I pesci zebra stanno emergendo come un valido modello di elaborazione dei lipidi alimentari e di malattie metaboliche. Vengono descritti i protocolli di mangimi larvali ricchi di lipidi, l'imaging dal vivo di analoghi lipidici fluorescenti dietetici e la quantificazione dell'assunzione di cibo. Queste tecniche possono essere applicate a una varietà di tecniche di screening, imaging e indagine basata su ipotesi.
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Articolo metodologico
Alto contenuto di grassi alimentazione paradigma per larvale Zebrafish: Alimentazione, l'imaging dal vivo, e la quantificazione del cibo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pesci zebra stanno emergendo come modello di elaborazione dei lipidi alimentari e di malattie metaboliche. Questo protocollo descrive come nutrire il pesce zebra larvale con un pasto ricco di lipidi, che consiste in un'emulsione di liposomi di tuorlo d'uovo di gallina creata sonicando il tuorlo d'uovo in terreni embrionali. Vengono fornite istruzioni dettagliate per lo screening delle larve per il consumo di tuorlo d'uovo in modo che le larve che non riescono a nutrirsi non confondano i risultati sperimentali. I liposomi del tuorlo d'uovo di gallina possono essere addizionati con analoghi lipidici fluorescenti, inclusi acidi grassi e colesterolo, consentendo la visualizzazione sia sistemica che subcellulare dell'elaborazione dei lipidi nella dieta. Vengono descritti diversi metodi per montare le larve che favoriscono l'imaging dal vivo a breve e lungo termine con obiettivi sia verticali che invertiti ad alto e basso ingrandimento. Viene inoltre presentato un test per quantificare l'assunzione di cibo larvale estraendo i lipidi di larve alimentate con analoghi lipidici fluorescenti, individuando i lipidi su una piastra cromatografica a strato sottile e quantificando la fluorescenza. Infine, vengono discussi gli aspetti critici delle procedure, i controlli importanti, le opzioni per modificare i protocolli per affrontare specifiche questioni sperimentali e le potenziali limitazioni. Queste tecniche possono essere applicate non solo a indagini mirate e basate su ipotesi, ma anche a una varietà di schermi e tecniche di imaging dal vivo per studiare il metabolismo lipidico alimentare e il controllo dell'assunzione di cibo.
Introduzione
I meccanismi mediante i quali l'intestino regola l'elaborazione lipidico dietetico, fegato controlla complesso metabolismo sintesi dei lipidi e lipoproteine, e come questi organi funzionano con il sistema nervoso centrale per controllare l'assunzione di cibo non sono completamente compresi. È di interesse biomedico per chiarire questo biologia alla luce delle epidemie attuali di obesità, malattie cardiovascolari, diabete e malattie del fegato grasso non-alcolica. Studi in colture cellulari e topi hanno fornito la maggior parte della nostra comprensione delle relazioni meccanicistiche tra lipidi alimentari e malattie, e zebrafish (Danio rerio) sta....
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Protocollo
Questi protocolli sono stati approvati dalla Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care e del Comitato Usa (Protocollo n. 139).
1. Preparazione degli animali
- Mantenere gli adulti e le larve a 28 ° C su un 14 hr: luce 10 ore: ciclo scuro. Nutrire gli adulti due volte al giorno con Artemia guscio prive (decapsulated, non tratteggio, a partire da 14 DPF) e micropellet commerciali.
- Questi protocolli sono ottimizzati per l'uso di 6-7 dpf larve raccolte dalla riproduzione naturale dello sfondo AB. I protocolli possono essere modificati per le larve di altre età e provenienza. Non fornire cibo esogeno prima del 6 dpf....
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Risultati
Quando alimentato su una sedia a dondolo a 29-31 ° C, la maggior parte delle larve sane (≥95%) si mangia entro 1 ora. Al momento di consumare l'emulsione di tuorlo d'uovo, l'intestino delle larve scurisce a colori. Molto intestini scuri possono essere osservati a 2 ore (Figura 1). Se larve sono digiuni o non vengono alimentate, l'intestino rimane chiaro. Le larve d'uovo alimentato mostra bianco un dilatate lume intestinale che non oscurano a colori.
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Discussione
Le tecniche qui descritte permettono ai ricercatori di trattare zebrafish larvale con mangimi ricchi di lipidi, visualizzare trasformazione dei lipidi nella dieta in larve vive, e quantificare l'assunzione di cibo larvale. Per garantire il successo, particolare attenzione deve essere data a diversi passaggi critici. uova di gallina commerciali variano; Per minimizzare la variabilità potenziale eseguiamo tutti i saggi su uova biologiche da polli privi di gabbia che non sono stati arricchiti per gli acidi grassi omega.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Meng-Chieh Shen per le immagini, Jennifer Anderson per aver fornito utili commenti sul manoscritto e i membri del laboratorio Farber per i loro contributi nello sviluppo di queste tecniche. Questo studio è stato finanziato da NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F) e F32DK096786 (J.P.O.). Questo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali di NIH. Un ulteriore sostegno è stato fornito dalla G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation al laboratorio della S.A.F e alla Carnegie Instituti....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tricaina (sale di etile 3-amminobenzoato metanosulofnato) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anestesia per larve di pesce zebra |
| Uova di gallina | N/A | N/A Uova | biologiche, senza gabbia, non arricchite per acidi grassi omege-3 |
| Processore ad ultrasuoni 3000 sonicatore | Misonix, Inc. | S-3000 | Per fare liposomi di tuorlo d'uovo |
| Custodia acustica Sonabox | Misonix, Inc. | 432B | Per fare liposomi di tuorlo d'uovo |
| 1/8" microtip conico | Misonix, Inc. | 419 | Per fare liposomi di tuorlo d'uovo |
| Fiale di ambra (4 ml, vetro) | National Scientific | 13-425 | Conservazione dei lipidi; include fiale, tappi aperti e setti per tappi |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Agitatore incubato per mangimi |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-esadecanoico) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-dodecanoico) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-pentanoico) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Analogo lipidico fluorescente; (acido 4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionico) |
| Colesterolo TopFluor | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Analogo lipidico fluorescente; 23-(dipirrometenboro difluoruro)-24-norcolesterolo |
| BSA senza acidi grassi | Sigma-Aldrich | A0281-1G | Per la solubilizzazione del colesterolo TopFluor |
| Metilcellulosa | Sigma-Aldrich | M0387 | Terreni di montaggio per imaging larvale dal vivo; 75 x 25 x 1 mm |
| Agarosio a basso punto di fusione | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Terreni di montaggio per larve vive Imaging; Vetrini per microscopio VWR 22 x 30 |
| nbsp; | VWR | 16004-422 | Montaggio di larve per l'imaging dal vivo |
| Vetrini coprioggetti | Vetro di copertura | 12-544A | Larve di montaggio per imaging dal vivo |
| Super colla | Loctite | LOC01-30379 | Larve di montaggio per imaging dal vivo |
| FluoroDish (piatto con fondo in vetro) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Montaggio di larve per imaging dal vivo; piatto da 35 mm, vetro da 23 mm, spessore del vetro da 0,17 mm. |
| Microscopio confocale | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscopio per imaging dal vivo ad alto ingrandimento |
| Stereoscopio | Nikon | SM21500 | Microscopio per imaging dal vivo a basso ingrandimento |
| Provette per coltura in vetro | Kimble | 73500-13100 | Estrazione dei lipidi; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Estrazione lipidica |
| Piastre TLC canalizzate | Whatman Scientific | WC4855-821 | Saggio di assunzione di cibo; LK5D Gel di silice 150 A, 20 x 20 cm, spessore 250 um; Fuori produzione |
| Piastre TLC canalizzate | Analtech, Inc. | 66911 | Saggio di assunzione di cibo; Sostituzione diretta delle piastre TLC di Whatman Scientific |
| Imager a modalità variabile Typhoon 9410 | GE Healthcare | 9410 | Lettore di piastre fluorescenti per il test di assunzione di alimenti |
| Software ImageQuant | GE Healthcare | 29000605 | Analisi del test di assunzione di alimenti |
| 5 3/4' Pipette pasteur monouso in borosilicato a foro largo | Kimble | 63A53WT | Larve di trasferimento |
Riferimenti
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
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Ristampe e permessi
