La conferma di ischemia miocardica e riperfusione nei topi mediante il rilievo della superficie elettrocardiografia

Sommario

Durante l'intervento chirurgico di ischemia/riperfusione miocardica murina, il corretto posizionamento della legatura occlusiva è tipicamente confermato dall'osservazione visibile del pallore miocardico. In questo articolo, un metodo di conferma elettrocardiografica dell'ischemia e della riperfusione, per integrare il pallore miocardico osservato, è dimostrato nei topi maschi C57Bl/6.

Abstract

Molti modelli animali sono stati stabiliti per lo studio del rimodellamento miocardico e dell'insufficienza cardiaca a causa del suo status di prima causa di mortalità in tutto il mondo. Nell'uomo, si forma un'occlusione patologica in un'arteria coronaria e la riperfusione di quell'arteria occlusa è considerata essenziale per mantenere la vitalità del miocardio a rischio. Sebbene essenziale per il recupero del miocardio, la riperfusione del miocardio ischemico crea la propria lesione tissutale. La risposta fisiologica e la guarigione di una lesione da ischemia/riperfusione sono diverse da una lesione da occlusione cronica. Il danno da ischemia/riperfusione miocardica sta guadagnando riconoscimento come modello clinicamente rilevante per gli studi sull'infarto del miocardio. Per questo motivo, i modelli animali paralleli di ischemia/riperfusione sono vitali per far progredire la base di conoscenze sul danno miocardico. Tipicamente, l'ischemia del cuore del topo dopo l'occlusione dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra (LAD) è confermata dal pallore visibile del miocardio al di sotto dell'occlusione (legatura). Tuttavia, questo offre solo un modo soggettivo per confermare il posizionamento corretto o coerente della legatura, poiché ci sono più arterie principali che potrebbero causare pallore in diverse regioni del miocardio. Un metodo di registrazione delle alterazioni elettrocardiografiche per valutare il corretto posizionamento della legatura e la conseguente ischemia e riperfusione, per integrare il pallore miocardico osservato, aiuterebbe a produrre dimensioni coerenti dell'infarto nei modelli murini. A sua volta, questo aiuterebbe a ridurre il numero di topi utilizzati. Inoltre, le alterazioni elettrocardiografiche possono continuare a essere registrate in modo non invasivo in modo tempo-dipendente dopo l'intervento chirurgico. Questo articolo dimostrerà un metodo per confermare elettrocardiograficamente l'ischemia e la riperfusione miocardica in tempo reale.

Introduzione

La malattia di cuore rimane la principale causa di morte nel mondo ^1,2. Non solo il ventricolo sinistro (LV) la camera più muscolare, responsabile per pompare sangue dal cuore al corpo ^3, è un comune sito di lesione cardiaca post-infarto miocardico ^4. la morte dei tessuti del ventricolo sinistro si traduce spesso in insufficienza cardiaca sistolica. modelli animali di malattie cardiache sono di importanza fondamentale per il progresso della ricerca biomedica cardiovascolare. Il C57Bl / 6 ceppo di topi sono stati una scelta popolare per i modelli animali a causa del loro tempo di riproduzione rapida, a basso costo e la facilità di alterazioni genetiche. La maggior parte dei modelli murini chirurgici per lo studio di malattie cardiache comportano occlusione del ramo LAD della coronaria sinistra. Il LAD a volte si chiama sinistra ottusa marginale ^5,6. Il LAD fornisce sangue al anteriore del ventricolo sinistro e le pareti antero-laterale. studi occlusione LAD hanno lo scopo di indurre infarti anteriori, a volte si estende into le regioni della parete inferiore e laterali ^7.

Due modelli che vengono utilizzati di frequente per gli studi con infarto miocardico cronico includono occlusione infarto del miocardio e infarto del danno da ischemia / riperfusione. L'occlusione cronica viene creato chirurgicamente sutura intorno e bloccare in modo permanente il flusso di sangue attraverso il LAD. Il danno da ischemia / riperfusione è creato molto nello stesso modo soltanto con un transitorio, di solito 30-60 min, periodo ischemico. Per raggiungere ischemia transitoria, i legami occlusore sutura intorno alla LAD e un piccolo tubo PE-10 che è posta parallelamente alla LAD sulla superficie epicardica del cuore, seguite da un periodo di riperfusione in cui il tubo e suturare occludere viene rimosso e il sangue è permesso di fluire nuovamente attraverso l'arteria e nel miocardio. L'intervento ischemia / riperfusione è stata considerata clinicamente rilevante a causa della natura del danno da riperfusione in parallelo il trattamento di infarti umani che comprende promangioplastica pt coronarica e stenting dell'arteria, o bypass coronarico. Tipicamente, in questi studi, ischemia del LV in un cuore mouse viene confermata da pallore visibile della parete miocardica. Tuttavia, semplicemente eseguendo la chirurgia su un tappetino elettrocardiogramma (ECG) in condizioni di monitoraggio costante, cambiamenti visibili possono essere osservati nella forma d'onda ECG, confermando così l'ischemia e riperfusione del miocardio mouse.

Sebbene cuore murino è simile al cuore umano in molti aspetti, compresa la sua struttura quattro camere, i cuori hanno anche differenze. Una differenza evidente è il tasso medio cardiaca a riposo di topi adulti è di 600 - 700 battiti al minuto (bpm), mentre quella degli esseri umani adulti è ~ 60-100 bpm ^8,9. Inoltre, nei topi le onde di ripolarizzazione, J e T, spesso si fondono con la depolarizzazione QRS complesso fare una chiara segmento ST difficile da discernere ^10. A complicare il processo di electrocardiographically confermando ischemia miocardica, è l'elevazione del T-wave e il tratto ST che vengono utilizzati come marcatori per la diagnosi di ischemia e lesioni infarto del miocardio negli esseri umani, clinicamente denominato ST e levation m yocardial i nfarction o STEMI. Una delle differenze principali tra le forme d'onda umani e murine è che s-onda è immediatamente seguita essere un J-wave che trasferisce direttamente in un T-onda negativa. Durante ischemia miocardica acuta nel topo l'ampiezza diminuisce S-onda ed è direttamente seguito da un anomalo J-onde e rovesciata dell'onda T ^11. La T-onda non sembra rappresentare una porzione significativa della ripolarizzazione nei topi ^11. Nonostante la nomenclatura e il mouse vs differenze umane, conferma ECG di ischemia miocardica e murino riperfusione è ancora possibile e relativamente semplice. Per motivi di semplificazione interpretazione forma d'onda, il segmento tra SJT è indicato come ST-segment qui.

Linee guida STEMI pubblicati nel 2013 raccomandano una volta il paziente porta a palloncino di meno di 90 min ¹² .Questo significa che il lasso di tempo dall'individuazione di occlusione coronarica del paziente fino a quando l'arteria viene riaperto deve essere inferiore a 90 min. Il cuore pulsante è costantemente al lavoro e quindi, ha un elevato metabolismo ossidativo e un elevato livello di consumo di ossigeno ^3. Per fornire per questo, una rete di capillari è a disposizione di ogni miociti ^3. Ci vuole solo un cuore di un paio di battute di esaurire il suo ossigeno e di nutrienti. In una finestra di 90 minuti, una regione cardiaca ischemica in un essere umano sarà stato bloccato da ricevere tra 5.400 e 9.000 cuore batte la pena di sangue ricco di ossigeno. In quella stessa finestra di 90 minuti, un topo avrebbe 54.000 a 63.000 battiti cardiaci. punti temporali sperimentali per murino danno da ischemia / riperfusione sono in genere tra i 30 ei 60 minuti.

L'importanza di sviluppareing un metodo supplementare di conferma ischemia miocardica e riperfusione in un modello murino ha profonde implicazioni sulla consistenza e la riproducibilità dei dati in studi ischemia / riperfusione miocardica. La prassi attuale di osservare visivamente il cuore per un cambiamento di colore del tessuto non è adeguata come uno stand-alone diagnostica. Inoltre, riperfusione dopo la rimozione del tubo e di sutura non è garantita. Anche se l'arteria non è più legato al largo, l'arteria può avere danni subiti durante la procedura e potrebbe diventare impossibile reperfuse. Sarebbe utile avere un record di alterazioni elettrocardiografiche per confermare la riperfusione piuttosto che basarsi su osservazioni di pallore miocardica e rubor (colore rosso). Cuori che non mostrano i marcatori di danno da ischemia / riperfusione possono rapidamente essere contrassegnati e una decisione su come procedere possono essere effettuate dagli investigatori.

Infine, stabilendo un record di ECG variazioni rispetto al basale in tutta °e periodi di ischemia e di riperfusione consente agli investigatori di continuare a monitorare il cuore dopo l'intervento iniziale. Gli investigatori attualmente perdono di vista cuore non appena l'operazione è completata. ECG è un modo semplice per ottenere informazioni sui cambiamenti che si verificano nelle ore miocardio per giorni dopo l'intervento chirurgico. ECG registrato in momenti dopo l'intervento chirurgico potrebbe rivelare onde Q tardo-sviluppo che indica continuato o peggioramento morte del tessuto. Tuttavia, per gage in modo efficace nuovi o peggioramento marcatori elettrocardiografici, un ECG basale deve essere disponibile per il confronto.

Questo protocollo dimostrerà come preparare, ottenere e interpretare l'ECG per confermare ischemia e riperfusione del cuore mouse utilizzando 8-12 settimane vecchio maschio topi C57BL / 6.

Protocollo

Tutti gli interventi chirurgici eseguiti sugli animali devono essere effettuati in conformità con Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio ¹³ o altre linee guida etiche del caso. I protocolli devono essere approvati dal comitato di benessere degli animali presso l'istituzione appropriata prima di procedere.

1. Preparazione per l'ECG

NOTA: Prima di iniziare, don dispositivi di protezione individuale compresi i guanti, occhiali e un camice da laboratorio pulito o abito usa e getta.

1. Pulire il pad ECG utilizzando un non-alcol e soluzione di decontaminazione basata non candeggina. usare delicatamente un compito delicato wipe per cancellare off soluzione in eccesso al fine di garantire che il pad elettrodo non venga danneggiato.
2. Se il pad ECG ha una funzione di riscaldamento, usarlo. topi anestetizzati tendono a perdere il calore del corpo rapidamente. Riscaldare il pad per 40-42 ° C per mantenere la temperatura corporea normotermico di 37 ° C in tutta la chirurgia ^14. Monitorare temperamento corpotura con un termometro rettale. Regolare la temperatura pad come necessario per mantenere la temperatura corporea ~ 37 ° C.
3. Poiché la maggior parte toracotomia vengono eseguiti con il mouse sdraiato sulla schiena (supina), assicurarsi che l'interruttore è capovolto per l'impostazione "supina". Molti i rilievi ECG hanno una funzione per passare da posizione prona e supina. La mancata selezionare l'orientamento giusto può portare a false dichiarazioni di eventi elettrocardiografici.
4. Anestetizzare mouse utilizzando 5% isoflurano inalato e 1 L / min di ossigeno. Una volta che il mouse è anestetizzato, trasferimento mouse pad ECG dotato di una anestesia naso-cono e ridurre isofluorano al 2% e 1 L / min di ossigeno. Verificare il corretto anestesia garantendo il mouse non reagisce quando il piede del mouse viene pizzicato con una pinza.
5. Applicare uno strato sottile di lubrificazione dell'occhio pomata sopra gli occhi del mouse per prevenire la secchezza e danni alla cornea, mentre anestetizzato.
6. Pulire le zampe del mouse con un panno umido per pulire per rimuovere tutte le lenzuola visibileche può essere attaccato alle zampe o possono interferire con la trasmissione degli impulsi elettrici dalle zampe al pad ECG. zampe a secco con un wipe.
7. Applicare una piccola quantità (leggermente più piccolo di una monetina USD) di gel elettrolitico altamente conduttivo a ciascuno dei quattro elettrodi metallici sul pad ECG.
   Nota: Assicurarsi di applicare solo una piccola quantità di gel, come troppo gel rende difficile frenare le zampe al pad con del nastro. Inoltre, le zampe sono suscettibili di scivolare fuori del sistema di ritenuta durante l'intervento chirurgico se fossero bagnati prima di applicare il nastro.
8. Con il mouse in posizione supina, utilizzare nastro medico chiaro a frenare ogni zampa al suo corrispondente elettrodo (Figura 1). Prima premere ogni zampa al suo pezzo di nastro adesivo e poi aderire il nastro al pad ECG. Assicurarsi che ogni zampa trattenuto è in contatto con il gel elettrolita e l'elettrodo.

2. Acquisizione dell'ECG

1. A seconda del materiale utilizzato per l'acquisizione ECG, confIGURA macchina in modo che la forma d'onda ECG può essere visualizzata in tempo reale. Per le registrazioni ECG utilizzando le impostazioni di monitoraggio fisiologici su una macchina ecocardiografia un'immagine B-mode vivo avrà la forma d'onda ECG corre lungo la parte inferiore dello schermo.
   Nota: vedere le singole guide per l'utente della macchina per determinare il modo migliore per configurare tali apparecchiature.
2. Attiva visualizzazione in tempo reale della forma d'onda ECG premendo il tasto B-mode su una macchina ecocardiografia o l'equivalente su altri dispositivi di registrazione ECG.
   1. Regolare la risoluzione per tenere conto di differenze di ampiezza. Se il picco del R-onda o trogolo (valle) del Q-wave sono fuori della cornice visiva, regolare la risoluzione fino può osservare l'intera altezza della forma d'onda.
      Nota: Questo può essere fatto nella scheda Impostazioni fisiologici su una macchina ecocardiografia. Fare clic sul aumentare o diminuire le frecce fino a quando l'intera forma d'onda è visibile.
3. Ogni volta che un'immagine deve essere obtained, cancellare il pad ECG di strumenti. Toccando il mouse durante la registrazione ECG con una pinza o le dita disturberà la forma d'onda. Assicurarsi che il mouse è ancora intatta e sul blocco di ECG prima di registrare qualsiasi ECG.
4. Utilizzare "record" della macchina o la funzione "store" prima di apportare eventuali incisioni chirurgiche sul mouse. Questa immagine verrà utilizzata come base per il confronto seguito.

3. Procedura chirurgica e registrazione ECG

1. Iniettare topo anestetizzato con effetto analgesico (buprenorfina, 1,5 mg, intraperitoneale) prima di cominciare. I dettagli della ischemia / riperfusione procedura chirurgica si possono trovare anche altrove ^5.
2. Rimuovere i capelli intorno al sito chirurgico chimicamente o meccanicamente e disinfettare la zona con una soluzione di Betadine. Utilizzare un bisturi per fare un'incisione verticale parallelo al esofago e trachea. spostare delicatamente i linfonodi ad ogni lato dell'incisione finché il tessuto sottile che copre la trachea èesposto. Utilizzando pinze, separare delicatamente il tessuto fino a quando gli anelli di cartilagine bianchi della trachea sono visibili.
   Nota: Usiamo generalmente Nair lozione per la depilazione. La lozione è applicata sul sito chirurgico per ~ 1 min. Nair viene poi accuratamente lavato via con soluzione salina o acqua. Questo metodo è preferito nel nostro laboratorio per alta risoluzione ecocardiografia (che può rilevare follicoli piliferi) viene eseguita prima e dopo la chirurgia. Tuttavia, si deve usare cautela per evitare le zone sensibili come i genitali, e poi lavando a fondo il Nair off per evitare potenziali ustioni cutanee.
3. Rimuovere rapidamente il naso del mouse dal naso-cono e inserire tubi di ventilazione nella bocca del mouse e verso la gola. Quando la punta del tubo di ventilazione è visibile attraverso l'area collo esposto, allineare il tubo con l'inizio della trachea. muovere delicatamente il lato tubi a lato, mentre l'applicazione di una pressione al rialzo fino a quando le diapositive tubo nella trachea, che può essere confermato visivamente tttraverso la trachea traslucido.
4. Assicurarsi che il mouse rimane anestetizzato durante la procedura di intubazione. Pausa da intubazione e tornare il mouse per il naso a cono se comincia a muoversi.
5. Utilizzando un ciclo di corda, agganciare due denti anteriori del mouse attraverso l'anello e il nastro la stringa termina al pad ECG per stabilizzare la testa del mouse e per assicurare il tubo di ventilazione non si muove durante l'intervento chirurgico. collegare rapidamente tubo di ventilazione per roditori ventilatore e regolare le impostazioni di ventilazione secondo il peso del mouse. Nastro tubi di ventilazione sul posto.
6. Coprire la trachea esposto del mouse con una garza imbevuta di soluzione salina calda per mantenere il tessuto si secchi.
7. Effettuare una incisione verticale utilizzando un bisturi lungo il lato sinistro dello sterno.
8. Utilizzando pinze, separare delicatamente lo strato fascia dallo strato muscolare. Asportare accuratamente gli strati muscolari sottostanti senza tagliare i vasi sanguigni visibili.
9. Utilizzando pinze, afferrare la terza costola e tirareverso l'alto delicatamente. Mantenere la presa sulla nervatura con una mano e usare le forbici chirurgiche per tagliare accuratamente il tessuto intercostale tra la terza e quarta costola. Assicurarsi che i polmoni non sono danneggiati.
   Nota: I polmoni si ritrae in profondità nella cavità toracica quasi immediatamente dopo la cavità toracica è perforato dalla incisione chirurgica a causa della perdita del gradiente di pressione. Attendere fino a quando i polmoni hanno ritrattato prima di continuare.
10. Utilizzare pinze per afferrare e delicatamente separare il sottile strato di pericardio che circonda il cuore.
11. Inserire divaricatori o utilizzare manualmente pinze come divaricatori costali per spostare le costole in una posizione in cui il cuore è visibile tra le costole.
    Nota: E 'pratica comune per spostare zampa inferiore sinistro del mouse in modo che si sovrappone zampa inferiore destro durante il posizionamento della legatura. Questo aiuta a posizionare il cuore in modo che l'appendice atriale sinistra, o padiglione auricolare, è facilmente visibile durante il posizionamento della legatura. Essere consapevoli che valida ECG waveforms non verranno ottenute mentre la zampa inferiore sinistra è spento dell'elettrodo. Per questo motivo è consigliabile riportare la zampa al suo elettrodo dopo la legatura sutura viene fatta passare attraverso il tessuto miocardico ma prima un nodo viene serrato.
12. Individuare il LAD visivamente, sotto il padiglione auricolare sinistro. inserire rapidamente un 7-0 di seta affusolato l'ago di sutura nel miocardio abbastanza profondamente per passare sotto il LAD ma non così profondo come per penetrare la cavità ventricolare sinistra. Estrarre la legatura sutura attraverso finché non ci è di circa 4 cm di sutura di seta lasciata alla libera (non-ago) fine della legatura sutura.
13. Inizia a legare un nodo semplice sutura. Una volta che l'estremità libera della seta sutura è stato tirato attraverso i passanti per formare il nodo, pausa.
14. Tenendo entrambe le estremità libere e aghi di seta sutura con una pinza, inserire una sezione ~ 1 cm di PE-10 tubo sotto il nodo che forma e in cima alla superficie epicardico.
15. Se zampa sinistra del topo è attraversato, restituire la zampa al suo proogni elettrodo. Serrare nodo in modo che il tubo PE-10 viene suturata al cuore. Rilasciare ogni contatto fisico con il mouse per consentire ECG da registrare.
16. Lasciare la forma d'onda ECG per scorrere per ~ 10 sec. Controllare la forma d'onda ECG visivamente e registrare la forma d'onda come "Time di occlusione". Se l'onda T non aumenta in ampiezza entro 1 minuto, rivalutare posizionamento di legatura.
    1. Se l'ampiezza dell'onda T non aumenta, né scartare l'animale dallo studio o tentare di correggere il posizionamento legatura.
17. Controllare visivamente il colore del miocardio ischemico per confermare la palizzata del ventricolo sinistro.
18. Se le modifiche ECG e cambiamenti di colore del miocardio indicano ischemia, doppio nodo della sutura attorno al tubo in PE-10.
19. Coprire la cavità toracica aperta con caldo garza salina.
20. Record ECG ogni 5-10 minuti per la durata del periodo ischemico.

4. Conferma della riperfusione Utilizzando ECG

1. Rimuovere salina garza Covesuonare la cavità toracica e visualizzare il cuore.
2. Utilizzare una lama per tagliare la seta sutura cima al tubo PE-10. Una volta che la legatura viene tagliata, rimuovere la sezione di tubo PE-10 e rimuovere delicatamente la legatura sutura dal miocardio.
3. Rilasciare ogni contatto fisico con il mouse e consentire la forma d'onda ECG ~ 10 sec a ciclo. Record forma d'onda come "Il tempo di riperfusione." Continuare a registrare forme d'onda ECG ogni 5-10 minuti fino a raggiungere il punto di tempo sperimentale desiderato.
4. Modifica risoluzione per i cambiamenti nella ampiezza a seconda delle necessità. Se l'onda T non cambia dopo la rimozione del tubo PE-10 e la legatura, riperfusione non è confermata.
   1. Se l'onda T non cambia dopo la rimozione del tubo, o scartare l'animale dallo studio o tentare di correggere il posizionamento legatura.
5. Visivamente miocardio per confermare ulteriormente riperfusione dal ritorno al colore rosso.
6. Chiudi cavità toracica da sutura spazio intercostale con un 5-0sutura di seta mentre applicando una leggera pressione al torace del mouse per espellere l'aria in eccesso che è entrato durante l'intervento chirurgico. Poi suturare gli strati muscolari e, infine, la pelle. Nota: Applicando pressione alla cavità toracica potrebbe essere sufficiente a evacuare la cavità toracica dell'aria in tutti i topi. Pertanto, il metodo siringa e l'ago di evacuazione dovrebbe essere impiegato per assicurare che tutta l'aria è stata espulsa.
7. Registrare l'ultimo ECG prima di anestesia per via inalatoria e per asportare le zampe del topo dagli elettrodi. Aumentare l'ossigeno a 2 L / min e mantenere la ventilazione fino a quando il mouse riprende conoscenza.
8. Lasciare il mouse per recuperare in un ambiente a temperatura controllata costante, ad esempio, piastra elettrica o incubatore caldo, per evitare la variabilità infarto. Trattare mouse con buprenorfina 24 ore dopo l'intervento chirurgico e poi, se necessario, come indicato dalla scala del mouse smorfia.
   Nota: Procedura per la riperfusione è anche discusso in dettaglio da Xu et al ^5.

Risultati

Un ECG murino normale viene visualizzato in figura 2 con i marcatori alfabetici per eventi elettrici P, Q, R, S, J e T. P è la depolarizzazione atriale iniziale. QRS è l'onda di depolarizzazione delle sopra i ventricoli. J è ripolarizzazione precoce e T rappresenta la ripolarizzazione eterogenea noto anche come recupero ^11. Va notato che molti laboratori non utilizzano la nomenclatura J-wave e invece riferimento alla SJT-segmento del segmento ST ^10,15...

Discussione

Usando i cambiamenti ECG come metodo supplementare per confermare ischemia miocardica e riperfusione assicura il posizionamento preciso della legatura occlusione. La precisione di posizionamento legatura è fondamentale per ridurre la variabilità dei dati tra gli animali. Il LAD in un cuore mouse è un'arteria difficile da visualizzare. Pertanto, l'integrazione pallore visivo con alterazioni elettrocardiografiche aiuterà a garantire il corretto posizionamento del danno tissutale legatura e conseguente.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vevo 1100	Fujifilm Visual Sonics		Ecocardiografia
Macchina Mouse Piastra per la manipolazione del mouse	Fujifilm Visual Sonics		Piastra ECG riscaldata
Signa-Gel			Altamente conduttivo Multi-elettrodo
Gel	Parker	15-25	Purpose Electrolyte
Transpore Medical Tape	3M	1527-0
PI-Spray II	Innovazioni farmaceutiche	NDC 36-2013-25	Agente di pulizia per piastra ECG
C57Bl6 Topi	The Jackson Laboratory	000664	Maschio, 8 - 12 settimane
IsoThesia-Isoflurane	Henry Schein	NDC 1169-0500-1
Excel	Microsoft
Systane Lubrificante notturno Unguento per gli occhi	Alcon	65050935
7-0 Suture di seta Perma-Hand	Ethicon	640.O32
5-0 Suture di seta Perma-Hand	Ethicon	K809. Forbici chirurgiche O32
	ROBOZ	RS-5881
Pinze	Strumenti di scienza fine	11052-10
Garza	Bio Nuclear Diagnostics Inc	DIS-022B
Porta aghi	Strumenti di scienza fine	12565-14
Buprenex CIII	Patterson Veterinary	0-891-9756	Buprenorfina cloridrato analgesico
Prodotti Betadine	Purdue	67618-150-08
Nair	Church e Dwight Co.	NRSL-22339-05