Un metodo galleggiabilità a base della determinazione dei livelli di grasso nel<em&gt; Drosophila</em

Sommario

Qui vi presentiamo un metodo per misurare i livelli di grasso organismal nel terzo instar (L3) stadio larvale di Drosophila melanogaster. Questo metodo sfrutta la relativamente bassa densità di tessuto adiposo a distinguere tra le larve con depositi di grasso alterati. analisi di galleggiabilità-based è uno strumento prezioso per lo screening rapido, riproducibile, ed economico.

Abstract

Drosophila melanogaster è un sistema sperimentale chiave nello studio della regolazione del grasso. Attualmente esistono numerose tecniche per misurare i livelli di grasso immagazzinato in Drosophila, ma la maggior parte sono costose e/o laboriose e hanno chiari limiti. Qui, presentiamo un metodo per determinare in modo rapido ed economico i livelli di grasso dell'organismo nelle larve di Drosophila L3. La tecnica si basa sulle differenze di densità tra i tessuti adiposi e magri e consente di rilevare rapidamente i fenotipi di grasso e magro. Abbiamo verificato l'accuratezza di questo metodo rispetto alla percentuale di grasso corporeo determinata mediante estrazione di lipidi neutri e gascromatografia accoppiata con spettrometria di massa (GCMS). Delineiamo inoltre protocolli dettagliati per la raccolta e la sincronizzazione delle larve, nonché ricette sperimentali pertinenti. La tecnica presentata di seguito supera le principali carenze dei metodi di quantificazione dei lipidi più utilizzati e fornisce un modo potente per esaminare rapidamente e in modo sensibile le larve L3 per i fenotipi di regolazione del grasso, mantenendo l'integrità delle larve. Questo test ha ampie applicazioni per lo studio del metabolismo e della regolazione dei grassi utilizzando Drosophila.

Introduzione

Drosophila melanogaster è stato utilizzato per più di un secolo nello studio della genetica e di altre questioni biologiche fondamentali. Negli ultimi decenni, è diventato chiaro che la Drosophila è un potente strumento per lo studio di molte malattie umane. Il 70 - 80% di geni associati a malattie umane hanno una mosca ortologo identificata ^{1 - 4,} Drosophila fornisce un sistema semplificato ma traducibile in cui studiare le malattie complesse. Il metabolismo, in particolare, ha beneficiato di tale studio. Non solo la genetica del metabolismo ben conservati tra le mosche e gli esseri umani, ma gli organi competenti e tipi di cellule sono molto simili ^{a 2,5.} Ad esempio, il grasso corporeo dei negozi mosca entrambi Triacilgliceroli (TAG) e di glicogeno, funzioni analoghe a quelle svolte nel fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo bianco ^6. Utilizzando Drosophila come modello per l'obesità umana ha notevolmente migliorato la nostra comprensione di lipidiil metabolismo e la genetica di obesità ^7. Lo stadio larvale di sviluppo è particolarmente utile per studiare la segregazione di nutrienti stoccaggio o utilizzo come è dedicata all'alimentazione e l'immagazzinamento di energia da utilizzare durante pupariation.

Attualmente, ci sono molti metodi quantitativi diversi della determinazione dei livelli di stoccaggio dei grassi in Drosophila. Il metodo più diffuso è il saggio colorimetrico accoppiato (CCA) ^8,9. CCA è stato sviluppato per determinare i livelli TAG nel siero umano e opera sulla premessa che glicerolo liberato dalla spina dorsale di trigliceridi subirà diverse reazioni, che si traduce in una reazione redox-coupled generando un prodotto colorato. Assorbanza di specifiche lunghezze d'onda di luce viene poi misurata per determinare la quantità iniziale di glicerolo presente. Tuttavia, glicerolo può anche essere liberato da mono- e diacylglycerides oltre al TAG e quindi non può essere una misura accurata di storato grasso corporeo ^9. Inoltre, l'occhio del pigmento di mosche adulte schiacciati può interferire con alcune letture di assorbanza e complicare i risultati ^9,10. Pertanto, CCA deve essere accompagnato e convalidato cromatografia su strato sottile (TLC), che permette la separazione delle maggior parte delle famiglie di lipidi che può essere quantificata mediante densitometria ^10,11. Tuttavia, alcune classi di lipidi, come steroli non possono essere analizzati e devono essere quantificati un modo diverso ^12. La spettrometria di massa (MS) è un modo preciso per quantificare tutte le classi di grandi lipidi cellulari ^12,13. Tuttavia, le procedure di estrazione dei lipidi necessari per analizzare da MS sono sia in termini di tempo (più presa quasi un giorno intero) e costosa. Qui vi presentiamo un metodo alternativo per determinare rapidamente ed economicamente livelli di grasso organismal nelle larve L3 di Drosophila melanogaster.

Il metodo presentato sotto sfrutta la differenza di densità tra tessuto adiposo e tessuto magro. fa mammiferit tessuto ha una densità di circa 0,9 g / ml ¹⁴ mentre il muscolo scheletrico come una densità di 1,06 g / ml ^15. Questa differenza significa che gli animali con elevate riserve di grasso avranno densità inferiore rispetto agli animali con i negozi più bassi di grasso, che permetteranno loro di galleggiare meglio in una soluzione della densità fisso. Questa proprietà consente estremamente rapido lo screening di un gran numero di animali pur essendo sia poco costoso e non invasivo. Analisi di galleggiabilità-based è stato utilizzato sia per confermare i fenotipi di alterare regolatori noti di livelli di grasso, nonché di individuare nuovi regolatori genetici e neurologici di obesità ^16,17.

Protocollo

1. raccogliere le uova dalle mosche con genotipi di interesse

NOTA: croci ideali sono costituite da 150 mosche vergini e almeno 75 maschi. collezioni di archivio deve essere composto da almeno 200 mosche.

1. Preparare piatti d'uva.
   1. Aggiungere 37,5 g di agar a 1,5 L di acqua distillata in un matraccio 4 L.
   2. Autoclave miscela acqua / agar per 50 min a 121 ° C (250 ° F).
   3. Mentre l'acqua / miscela agar è autoclave, aggiungere 50 g di saccarosio al succo d'uva da 500 ml e mescolare con un ancoretta su un piatto mescolare fino a quando riscaldato il saccarosio si scioglie.
   4. Spegnere il fuoco e continuare a mescolare per raffreddare la miscela succo d'uva / saccarosio al di sotto di 70 ° C. Testare la temperatura interna con un termometro alcool.
   5. Aggiungere 3 g Drosophila agente anti-fungine (ad esempio, Tegosept) per riscaldare il succo d'uva miscela / saccarosio e mescolare per sciogliere.
   6. Quando l'acqua / miscela agar è fuori dell'autoclave, permettono raffreddare il pallone al tatto agitando occasionalmente.
   7. Unire miscela acqua / agar e succo d'uva miscela / saccarosio e mescolare fino a ben miscelati.
   8. Utilizzare una pipetta sierologica aggiungere 8 - 10 ml della miscela dell'uva al coperchio di una piccola piastra di Petri (stile 35 x 10 mm). Lasciare la miscela a corona superiore alla altezza delle pareti del coperchio per formare una forma convessa.
   9. Lasciare le piastre uva raffreddare per 2 ore a temperatura ambiente e poi conservare in un contenitore ermetico a 4 ° C.
2. Preparare pasta di lievito.
   1. Aggiungere 6 ml di soluzione tampone fosfato (PBS) a 4 g vivo lievito secco attivo in una provetta conica da 50 ml e mescolare con una spatola fino liscio.
   2. Conservare lievito in pasta a 4 ° C.
3. Aggiungere un piccolo ciuffo (circa 1/8 cucchiaino) di pasta di lievito per mezzo di una piastra di uva. Lisciare eventuali asperità con una spatola.
4. Posizionare le piastre di uva in un incubatore fino a quando non hanno raggiunto la temperatura ambiente.
5. Trasferire le mosche di interesse in un piatto di camera di raccolta delle uova e del luogo d'uva with pasta di lievito rivolta verso l'interno sulla parte superiore. Nastro piatto d'uva per la camera di raccolta delle uova per evitare che la piastra di cadere. Assicurati di scrivere importanti genotipo e informazioni aggiornate sulla parte inferiore della piastra di uva.
6. Capovolgere la camera di raccolta delle uova per consentire le mosche di deporre le uova sulla piastra di uva.
7. Posizionare una casella o coprire la sorveglianza delle camere di raccolta delle uova e metterli in un incubatore a 25 ° C.
8. Consentire mosche per deporre le uova per 4 - 6 ore.
9. Terminare raccolta prendendo la piastra dell'uva fuori della camera di raccolta uovo e trasferire le mosche indietro nel loro bottiglia di cibo. Utilizzare una spatola per eliminare ogni pasta di lievito in eccesso dalla piastra di uva. piatto d'uva Conservare in una più grande capsula di Petri in un incubatore umidificato a 25 ° C per ~ 24 ore.

2. Trasferimento larve di Experimental alimentari

1. Preparare il cibo sperimentale.
   NOTA: Questa ricetta cibo è basato sulla Bloomington Stock Center ricetta ^18. importanti cambiamentiincludono una maggiore quantità di lievito per ottimizzare il valore nutrizionale degli alimenti, come valutato dal tempi di vagare fase (tra 112-120 ore dopo la raccolta delle uova a 25 ° C). Mentre abbiamo trovato questa ricetta ideale per la salute e lo sviluppo del nostro larve sperimentale, ogni ricetta cibo è dato di calibrazione accettabile con controlli positivi e negativi, esempi dei quali sono elencati al punto 3.10.
   1. Misura 1.600 ml di acqua distillata.
   2. Mescolare 134 g di farina di mais, 10,6 g Drosophila Agar Tipo II, e una parte dell'acqua (~ 500 ml) in 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato.
   3. Mescolare 70 g di lievito secco attivo vivo, 18,4 g di farina di soia, 84,8 g estratto di malto, e una parte dell'acqua (~ 500 ml) in un altro 1 L becher. Miscela per 2 minuti con un miscelatore della mano motorizzato.
   4. Agitare ogni bicchiere e versare in un pallone da 4 L. Usare l'acqua residua per sciacquare i bicchieri e aggiungere nel pallone.
   5. Misurare 140 ml di sciroppo di mais luce e aggiungere al pallone, mescolare agitando.
   6. Autoclave per 50 minuti a 121 ° C (250 ° F) in ambiente liquido.
   7. Dopo la sterilizzazione in autoclave, versare il cibo in un 4 L bicchiere e lasciare raffreddare. Aiutare il processo di raffreddamento miscelando con un miscelatore della mano motorizzato.
   8. Una volta che il pallone si è raffreddato abbastanza da toccare, aggiungere 8,8 ml di acido propionico e 16,8 ml di soluzione di Drosophila agente / etanolo anti-fungine. Mescolare bene. (Fare soluzione agente Drosophila anti-fungine con l'aggiunta di 380 g Drosophila agente anti-fungine a 1 L 200 etanolo prova e mescolare in un piatto caldo fino sciolto, facendo attenzione che la soluzione non sia superiore a 70 ° C.)
   9. Versare il cibo in fiale fino a quando il cibo è di circa 1 pollice profondo e lasciare raffreddare a temperatura ambiente per 2-3 ore. Collegare flaconi e conservare in un incubatore a 25 ° C. Utilizzare entro una settimana.
2. Tuffo una spatola più volte nello strato superiore del flaconcino di cibo per segnare esso. Questo aiuterà le larve di scavare e mangimi.
3. 22 - 24 ore dopo la raccolta delle uova haended, utilizzare un pennello piccolo per raccogliere 50 primo stadio (L1) larve della stessa dimensione approssimativa. Posizionare larve nel cibo sperimentale. Pulire il pennello su un laboratorio wipe e garantire che non vi siano restante larve sul pennello prima di proseguire per un altro genotipo.
4. Mettere flacone di larve in un incubatore a 25 ° C e permettere di sviluppare.

3. Determinare i livelli di grassi nelle larve

1. Preparare soluzioni.
   1. Preparare 1 L 10x PBS magazzino.
      1. Aggiungere 80 g di NaCl, 2 g KCl, 14,4 g di Na ₂ HPO _4, e 2,4 g KH ₂ PO _4-800 ml di acqua in un bicchiere 2 L contenente un ancoretta. Mescolare con nessun calore fino a quando tutti i sali sono incorporati. Portare il pH a 7,4. Aumentare il volume di 1 litro con acqua.
   2. Preparare 2 L 1x PBS. Aggiungere 200 ml di soluzione di PBS 10x magazzino a 1.800 ml di acqua.
   3. Utilizzare questo stock di PBS 1x per rendere il 20% w / v di saccarosio.
2. Rimuovere il flacone di larve dallaincubatore una volta ci sono 20 - 40 larve di vagare fino ai lati del flacone (generalmente il quinto giorno dopo collezioni di uova). Registrare la data e l'ora del test, nonché il numero di vagare larve.
3. Preparare la soluzione sperimentale aggiungendo 11,5 ml di PBS e 9 ml 20% di saccarosio in una provetta conica da 50 ml.
4. Aggiungere 20% di saccarosio al flaconcino finché è 0.5 - 1 pollice dalla parte superiore della fiala.
5. Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente lo strato superiore di cibo per le larve liberi che sono ancora scavando nel cibo. Tutti larve salirà alla superficie della soluzione di saccarosio.
6. Utilizzare pinze per trasferire delicatamente le larve nella concentrazione di saccarosio iniziale dal punto 3.3.
7. Utilizzare una spatola per mescolare delicatamente le larve in questa soluzione.
8. Chiudere la provetta conica e capovolgere più volte per mescolare accuratamente la soluzione.
9. Togliere il tubo conico e agitare per creare un vortice gentile.
10. Lasciare che le larve di stabilirsi, o galleggianti alla parte superiore della soluzione o sinking al fondo. Attendere 2-5 minuti per le larve di stabilirsi.
    NOTA: Se ci sono ancora larve, che non sono sicuramente variabile o affondare, scegliere una linea da utilizzare come punto di taglio per etichettare le larve sia come un galleggiante o una zavorra. Applicare questo stesso criterio a tutti i genotipi. Usiamo l'angolo al fondo della provetta conica come nostro confine. Adp o sir2 ¹⁷ larve mutante può essere utilizzato come controllo positivo e LSD2 ¹⁹ mutanti possono essere utilizzati come controllo negativo per la calibrazione del test.
11. Registrare il numero di larve flottante e la concentrazione specifica testato.
12. Aggiungere 1 ml di 20% di saccarosio alla soluzione sperimentale per aumentarne la densità.
13. Ripetere i passaggi 3,7-3,10. Registrare il numero di larve galleggianti e questa nuova concentrazione.
14. Continuare passi 3.12 e 3.13 fino ad almeno il 95% delle larve sono galleggianti.
15. Utilizzare pinze per raccogliere tutte le larve in un piatto dissezione pieno di PBS.
16. observe larve al microscopio e nota se ci sono piccole larve, pupe pre-, pupe, o qualsiasi altre differenze tra genotipi.
    NOTA: Idealmente, tutte le larve deve apparire omogenea e allo stesso stadio di sviluppo. Abbiamo osservato soltanto misurazioni del grasso consistenti in queste condizioni.
17. Registrare il numero totale di larve.
18. Utilizzando pinze, trasferire 10 larve di un laboratorio di pulire a secco. Etichettare una provetta e posizionare 10 larve nel tubo.
19. Flash congelare le larve in azoto liquido. Conservare il tubo a -20 ° C.

Risultati

La figura 1 rappresenta un esempio di come il dosaggio galleggiamento-based può rilevare sia depositi grassi superiori e inferiori in larve geneticamente manipolati. La figura 1A mostra che eccitazione o silenziamento di un certo sottoinsieme di neuroni (E347) nel cervello larvale induce grassi inferiori e superiori negozi rispettivamente. Lo stesso controllo background genetico è stato utilizzato in entrambi i casi. Figura 1B fornisce u...

Discussione

Ci sono una moltitudine di tecniche che sono state sviluppate per misurare i livelli di lipidi ^{8 - 10.} Tuttavia, ciascuno di questi metodi viene fornito con alcuni importanti inconvenienti che sono indirizzati mediante il saggio galleggiamento basato descritto sopra. In primo luogo, questo test è estremamente rapido. Test di un gradiente di piena concentrazione non richiede più di 30 - 60 min. Questo è un enorme miglioramento sulla maggior parte delle tecniche attualmente in uso. Ad esem...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Succo
Saccarosio	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Etanolo			200 proof
Lievito di birra	Fleichmann's
Yellow Farina di mais	Quaker		Arricchito degerminato
Drosophila Agar Tipo II	Apice	66-104
Farina di soia	ADM Ingredienti speciali	062-100
Estratto di malto	Breiss	5748
Sciroppo di mais leggero	propionico Karo
	VWR	U330-09
Cloruro di sodio	Fisher	50147491
Fosfato di potassio monobasico	Sigma	P5655-100G
Fosfato di sodio anidro	Fisher	S3933
Cloruro di potassio	Fisher	P330-500
35 x 10 mm piastra di Petri	Fisher	08-757-100A
50 ml Conico	Fisher	50-869-569

d'Uva Acido