mM ovalbumina peptide in 200 ml di mezzi (OVA _323-339) a 4 ° C per 30 minuti in un pozzo piastra ¹¹ 96.
   3. Mescolare Tregs con OVA _323-339 -pulsed splenociti in un rapporto 1: 4 (usa 0,75 x 10 ⁶ Tregs). Incubare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ per 40 ore. Negli ultimi 4 ore, aggiungere 4 ml di diluito brefeldina a nella cultura (1,000x effettiva concentrazione, diluita in mezzi di coltura 1x).
   4. Celle di raccolta con 0,25% tripsina (come al punto 2.5), lavare con 10% NaN ₃ e 0,5 M soluzione di EDTA (tampone FACS), blocco con 100 ml di diluito (concentrazione finale 10 mg / ml) Fc bloccante 2.4G2, e macchia per i marcatori di superficie, CD4, CD8, TCRVα2, e TCRVβ5 come nei passaggi 3.2.3-3.2.4.
   5. Fissare le cellule con una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS e permeabilize con 100 ml di buffer di permeabilizzazione 1x dopo la colorazione della superficie cellulare. Attenzione! Paraformaldeide è allergenico, cancerogeno e tossico.
   6. Macchiare le cellule con fluorocromo coniugato TGF-β e IL-10 per 20 minuti al buio. Utilizzare 0,200 mg di anticorpo / 10 ⁶ cellule dilutEd in 100 ml di PBS. Rilevare la produzione intracellulare di TGF-β e IL-10 con la 15-colore citofluorimetro (Figura 2).
   7. Lavare le cellule tre volte con freddo tampone FACS prima della citometria di flusso ^11.
4. In persistenza vivo di Ag-specifici iPSC-Tregs.
   1. Dopo 8 giorni di co-coltura di cellule ^B OP9-DL1-DL4-IA, trasferire IPSC di derivazione pre-Tregs (Thy1.2) come al punto 3.3.1 nelle tue 1.1 topi congenic (4-6 settimane), tramite un coda vena iniezione senza anestesia. Prima di eseguire la coda iniezione vena dilatare la vena della coda usando una lampada a infrarossi per 5 min. Dopo vena della coda dilatazione, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione e adoptively trasferimento 3 x 10 ⁶ cellule risospese in 200 ml di PBS iniettando attraverso la vena della coda.
   2. Sei settimane dopo il trasferimento Treg, eutanasia topi da CO ₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale. Assicurarsi che la mice non sono la respirazione. Aprire la cavità peritoneale, tagliando la pelle esterna del peritoneo con le forbici e pinze e delicatamente tirando indietro per esporre la pelle interna che riveste la cavità peritoneale. Isolare la milza e linfonodi periferici di iniettati Thy 1.1 topi congenic.
   3. Raccogliere le cellule dal milza e nei linfonodi utilizzando rottura meccanica per ottenere una sospensione di cellule singole. Incubare le cellule con 5 ml di tampone di lisi ACK per 5 min a temperatura ambiente per lisare i globuli rossi. Raccogliere e lavare splenociti o linfociti rimanenti con 10 ml di tampone FACS freddo.
   4. Dopo il lavaggio, il trattamento di cellule con il blocco 2.4G2 Fc a 4 ° C per 20 min come al punto 3.2.2 e macchia con 100 ml di diluito anti-Thy 1.2 anticorpi coniugati a fluorocromi.
   5. Lavare le cellule con 10 ml di tampone FACS e procedere a scorrere citometria ^11.

4. In Vivo Maturazione e soppressione di artrite autoimmune

1. Generare i costrutti come al punto 2.1.
2. Eseguire trasduzione retrovirale ⁹ come al punto 2.2.
3. In differenziazione vivo e induzione artrite nei topi.
   1. Differenziare OT-II TCR / iPSCs FOXP3-trasdotte (OT-II-FOXP3 / iPSCs), iPSCs FOXP3-trasdotte, e DsRed iPSCs trasdotte sulle cellule ^B stromali OP9-DL1-DL4-IA in presenza di citochine mFlt-3L e mIL-7 per 8 giorni come descritto nei punti 2.1 - 2.6.
   2. Trypisinize tutti e tre i tipi di cellule dalla piastra 10 centimetri e risospendere le cellule da ciascuna piastra 10 cm di 10 ml di mezzi freschi. Aggiungere le cellule a 10 cm Piatto fresco e tornare a incubatore per 30 min. Dopo 30 minuti, raccogliere le cellule galleggiante.
   3. Passare le cellule attraverso un colino cella di 70 micron per rimuovere gruppi di cellule e contare con un emocitometro. Regolare le cellule ad una concentrazione di 1,5 x 10 ⁷ cellule / ml in PBS freddo e filtrare nuovamente se necessario. Mantenere le cellule in ghiaccio fino al trasferimento delle cellule adottivo in topi.
   4. Iniettare 200 ml di sospensione cellulare (3 x 10 ⁶ cellule) in tre diversi gruppi di 4 - 6 settimane di età C57BL / 6 topi femmina attraverso la vena della coda come descritto in 3.4.1
   5. Il giorno 10 dopo il trasferimento di cellule, iniettare topi con 100 mg di MBSA emulsionato in adiuvante completo di Freund alla base della coda utilizzando una siringa da 1 ml.
   6. Il giorno 17, anestetizzare topo, utilizzando un vaporizzatore isoflurano (secondo le linee guida IACUC). Utilizzare 4 - 5% isoflurano per l'induzione e 1 - 2% per la manutenzione. Indurre l'artrite per iniezione intra-articolare di 20 mcg MBSA in 10 microlitri di PBS nel ginocchio sinistro comune e di 20 mg MBSA e 100 mcg intero OVA in 10 microlitri di PBS nell'articolazione del ginocchio destro. Cibo e un Gelpack possono essere collocati sul pavimento assestamento dopo l'artrite si è sviluppata. I topi saranno sacrificati: Body Condition Score (BCS) di 2/5 o moribondi, grave cachessia e / o decubito permanente (un periodo di 24 ore), e la gravità punteggio 4. Nel punteggio4, eritema e gonfiore grave comprendono la caviglia, piede e le cifre, o anchilosi dell'arto.
4. Caratterizzazione dei iPSCs OT-II TCR / Foxp3-trasdotte.
   1. Utilizzare un microscopio a fluorescenza (20X) per visualizzare in tempo reale non fissati cellule DsRed ⁺ GFP ^+.
   2. Esaminare l'integrazione e l'espressione genica sia da Western Blot e citometria a flusso ^11.
5. lo sviluppo e la maturazione Treg.
   1. Alle settimane 2, 4, e 6 dopo il trasferimento delle cellule, eutanasia i topi. Per l'eutanasia, in ogni gabbia utilizzare 1 - 2 L di CO ₂ nel primo stadio. Una volta che l'animale è perso conoscenza, aumentare il flusso di CO ₂ a 4 - 5 L / min. Euthanize topi da CO ₂ inalazione. Isolare la milza e drenare i linfonodi, tagliando la pelle esterna del peritoneo con le forbici e pinze e delicatamente tirando indietro per esporre la pelle interna che riveste la cavità peritoneale.
   2. Raccogliere la sospensione singola cella from della milza e linfonodi di guasto meccanico utilizzando un colino cellulare e una siringa da 1 ml a 1% Mezzi di IPSC. Centrifugare il tubo conico contenente il supporto a 400 g per 5 minuti. Risospendere il pellet di cellule in 5 ml di tampone di lisi ACK per lisare i globuli rossi. Re-centrifugare a 1000 rpm per 5 min. Risospendere il pellet di cellule e lavare i restanti splenociti o linfociti con tampone FACS freddo. Seguire i punti 3.4.4 - 3.4.5 e procedere a scorrere citometria.
6. colorazione intracellulare.
   1. Il giorno 50 post-sfida, isolare la milza e drenare i linfonodi dei topi (come al punto 4.5.1) dopo euthanization da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale.
   2. Raccogliere la sospensione singola cella dalla milza e linfonodi di guasto meccanico utilizzando un colino cellulare e una siringa da 1 ml. Incubare le splenociti a temperatura ambiente per 5 minuti con 5 ml di tampone di lisi ACK per lisare i globuli rossi. Raccogliere e lavare i restanti splenocytes o linfociti con tampone FACS freddo. Seguire i punti 3.2.3 - 3.2.4, ma macchia con marcatori di superficie CD4, CD8, CD25, e TCRVβ5.
   3. Procedere a fissare le cellule per la colorazione intracellulare come descritto in 3.3.5 - 3.3.7 e analizzare la produzione intracellulare di citochine (TGF-β e IL-10) di iPSC-derivato Tregs e la porta su cellule in diretta CD4 ⁺ CD25 ^+.
7. Infiltrazione di Ag-specifici Treg nelle ginocchia e la soppressione di artrite.
   1. A seguito di passaggi (4.3 - 4.3.6) nei giorni 7-14 di induzione post-artrite, eutanasia topi da CO ₂ inalazione seguita da dislocazione cervicale (secondo le linee guida IACUC). Eliminare i peli dalle ginocchia con un tagliatore elettrico e accise le ginocchia dalla procedura chirurgica.
   2. Rimuovere la pelle dalle gambe facendo un'incisione nella zampa posteriore con le forbici smussato-end e tagliare la pelle attraverso la coscia e fino alla caviglia. buccia delicatamente la pelle sopra la gamba e del piede per esporre il muscolo. Rimuovereil muscolo dalla gamba accuratamente senza danneggiare l'articolazione del ginocchio.
      1. Tagliare la zampa posteriore appena sopra l'articolazione del bacino / anca e tagliare la tibia con le forbici dissezione affilate.
   3. Fissare le ginocchia in formalina 4% per 48 ore. Disincrostare il ginocchio usando 2.5 M acido formico; lavare tre volte in xilene per 3 min, lavare due volte in 100% di etanolo, lavare due volte in 95% di etanolo, lavare due volte in acqua deionizzata per 2 min, e decalcificazione in 1 mM EDTA. Trattare ad una temperatura sub-ebollizione (90 ° C) per 20 min.
   4. Raffreddare il tessuto fissato per 30 min. Risciacquare con PBS 1x per 4 min e incorporarlo in paraffina. Disidratare i tessuti attraverso una serie di bagni di etanolo per spostare l'acqua, e poi infiltrarsi con cera. Poi incorporare i tessuti infiltrati in blocchi di cera. Eseguire sia sezionamento verticale e orizzontale per la colorazione. Preparare 4 sezioni micron con un microtomo scorrevole.
   5. Eseguire immunofluorescenza colorazione sulle sezioni dopo le procedure standard di deparaffinizzazione e reidratazione con xilene ed etanolo ^12.
   6. Bloccare perossidasi endogena immergendo il vetrino in una quantità sufficiente di soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 3 minuti dopo Ag recupero. scivoli blocco per rilegatura in 3% BSA in PBS a temperatura ambiente in una camera umidificata per 60 minuti non specifico.
   7. sezioni macchia con 200 ml di anticorpi TCRVβ5 fluorocromo coniugato diluito 1: 100 in soluzione di saturazione. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente in 75 - camera umidificata 100%, e lavare 5 volte in 1x PBS per 5 min.
   8. Controcolorare le diapositive per la colorazione nucleare con un reagente antifade contenente DAPI. Aggiungere circa 300 ml di soluzione colorante DAPI diluita (300 Nm in 1x PBS) per vetrino, assicurandosi che tutto il vetrino è coperto. Conservare i vetrini al buio a 4 ° C fino all'analisi al microscopio a fluorescenza (Figura 3).
8. test di soppressione Artrite
   1. Misurare il gonfiore di entrambe le ginocchia dei topi prima dell'induzione artrite utilizzando una pinza quadrante calibro per stabilire una linea di base.
   2. Seguire i passaggi (4,3 - 4.3.6) per l'induzione l'artrite e il trasferimento Treg. Misurare le ginocchia del mouse con un quadrante calibro trasferimento pinza post-Treg.
   3. Calcolare l'incremento percentuale del diametro del ginocchio: Incremento percentuale = (diametro ginocchio il giorno 1 - diametro ginocchio al giorno 0) / diametro del ginocchio al giorno 0.
9. Misurazione della distruzione articolare e infiltrazione di cellule infiammatorie nelle ginocchia istologicamente (Figura 4).
   1. Il giorno 7 post-artrite induzione, eutanasia i topi come descritto in precedenza e le accise le ginocchia dalla procedura chirurgica. Vedere il punto 4.7.1 - 4.7.2.
   2. Fissare le ginocchia in formalina 4%, decalcificazione in EDTA, e incorporare in paraffina. Vedere il punto 4.7.3
   3. Rimuovere entrambe le ginocchia, fissare in formalina al 10%, e in calcify Formical-4. Incorporare i tessuti in paraffina, sezione a 4 micron, e macchia con hematoxyle eosina (H & E) o safranina O colorazione (come al punto 4.7.7) ed osservare al microscopio.
   4. Utilizzare colorazione H & E per valutare l'erosione ossea con un sistema semi-quantitativa di punteggio (0: nessun erosioni; 4: erosioni estese e la distruzione del tessuto osseo). Utilizzare safranina O colorazione per valutare la perdita di proteoglicani e segnare con un sistema semi-quantitativa scoring (0: nessuna perdita di proteoglicani; 3: perdita completa di colorazione per proteoglicani).
      1. Utilizzare un sistema di punteggio semi-quantitativa di segnare infiltrazione infiammatoria delle cellule su vetrini H & E macchiati (0: nessuna infiltrazione di cellule; 4: abbondato infiltrazione di cellule). Valutare i punteggi esaminando entrambe le ginocchia in modo cieco.

5. Misurazione della perdita ossea nelle ginocchia con il sistema ad alta risoluzione micro-tomografia computerizzata (micro-CT)

1. Il giorno 10 di induzione post-artrite, anestetizzare i topi con 2% isoflurano e prepararsi per l'imaging.
2. posizione MICe con le ginocchia rivolte verso l'alto nella camera.
3. Utilizzare un sistema di micro-CT ad alta risoluzione per acquisire imaging in vivo dell'architettura ossea intorno alle ginocchia dei topi.
4. Eseguire micro-TC con una lunghezza 2,2 millimetri, tra cui le articolazioni del ginocchio del mouse con i seguenti parametri: 10,5 micron di dimensione voxel a 55 kV, 145 μA 200 msec tempo di integrazione, 211 immagini.
5. Immagini Importa micro-CT e immagini piane cattura frontale dopo un'ulteriore elaborazione dell'immagine (volume rendering e trasformazione) (Figura 5).

Results

Come mostrato qui, il giorno 28, Ag-specifica Treg espresso sostanzialmente CD3 e Ag-specifica TCR, due marcatori di cellule T. La popolazione CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 espresso. La maggior parte delle cellule CD3 ⁺ TCRVβ5 ⁺ CD4 ⁺ CD25 espresse anche, CD127, e CTLA-4, che sono tipicamente espressi a livelli elevati nel naturale _REGS T (nTregs) e nelle cellule T che esprimono FoxP3 ectopica. Espressione FoxP3 nelle cellule iPSC-de...

Discussion

In questo protocollo, un passaggio fondamentale è la differenziazione in vitro di TCR / FOXP3 iPSCs gene-trasdotte. In vitro Notch induce lo sviluppo verso la linea cellulare T. Per differenziare iPSCs in CD4 ⁺ FoxP3 ⁺ Tregs, abbiamo utilizzato le cellule ^B OP9-DL1 / DL4 / Ia, altamente espressa molecole MHC II (IA ^b). La maggior parte dei iPSCs differenziano in cellule CD4 ^+. Tuttavia, dopo l'espressione del TCR di superficie, molte cellule pr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6j topi	Jackson Laboratory	664
B6.129S7 Rag1tm1Mom/J	Jackson Laboratory	2216
Anticorpo Anti-CD3 (2C11)	BD Pharmingen	553058
Anti-CD28 (37.51) anticorpo	BD Pharmingen	553295
Anti-CD4 (GK1.5) Anticorpo	Biolegend	100417
Anti-CD8 ( 53– 6.7) anticorpo	Biolegend	100714
anticorpo anti-CD25 (3C7)	Biolegend	101912
Anti-TCR-β (H57597) anticorpo	Biolegend	109220
Anti-IL10	Biolegend	505010
Anti-TGFβ	Biolegend	141402
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
FBS	Hyclone	SH3007.01
Brefeldin A	Sigma	B7651
Polybrene	Sigma	107689
Genejammer	Scienza integrata	204130
ACK Tampone di lisi	Lonza	10-548E
mFlt-3L	peprotech	250-31L
mIL-7	peprotech	217-17
Gelatina	Sigma	G9391
Paraformaldeide	Sigma	P6148-500G	Attenzione: Allergenico, Carcenogeno, Tossico
Tampone di permeabilizzazione	Biolegend
mBSA	Sigma	A7906
Ova-albumina	Avantor	0440-01
CFA	Difco	2017014
Tailveiner recur	Braintree scientific	RTV 150-STD