Method Article

Un protocollo ottimizzato per la radiomarcatura efficiente di oro nanoparticelle utilizzando un 125 Azide gruppo I-etichettati protesico

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Una procedura dettagliata per la sintesi di un azide 125 I-etichettati e la radiomarcatura di dibenzocyclooctyne (DBCO) -gruppo-coniugati, nanoparticelle d'oro 13-nm dimensioni utilizzando una reazione click senza il rame è descritto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, dimostriamo un protocollo dettagliato per la radiosintesi di un gruppo protesico azidico marcato con 125I e la sua applicazione all'efficiente radiomarcatura di nanoparticelle d'oro funzionalizzate con gruppo DBCO utilizzando una reazione di clic senza rame. La radioiodinazione del precursore stannilato (2) è stata effettuata utilizzando [125I]NaI e clorammina T come ossidante a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo la purificazione HPLC del prodotto grezzo, è stato ottenuto l'azide purificata marcata con 125I (1) con elevata resa radiochimica (75 ± 10%, n = 8) ed eccellente purezza radiochimica (>99%). Per la sintesi di nanoparticelle d'oro radiomarcate di dimensioni pari a 13 nm, le nanoparticelle d'oro DBCO-funzionalizzate (3) sono state preparate utilizzando un polimero di polietilenglicole tiolato. Una reazione di clic priva di rame tra 1 e 3 ha dato alle 125nanoparticelle d'oro marcate con I (4) oltre il 95% di resa radiochimica determinata dalla cromatografia su strato sottile (radio-TLC). Questi risultati indicano chiaramente che l'attuale metodo di radiomarcatura che utilizza una reazione di clic senza rame promossa dal ceppo sarà utile per la radiomarcatura efficiente e conveniente di nanomateriali contenenti il gruppo DBCO.

Introduction

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La reazione di clic senza rame promossa dalla deformazione tra azidi e cicloottini è stata ampiamente applicata all'efficiente marcatura bioortogonale di un'ampia gamma di biomolecole, nanomateriali e soggetti viventi1-7. Grazie all'eccellente sito-specificità e alla rapida velocità di reazione di questa reazione di coniugazione, è stata utilizzata anche per sintetizzare traccianti radiomarcati. Alcuni gruppi protesici di azide o DBCO marcati con 18F sono stati preparati per la marcatura in vitro di vari tumori che hanno come bersaglio peptidi e anticorpi, nonché per l'imaging pre-mirato in vivo dei tumori8-13. Oltre a questi esempi, la stessa reazione di coniugazione è stata applicata alla marcatura metallo-radioisotopo di nanomateriali per studi di imaging con tomografia a emissione di positroni (PET)14-16.

Per diversi decenni, gli iodio radioattivi sono stati utilizzati per la ricerca biomedica e gli studi clinici attraverso l'imaging PET (124I), la tomografia computerizzata a emissione di fotoni singoli (SPECT) (123I, 125I) e il trattamento del cancro alla tiroide (131I)17-21. Pertanto, un metodo efficiente per la marcatura dello iodio radioattivo è di fondamentale importanza per varie indagini, tra cui studi di imaging molecolare, analisi della distribuzione degli organi delle biomolecole, identificazione di biomarcatori e sviluppo di farmaci. Una strategia di reazione a clic senza rame potrebbe essere utilizzata nella marcatura dello iodio radioattivo. Tuttavia, questa applicazione non è stata studiata in modo così approfondito come 18biomolecole marcate F22-23. Qui, forniremo un protocollo passo-passo per la sintesi di un azide marcato con 125I per la radiomarcatura di molecole derivate da gruppi DBCO. Le procedure descritte nel presente rapporto comprenderanno la radioiodinazione del precursore stannilato, le fasi di purificazione con HPLC e l'estrazione in fase solida. Dimostriamo anche un'efficiente radiomarcatura di nanoparticelle d'oro di dimensioni 13 nm modificate con gruppo DBCO utilizzando l'azide marcata con 125I. Il protocollo dettagliato in questo rapporto aiuterà i chimici sintetici a comprendere una nuova metodologia di radiomarcatura per la sintesi di prodotti radiomarcati.

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Protocol

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Attenzione: la forma ossidata di iodio radioattivo è molto volatile e deve essere maneggiato con adeguati schermi di piombo e fiale di piombo. Tutti i passaggi radiochimiche dovrebbero essere eseguite in una cappa carbone filtrata ben ventilata, e le procedure sperimentali devono essere controllati da dispositivi di rilevazione di radioattività.

1. Preparazione della Chimica e della cartuccia Reverse Phase per la sintesi del 125 Azide I-marcato

  1. Preparazione dei reagenti in soluzione
    1. Sciogliere 1 mg del precursore azide (2) in 150 ml di etanolo assoluto (Figura 1).
      NOTA: Una procedura di sintesi dettagliata per il precursore azide (2) è stato riportato nel precedente articolo 22.
    2. Sciogliere 1 mg cloramina T in 20 ml di 1x tampone fosfato isotonico (pH = 7,4).
    3. Sciogliere 2 mg di sodio metabisolfito in 20 ml di H 2 O.
  2. preparazione della cartuccia
    1. Lavare la cartuccia TC18 con 10 ml di etanolo assoluto seguito da 10 ml di H 2 O. Non asciugare la matrice della cartuccia con aria.

2. radiosintesi del Azide Protesi Gruppo marcato 125 I

  1. Reazione Radioiodination del precursore
    1. Aggiungere la soluzione azide precursore (1 mg in 150 ml di etanolo assoluto) e acido acetico (10 ml) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
    2. Aggiungere 150 MBq di [125 I] NaI in 0,1 M NaOH (50 ml) alla miscela di reazione.
    3. Aggiungere una soluzione cloramina T (1 mg in 20 ml di 1x tampone fosfato salino) e chiudere la miscela di reazione provetta contenente.
    4. Incubare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 minuti fino a quando la reazione è completa radioiodination.
    5. Aggiungere una soluzione di sodio metabisolfito (2 mg in 20 ml H 2 O) alla miscela di reazioneper placare la reazione radioiodination.
    6. Prelevare 0,2 ml di prodotto grezzo e diluire con 100 ml di soluzione di (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) per l'analisi HPLC.
      NOTA: Per tutti gli esperimenti HPLC, usa acido formico 0,1% contenente H 2 O (solvente A) e 0,1% di acido formico contenente acetonitrile (solvente B) come eluenti.
    7. Analizzare il prodotto grezzo diluito utilizzando una fase inversa analitica radio-HPLC (C18 a fase inversa colonna; portata: 1 ml / min; eluente pendenza: 20% B solvente per 0-2 min, 20-80% di solvente B per 2-22 min, 80-100% B solvente per 22-23 min, e il 100% di solvente B per 23-28 min; tempo di ritenzione: 16,4 min) (Figura 2).
  2. La purificazione del prodotto grezzo con una HPLC preparativa
    NOTA: fornire abbastanza schermatura di piombo intorno parti HPLC quali l'iniettore, colonne, rivelatore, fiale di raccolta, il contenitore in cui l'effluente viene raccolto.
    1. ritirare °una e intera miscela di reazione in una fiala HPLC. Lavare il tubo di reazione con acetonitrile (0,5 ml) e aggiungere il risciacquo nello stesso flaconcino. Diluire la soluzione raccolta con H 2 O (1 ml).
    2. Iniettare il prodotto grezzo su una preparativa radio-HPLC (C18 a fase inversa colonna; la portata: 10 ml / min; gradiente eluente: 20% di solvente B per 0-2 min, 20-80% di solvente B per 2-22 min, 80-100% B solvente per 22-23 min, e il 100% B solvente per 23-28 min).
    3. Raccogliere il picco radioattivi rappresenta il azide marcato 125 I (1) (t R in queste condizioni HPLC è 17,8-18,8 min) in una provetta di vetro (Figura 2).
    4. Misurare la resa radiochimica della frazione con un calibratore di dosi di radioattività secondo il protocollo del produttore.
    5. Iniettare il prodotto purificato su una analisi radio-HPLC utilizzando le stesse condizioni HPLC per determinare la purezza radiochimica del prodotto.
  3. Estrazione in fase solida del prodotto
    1. Diluire la frazione contenente il prodotto desiderato (1) con 40 ml puro H 2 O.
    2. Aggiungere la soluzione diluita in una cartuccia TC18 condizionato.
    3. Lavare la cartuccia con un ulteriore 15 ml H 2 O.
    4. Eluire il prodotto (1) intrappolato nella cartuccia con 2 ml di acetone in una fiala di vetro da 10 ml che è protetto da uno scudo piombo. Misurare la radioattività del prodotto eluito utilizzando un calibratore di dosi di radioattività secondo il protocollo del produttore.
      NOTA: dimetilsolfossido (DMSO) o etanolo assoluto può essere utilizzato anche per eluizione del prodotto dalla cartuccia. Circa il 5-10% della radioattività attacca normalmente alla cartuccia, e il prodotto radiomarcato rimanente non può essere completamente eluito utilizzando quantità in eccesso di solvente organico.
    5. Evaporare l'acetone con un flusso di azoto o gas argon.
    6. Sciogliere il residue con DMSO (100-200 ml) per il prossimo passo radiomarcatura.

3. Sintesi di DBCO-gruppo-coniugato oro Nanoparticelle

  1. Modifica della superficie di oro 13-nm di dimensioni nanoparticelle con DBCO-gruppo contenente glicole polietilenico
    1. Nanoparticelle d'oro Preparare sodio-citrato-stabilizzato (3) (dimensione media = 13 nm), secondo un rapporto precedente 24.
    2. Aggiungere una soluzione acquosa di Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) per le nanoparticelle di oro citrato-stabilizzato (10 nM, 15 ml). Agitare la soluzione per 20 minuti in un agitatore orbitale.
    3. Aggiungere una soluzione acquosa di DBCO-contenente gruppi tiolo polietilenglicole (peso molecolare medio = 5000, 100 mM, 1,5 ml). Agitare la soluzione per 2 ore su un agitatore orbitale.
  2. Purificazione delle nanoparticelle di oro DBCO-gruppo modificati
    1. Purificare il nanoparticelle d'oro DBCO-gruppo-modificato (4) </ Strong> per centrifugazione successivi (11.400 xg, 15 min x 3).
    2. Decantare il surnatante e aggiungere acqua pura per la risospensione del pellet delle nanoparticelle d'oro.

4. radiomarcatura di DBCO-gruppo-modificato oro nanoparticelle tramite la libera-Rame Clicca Reazione

  1. Sintesi di nanoparticelle d'oro 125 I-etichettati utilizzando l'azide marcato 125 I (1)
    1. Preparare una soluzione concentrata di nanoparticelle di oro DBCO-gruppo-modificato usando centrifugazione (11.400 xg, 15 min) e regolare la concentrazione delle nanoparticelle di oro a 2 mM.
    2. Aggiungere 4,1 MBq del azide I-marcato 125 (1) in DMSO (5 ml) ad una sospensione di nanoparticelle di oro (4) (2 mM, 50 microlitri).
    3. Incubare la miscela di reazione risultante a 40 ° C per 60 min.
    4. Prelevare un'aliquota (0,2 ml) dal prodotto grezzo e applicarlo su una silice-coated cromatografia su strato sottile (TLC) piatto.
    5. Sviluppare la piastra TLC usando acetato di etile come fase mobile.
    6. Posizionare la piastra TLC su uno scanner radio TLC ed eseguire lo scanner per monitorare la reazione radiomarcatura (figura 3) secondo il protocollo del produttore.
  2. La purificazione del prodotto grezzo
    1. Purificare la miscela di reazione contenente 125 nanoparticelle I marcato con oro (4) mediante centrifugazione (11.400 xg, 15 min).
    2. Decantare il surnatante e aggiungere acqua pura per la risospensione del pellet delle nanoparticelle d'oro.
    3. Prelevare un'aliquota (0,2 ml) dal prodotto purificato e applicarlo su una piastra TLC rivestiti di silice.
    4. Sviluppare la piastra TLC usando acetato di etile come fase mobile.
    5. Posizionare la piastra TLC su uno scanner radio TLC ed eseguire lo scanner per determinare la resa radiochimica e purezza radiochimica del gol marcato 125 Id nanoparticelle (4) (Figura 3) secondo il protocollo del produttore.

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Results

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La reazione radioiodination del precursore stannylated (2) è stata effettuata utilizzando 150 MBq di [125 I] NaI, acido acetico, e cloramina T a temperatura ambiente per 15 minuti per fornire il prodotto radiomarcato (1). Dopo la purificazione preparativa HPLC della miscela grezza, il prodotto desiderato è stato ottenuto con 75 ± 10% (n = 8) della resa radiochimica. Analytical HPLC ha rivelato che la purezza radiochimica del prodotto 125<...

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Discussion

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In generale, la resa radiochimica osservato del purificato 125 azide I-marcato (1) è stato 75 ± 10% (n = 8). La radiomarcatura è stata compiuta con 50-150 MBq di radioattività, ed i risultati radiochimiche sono abbastanza coerenti. Se [125 I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) sottoposto decadimento radioattivo per più di un mese è stato utilizzato nella reazione radioiodination, la resa radiochimica 1 è stata osservata essere leggermente diminuita (53-65%). ...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni della National Research Foundation of Korea, finanziate dal governo della Repubblica di Corea, (Grant nos. 2012M2B2B1055245 e 2012M2A2A6011335) e dal RI-Biomics Center of Korea Atomic Energy Research Institute.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Cloramina T triidratoSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
Metabisolfito di sodio SigmaS9000
Acido formicoSigma251364
Sep-Pak tC18 più cartucciaAcqueWAT036800
Dimetilsolfossido SigmaD2650
AcetoneSigma650501
EtanoloSigma459844
Cloruro d'oro (III) triidratoSigma520918
Tween 20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5.000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC gel di silice 60 F254Merck
Analytical HPLCAgilent1290 InfinityNumero di modello
HPLC preparativoAgilent1260 InfinityNumero di modello
Colonna analitica C18 a fase inversaAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Colonna preparativa C18 a fase inversaAgilentPrepHT XDB-C18
Scanner TLC radioBioscanAR-2000Numero di modello
Calibratore di dose di radioisotopiCapintec, IncCalibratore di dose CRC -25RNumero di modello

References

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