I biofilm sulle superfici possono essere rimossi in modo efficace e rapido utilizzando un getto periodico di aerosol di anidride carbonica senza uno spurgo di azoto.
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Articolo metodologico
La rimozione biofilm utilizzando spray di anidride carbonica senza azoto Purge
In questo articolo
Sommario
Abstract
I biofilm possono causare seri problemi in molte applicazioni. Non solo possono causare perdite economiche, ma possono anche rappresentare un pericolo per la salute pubblica. Pertanto, è altamente desiderabile rimuovere i biofilm dalle superfici. Molti studi sulla pulizia con aerosol di CO2 hanno impiegato spurghi di azoto per aumentare l'efficienza di rimozione del biofilm riducendo la condensa di umidità generata durante la pulizia. Tuttavia, in questo studio, sono stati utilizzati getti periodici di aerosol di CO2 senza spurghi di azoto per rimuovere i biofilm di Pseudomonas putida dalle superfici lucidate dell'acciaio inossidabile. Gli aerosol di CO2 sono miscele di CO2 solida e gassosa e vengono generati quando il gas CO2 ad alta pressione viene espanso adiabaticamente attraverso un ugello. Questi aerosol ad alta velocità sono stati applicati a un biofilm che era stato coltivato per 24 ore. L'efficienza di rimozione variava dal 90,36% al 98,29% ed è stata valutata misurando l'intensità di fluorescenza del biofilm al variare del tempo di trattamento da 16 sec a 88 sec. Abbiamo anche eseguito esperimenti per confrontare le efficienze di rimozione con e senza spurghi di azoto; Le efficienze di rimozione del biofilm misurate non erano significativamente diverse l'una dall'altra (T-test, p > 0,55). Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata per pulire varie superfici biocontaminate in un minuto.
Introduzione
I biofilm sono strutture complesse di comunità batteriche in cui le cellule batteriche sono incorporate all'interno di matrici autoprodotte di sostanze polimeriche extracellulari, tenute insieme e protette dall'ambiente esterno. I biofilm possono rappresentare un rischio per la salute pubblica e causare perdite economiche perché possono formarsi su varie superfici, inclusi materiali e dispositivi per impianti medici, apparecchiature per la lavorazione degli alimenti e scambiatori di calore. In effetti, è stato scoperto che i biofilm sono associati al 65% di tutte le malattie infettive batteriche nell'uomo, secondo i Centers for Disease Control and Prevention1.
Autoclavi e disinfettanti come il cloro sono stati generalmente utilizzati per l'inattivazione dei biofilm. Tuttavia, l'uso di un'autoclave è limitato per le superfici che non possono resistere al vapore ad alta temperatura né essere inserite nell'autoclave. I disinfettanti non sono adatti per superfici sensibili ai trattamenti chimici o inclini a raccogliere prodotti di ossidazione tossici2. Inoltre, il biofilm non solo deve essere inattivato, ma anche rimosso per evitare l'adesione di nuove cellule sulla superficie, formando così un nuovo biofilm3. Tuttavia, è difficile rimuovere i biofilm utilizzando metodi basati sul taglio di fluidi viscosi perché la velocità del flusso vicino alla superficie è quasi nulla e la forza di taglio di solito non può superare le forze adesive di sostanze di dimensioni micron e submicron. Inoltre, è noto che la matrice del biofilm funge da barriera fisica e chimica1.
Sono state sviluppate molte tecniche fisiche e meccaniche per rimuovere i biofilm dalle superfici, tra cui la vibrazione ultrasonica1, le correnti elettriche4, l'irradiazione laser5 e gli spruzzi d'acqua ad alta pressione6. Ogni tecnica ha i suoi pro e contro. La vibrazione ultrasonica e la corrente elettrica possono essere utilizzate per controllare la formazione di biofilm; Tuttavia, richiedono rispettivamente una particolare configurazione e superfici conduttive, che richiedono uno sforzo di taglio aggiuntivo1, 4. L'irradiazione laser può essere applicata su un'area limitata e su superfici dure; Tuttavia, alcune cellule vive e morte rimangono sulla superficie5. Gli spruzzi d'acqua ad alta pressione rimuovono efficacemente i biofilm; Tuttavia, il loro elevato slancio può causare danni ai substrati morbidi6.
La rimozione del biofilm utilizzando aerosol di CO2 è stata precedentemente proposta. Ha mostrato risultati promettenti, con elevate efficienze di rimozione in breve tempo7-11. Gli aerosol di CO2 sono generati dall'espansione adiabatica di un gas CO2 ad alta pressione attraverso un ugello e vengono applicati sulle superfici contaminate da un biofilm. Questa tecnica di pulizia utilizza il trasferimento di quantità di moto delle particelle solide di CO2 e l'azione solvente dei liquidi CO2 fusi, seguiti dalla forza di taglio aerodinamica del gas CO2 12. Rispetto ai getti di gas N2 ad alta pressione, i getti di aerosol di CO2 alla stessa pressione di ristagno sono molto più efficaci nella rimozione dei biofilm di E. coli 7. Inoltre, sebbene la quantità di moto della CO2 solida che viene fornita ai batteri sia considerevolmente elevata, la quantità di moto del getto di aerosol totale applicato alla superficie solida è sostanzialmente inferiore a quella dei getti d'acqua. Pertanto, è possibile una pulizia senza danni utilizzando questa tecnica di aerosol di CO2.
In questo protocollo, sono stati utilizzati getti periodici di aerosol di CO2 senza spurghi di azoto per rimuovere i biofilm di Pseudomonas putida da una superficie di acciaio inossidabile lucidato. Infatti, gli spurghi di azoto sono stati utilizzati in molti studi sugli aerosol di CO2 per aumentare l'efficienza di rimozione riducendo la condensa di umidità generata durante la pulizia, anche se sono stati adottati anche il riscaldamento con una piastra riscaldante o lampade a infrarossi e l'impiego di scatole asciutte12. Di seguito sono descritte la formazione del biofilm superficiale e le procedure di pulizia ottimizzate. L'efficienza di rimozione è stata valutata misurando l'intensità di fluorescenza del biofilm sulla superficie.
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Protocollo
1. Preparazione della superficie per formazione di biofilm
- Cut 1 mm di spessore 304 piastre in acciaio inox in chip (10 × 10 mm 2) con una fresa meccanica.
- Effettuare la pulizia ad ultrasuoni delle chips in acetone, metanolo, e deionizzata (DI) in sequenza per 10 minuti ciascuno. Utilizzare un contenitore resistente ai solventi, fatta di sostanze come il vetro, per eliminare la contaminazione biologica.
- Sciacquare i chip con acqua corrente per 3-5 DI sec.
- Asciugare i chip utilizzando il flusso di gas N 2 per 3-5 sec.
2. Preparazione di coltura batterica
- Prendete un P. putida KT2440 (gentilmente fornito dal Prof. Sung Kuk Lee, UNIST, Corea del Sud) stock memorizzato in un -80 ° C deep-freezer.
- Scongelare a temperatura ambiente dopo 1 minuto, e lo strato superiore della soluzione madre congelato si trasforma in fanghiglia. Immergere un loop nello strato fuso della soluzione di riserva.
- Utilizzare questo ciclo per striscia i batteri su una Luria-Bertani Piastra (LB) contenente 1,5% agar.
- Incubare la piastra per una notte a 30 ° C per crescere le colonie batteriche.
- Scegliere una singola colonia dalla piastra utilizzando un ciclo fresco.
- Seminare 10 ml di brodo LB in una provetta conica da 50 ml con il ciclo contenente la singola colonia batterica.
- Incubare il brodo in un incubatore agitazione per 16 ore a 30 ° C e 160 rpm.
3. formazione di biofilm sulla superficie
- Raccogliere ciascuno dei chip preparati con le pinzette e di immergere in etanolo al 70% 5 volte per 1-2 secondi ciascuno, per sterilizzare la superficie di ogni chip. Assicurarsi che i chip si svolgono con una pinzetta durante l'immersione.
- Immergere ogni chip in acqua deionizzata autoclavato e in brodo LB in sequenza, 5 volte per 1-2 secondi ciascuna, per rimuovere residuo di etanolo.
- Mettere questi chip in piastre di coltura 6 pozzetti con 2 chip e 5 ml di brodo LB per pozzetto.
- Diluire la coltura batterica fino a quando la concentrazione nel tratto brodo LB8 × 10 8 cellule / ml (densità ottica a 600 nm di lunghezza d'onda: ~ 0,8).
- Inoculare ogni pozzetto con 50 ml di coltura batterica diluito.
- Incubare le piastre a 30 ° C senza agitazione per 24 ore per la formazione di biofilm.
Pulizia 4. CO 2 Aerosol
- Immergere il chip biofilm formati in 10 mM tampone di acetato di ammonio (volatili) 5 volte per rimuovere vagamente attaccate e batteri planctonici.
- Asciugare questi chip in un armadio biosicurezza, dove l'aria scorre dolcemente.
- Subito dopo l'essiccazione, collocare un chip sul luogo di carico, che è 20 mm dall'ugello CO 2 lungo l'asse del getto. Inclinare l'asse del getto ad un angolo di 40 °.
- Impostare la pressione totale di CO 2 e N 2 gas a 5,3 MPa e 0,7 MPa, rispettivamente impiegando regolatori di gas a pressione.
- Applicare il getto di aerosol sulla parte centrale del chip. Aerosol bianchi tra cui la CO 2 dovrebbe solidoessere visibile. Turn "on" l'elettrovalvola per CO 2 per 5 secondi, e poi girarla "off" per 3 secondi (ciclo: 8 sec) periodicamente tramite un interruttore controllato manualmente. Se un flusso di azoto deve essere utilizzato, attivare l'elettrovalvola di alimentazione continua di N 2.
- Trattare i chip con CO 2 aerosol per 16, 40, e 88 sec con e senza purghe azoto. Conservare chip senza trattamento come controlli negativi.
5. Analisi per la rimozione efficienza
- Preparare 1 micron di fluorescenza nucleico verde acido macchia (lunghezza d'onda di eccitazione / emissione: 480/500 nm) in acqua deionizzata per colorare le cellule batteriche in materia di controllo e patatine aerosol-trattata.
- Mettere le fiches nel soluzione colorante.
- Incubare i chip in un incubatore senza luce a 37 ° C per 30 min.
- Dopo l'incubazione, lavare delicatamente i chip con acqua corrente per eliminare DI colorante fluorescente eccessivo.
- Asciugare il chip with flusso di gas N 2.
- Prendere fluorescenza immagini microscopiche di 5 campi aleatori di vista (321 × 240 micron 2) per ogni chip utilizzando un microscopio a epifluorescenza, una lente obiettivo 40X, e una camera CCD.
- Ottenere l'intensità di fluorescenza per ogni immagine utilizzando un software di elaborazione delle immagini, come ImageJ. In ImageJ, utilizzare la funzione "Background Sottrarre" nel menu "Azione", e selezionare "densità integrata" nella finestra "Set misure" nel menu "Analizza". Fare la "misura" nel menu "Analizza" per ottenere l'intensità di fluorescenza.
- Calcolare l'efficienza di rimozione biofilm secondo la seguente formula: 100% × (I chip di controllo - I chip trattati) / (I chip di controllo), dove I è l'intensità di fluorescenza calcolato.
- Ottenere la media efficienze di rimozione e le deviazioni standard. L'uso adalmeno 4 chip per ciascun caso.
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Risultati
CO 2 aerosol sono stati usati per rimuovere la P. putida biofilm da SUS304 superfici (Figura 1). La maggior parte delle superfici sono state coperte con il biofilm dopo 24 ore di crescita. La maggior parte del biofilm è stato rimosso utilizzando il CO 2 aerosol (Figura 2). Come previsto, la figura 3 mostra un aumento dell'efficienza di rimozione biofilm come il CO 2 tempo di trattamento aerosol aumentato. Per il tempo di tra...
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Discussione
In precedenza, abbiamo condotto studi di ottimizzazione sulla pressione del gas CO2 , sull'angolo del getto e sulla distanza dalla superficie solida nella pulizia con aerosol di CO2 7. A differenza dei nostri studi precedenti, nel presente studio, uno spurgo di azoto non è stato incluso nell'aerosol (Figura 1). Inoltre, in questo protocollo è stato utilizzato l'acciaio inossidabile 304, poiché è uno degli acciai inossidabili più comuni ed è ampiamente utilizzato nell'indu...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata dal Programma di Ricerca Scientifica di Base attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal Ministero della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura (# 2015R1A2A2A01006446).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acciaio inossidabile 304 | Steelni (Corea del Sud) | Lucidato e tagliato a cubetti | |
| Pulitore ad ultrasuoni | Branson (USA) | 5510E-DTH | |
| Luria-Bertani (LB) | Becton, Dickinson and Company (USA) | 244620 | 500 g |
| Agar | Becton, Dickinson and Company (USA) | 214010 | 500 g |
| 6 pozzetti piastra di coltura | SPL Life Sciences (Corea del Sud) | 32006 | |
| Tampone acetato di ammonio | Sigma-Aldrich (USA) | 667404 | 10 mM |
| Unità a doppio gas | Applied Surface Technologies (USA) | K6-10DG | Un ugello per CO2 gas e 8 ugelli per gas N2 |
| SYTO9 | Thermo Fissher Scientific (USA) | Eccitazione Invitrogen | : 480 nm Emissione: 500 nm |
| Microscopio a epifluorescenza | Nikon (Giappone) | Obiettivo Eclipse 80i | |
| 40X | Nikon (Giappone) | Plan Fluor | NA: fotocamera CCD da 0,75 |
| Fotometria (USA) | Cool SNAP HQ2 | Monocromatico |
Riferimenti
- Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
- Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
- Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
- Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
- Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
- Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
- Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
- Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
- Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
- Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
- Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
- Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).
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