Messa Istologia per quantificare neurodegenerazione in<em&gt; Drosophila</em

Sommario

Drosophila è ampiamente usato come sistema modello per studiare neurodegenerazione. Questo protocollo descrive un metodo con cui la degenerazione, come determinato dalla formazione vacuolo nel cervello, può essere quantificato. Si riduce anche effetti dovuti alla procedura sperimentale di elaborazione e controllo sezionamento e mosche sperimentali come un campione.

Abstract

malattie neurodegenerative progressive come la malattia di Alzheimer (AD) o malattia di Parkinson (PD) è una crescente minaccia per la salute umana in tutto il mondo. Sebbene i modelli di mammiferi hanno fornito importanti informazioni sui meccanismi alla base della patogenicità, la complessità dei sistemi di mammiferi insieme con i loro alti costi stanno limitando il loro utilizzo. Pertanto, il semplice ma ben consolidata modello di sistema Drosophila fornisce un'alternativa per lo studio dei meccanismi molecolari che sono colpite in queste malattie. Oltre a deficit comportamentali, malattie neurodegenerative sono caratterizzate da fenotipi istologici come la morte neuronale e assonopatia. Per quantificare la degenerazione neuronale e per determinare come esso è influenzato da fattori genetici e ambientali, usiamo un approccio istologico che si basa sulla misurazione dei vacuoli nel cervello mosca adulta. Per ridurre al minimo gli effetti di errore sistematico e di confrontare direttamente le sezioni di controllo e expmosche erimental in una preparazione, si usa il metodo 'collare' per le sezioni di paraffina. Neurodegeneration viene valutata misurando la dimensione e / o il numero di vacuoli che si sono sviluppate nel cervello mosca. Questo può essere fatto sia concentrandosi su una specifica regione di interesse o analizzando l'intero cervello ottenendo sezioni seriali che attraversano la testa completa. Pertanto, questo metodo permette di misurare non solo la degenerazione grave, ma anche fenotipi relativamente lievi che sono rilevabili solo in alcune sezioni, come avviene durante il normale invecchiamento.

Introduzione

Con l'aumento dell'aspettativa di vita, malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer o di Parkinson sono diventati una minaccia per la salute crescente per la popolazione generale. Secondo il National Institutes of Health, 115 milioni di persone nel mondo sono previsti per essere colpiti da demenza nel 2050. Anche se sono stati compiuti progressi significativi per identificare geni e fattori di rischio coinvolti in almeno alcune di queste malattie, per molti di loro, il sottostante meccanismi molecolari sono ancora sconosciuti o non ben compreso.

Semplici invertebrati organismi modello come Caenorhabditis elegans....

Protocollo

1. fissare la testina sui collari e inclusione in paraffina

Nota: Tutte le fasi del processo di fissazione dovrebbe essere fatto in una cappa aspirante. Benzoato di metile, anche se non presentano un rischio per la salute, ha un odore molto distinta, che può essere schiacciante, se non gestita in una cappa aspirante.

1. Prima anestetizzare le mosche, portare 50 mL di soluzione di Carnoy aggiungendo 15 ml di cloroformio e 5 ml di acido acetico glaciale a 30 ml di 99% di etanolo (non mescolare cloroformio e acido acetico). Versare in un contenitore di vetro con un fondo piatto, come un piatto di cristallizzazione, il garantire che i collari possono dist....

Risultati

Utilizzando i risultati metodo descritto in sezioni seriali colorati con l'occhio del pigmento ³³ che comprendono l'intera testa mosca. Una parte di questo è mostrato in Figura 1B, dove le sezioni da una testa individuo sono mostrati dall'alto verso il basso. Le sezioni di diverse mosche sono visti da sinistra a destra in questo esempio. Per facilitare l'orientamento e l'identificazione delle mosche, una mosca senza occhi (Oculis sinuso.......

Discussione

Il metodo descritto fornisce un mezzo per quantificare neurodegenerazione nel cervello di Drosophila. Mentre altri metodi, come conteggio di un tipo di cellula specifico, possono essere utilizzati per identificare neurodegenerazione, il vantaggio di questo metodo è che può essere applicata più in generale. Contare le cellule richiede che queste cellule possono essere identificate in modo affidabile utilizzando un anticorpo specifico o l'espressione di un marcatore specifico per cellule, che non è sempre dis.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente/apparecchiatura Numero di	catalogo		dell'azienda
Collare	Genesee Scientific	TS 48-100	Utilizziamo collari su misura realizzati da un unico pezzo di metallo invece che da strati come quelli di Genesee. Una descrizione su come realizzare i collari può essere trovata su http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Vaschetta per cubetti di ghiaccio in gomma per l'incorporazione	Negozio		La dimensione può essere adattata incollandola in pareti aggiuntive
Piatto di cristallizzazione	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Acido acetico glaciale	Fisher Scientific Company	A38-212
Metilbenzoato	Fisher Scientific Company	M205-500	Odore distinto - Utilizzare in cappa aspirante!
Cera di paraffina a basso punto di fusione	Fisher Scientific Company	T565	Assicurati di mantenere extra sciolto in un 65 ° C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide Fisher	Scientific Company	12-550D
Microscopio Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Tre diversi contenitori per lavaggi
Barattolo di colorazione verticale con Copertina	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Soluzione di poli-L-lisina (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500

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