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Articolo metodologico

Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione

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DOI:

10.3791/54849

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1 febbraio 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Hepatitis and Immunology, National Center for Global Health and Medicine, 2Central Pharmaceutical Research Institute, Japan Tobacco Inc.

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive un virus dell'epatite B recentemente sviluppato (HBV) sistema reporter per monitorare le prime fasi del ciclo di vita HBV. Questo semplificata nel sistema vitro sarà di aiuto nella proiezione di agenti anti-HBV utilizzando una strategia ad alto rendimento.

Abstract

Attualmente, è possibile costruire forme ricombinanti di vari virus, come il virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) e il virus dell'epatite C (HCV), che trasportano geni estranei come una proteina reporter o marcatore nei loro genomi. Questi virus ricombinanti di solito imitano fedelmente il ciclo di vita del virus originale nelle cellule infette e mostrano la stessa dipendenza dalla gamma di ospiti. Lo sviluppo di un virus ricombinante consente lo screening efficiente degli inibitori e l'identificazione di specifici fattori dell'ospite. Tuttavia, fino ad oggi la costruzione del virus dell'epatite B ricombinante (HBV) è stata difficile a causa di varie limitazioni sperimentali. La limitazione principale è la dimensione compatta del genoma dell'HBV e una dimensione del genoma abbastanza rigorosa che non supera le dimensioni di 1,3 del genoma, che deve essere impacchettata in virioni. Pertanto, la dimensione di un gene estraneo da inserire dovrebbe essere inferiore a 0,4 kb se non deve essere eseguita alcuna delezione del DNA del genoma. Pertanto, per superare questa limitazione dimensionale, è necessaria la delezione di un po' di HBV DNA. Qui, riportiamo la costruzione di HBV ricombinante che codifica un gene reporter per monitorare la fase iniziale del ciclo di replicazione dell'HBV sostituendo parte della regione codificante il core dell'HBV con il gene reporter eliminando parte della regione codificante il pol dell'HBV. L'individuazione dell'infezione da HBV ricombinante, monitorata dall'attività reporter, è risultata altamente sensibile e meno costosa rispetto all'utilizzo dei metodi convenzionali attualmente disponibili per valutare l'infezione da HBV. Questo sistema sarà utile per una serie di applicazioni, tra cui lo screening ad alto rendimento per l'identificazione di inibitori anti-HBV, fattori dell'ospite e cellule sensibili al virus.

Introduzione

L'infezione cronica da virus dell'epatite B (HBV) è un importante fattore di rischio per le malattie croniche del fegato 1. Sebbene strategie terapeutiche attuali si basano su analoghi nucleotidici che inibiscono la funzione HBV pol e / o la somministrazione di tipo I interferon che attiva risposte immunitarie negli individui infetti nonché indirettamente sopprimere la proliferazione HBV attraverso funzioni genici stimolati 2, questi trattamenti non possono eliminare HBV DNA completamente 3. Inoltre, l'emergere di HBVs che sono resistenti agli agenti anti-Pol è di preoccupazione 4. La somministrazione di agenti anti-virali combinati rivolti direttamente le varie fasi del virus dell'immunodeficienza umana (HIV) o il ciclo di vita del virus dell'epatite C (HCV) è stato dimostrato che sopprimere o eliminare il virus (es) con successo. Simile a questa idea, lo sviluppo di anti-HBV agent (s) che agiscono direttamente sulle diverse fasi di HBV ciclo di vita è importante per stabilire le future terapie HBV.

In generale, la creazione di un semplice sistema di coltura in vitro del virus destinazione facilita lo sviluppo di agenti anti-virus. Tuttavia, ci sono almeno due ostacoli allo sviluppo di sistemi di coltura in vitro per lo screening agenti anti-HBV. La prima è la mancanza di una comoda vitro sistema di coltura cellulare a HBV / proliferazione. A differenza di altri virus, come l'HIV e HCV, che si propagano in linee cellulari stabilizzate, è difficile da coltivare HBV in vitro a causa delle limitazioni sperimentali compresa una gamma ristretta ospitante. L'uso di sistemi di coltura cellulare specifici quali la linea di cellule di epatoma umano HepaRG, che è suscettibile di infezione da HBV, 5, 6, 7 sono state sviluppate per superare questi problemi. Inoltre, le cellule PXB, isolate da urochinasi-tyPE attivatore del plasminogeno transgenici / topi SCID inoculati con primari epatociti umani (PHH), hanno dimostrato di essere suscettibili di infezione da HBV e la replicazione 8. Tuttavia, i livelli di replicazione dell'HBV in HepaRG dipendono dallo stato differenziazione cellulare dopo la cultura, che può causare risultati incoerenti e non riproducibili su livelli di infezione / replicazione dell'HBV. PXB è comunemente utilizzato per esperimenti di infezione da HBV, ma è limitata dalla sua disponibilità. Una linea di cellule espressione inducibile HBV tetraciclina, HepAD38, è stato ampiamente utilizzato per studiare la replicazione dell'HBV, ma questo sistema consente solo di valutazione dopo la trascrizione e non al passo ingresso di infezione da HBV 9. Recentemente, l'identificazione di sodio taurocolato cotransporting polipeptide (NTCP) come un recettore funzionale per HBV ha consentito lo sviluppo di un sistema di coltura variabile di HBV 10. In effetti, l'espressione NTCP in cellule di epatocarcinoma non sensibili, come Huh7 eHepG2 consente HBV 10 e, quindi, la scelta delle linee cellulari sensibili HBV è stata ampliata, risolvere molti dei limiti sperimentali. Il secondo problema è la mancanza di un semplice sistema di test per valutare HBV e la replicazione. Valutazione della HBV è solitamente condotta analizzando HBV DNA, RNA e proteine. Tuttavia, la quantificazione di questi marcatori virali è che richiede tempo, spesso costosi e non sempre semplice. Pertanto, lo sviluppo di un semplice sistema di analisi, ad esempio utilizzando un gene reporter, potrebbe superare i problemi associati ai sistemi di dosaggio HBV.

Tuttavia, poiché la dimensione del genoma che può essere confezionato in un capside HBV è limitata - meno di 3,7 kb 11 - la dimensione di un gene reporter deve essere il più breve possibile. Inoltre, la presenza di più elementi cis sparsi in tutto il genoma, che sono essenziali per la replicazione virale, limita le posizioni disponibili dal serimento del gene reporter nel genoma. Diversi studi hanno tentato di inserire geni estranei, compreso l'HIV-1 Tat, proteina fluorescente verde e DsRed, in HBV genoma 11, 12, 13. Tuttavia, questi HBVs ricombinanti non sono utili per lo screening HBV / replica, o per l'high-throughput screening dei fattori che influenzano l'infezione da HBV / replica. Questo è principalmente a causa della bassa produttività dei virus ricombinanti e la ridotta intensità di espressione del gene reporter causato dalla produzione di virus inefficiente.

Per superare questi problemi, abbiamo costruito un HBV giornalista con un alto rendimento di produzione di virus. Questo virus è altamente sensibile per monitorare le prime fasi del ciclo di replicazione dell'HBV, dall'entrata alla trascrizione. Per raggiungere questo obiettivo, NanoLuc (NL) è stato scelto come gene marcatore perché è un piccolo (171 amminoacidi) progettati giornalista luminescenticlass = "xref"> 14. Inoltre, NL è di circa 150 volte più luminoso di lucciola o Renilla luciferasi, e la reazione luminescenti è ATP-indipendenti, il che suggerisce che il tasso di successo falso sarà basso per lo screening ad alto rendimento. L'efficienza produttiva del HBV ricombinante è pari a circa 1/5 del genitore HBV, e simile a livelli riportati per precedenti virus ricombinanti HBV; tuttavia, la luminosità NL supera problemi di produttività virus in modo che possa essere utilizzato per lo screening di massa di agenti anti-HBV.

Proiezione di agenti anti-HBV utilizzando epatociti primari, HepaRG, HepAD38 e epatociti NTCP-trasdotte potrebbe essere utile per lo screening di agenti anti-HBV con il metodo convenzionale (s). Tuttavia, il sistema qui descritto presenta diversi vantaggi, quali una semplice manipolazione, ad alta sensibilità e basso costo per lo screening. Questi vantaggi sono adatti per dosaggi elevati di throughput per lo sviluppo e identificare nuovi agenti HBV per scopi terapeutici.

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Protocollo

1. Produzione di ricombinante HBV codifica per la proteina Reporter

  1. Preparazione delle cellule HepG2
    1. Preparare terreno di coltura cellulare (mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml aminoacidi U / non essenziali).
    2. Piastra 4 x 10 6 cellule HepG2 in 10 cm Piatto collagene rivestite in 10 ml di mezzo di coltura il giorno prima della transfezione. Incubare le cellule HepG2 a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
      NOTA: Quando circa 4 x 10 6 cellule HepG2 vengono piastrate in 10 cm piatto collagene rivestite in 10 ml di mezzo di coltura, saranno 70-90% confluenti il giorno successivo.
  2. trasfezione
    1. Cellule trasfezione HepG2 con 5 mg di pUC1.2HBV Delta Epsilon 15 e 5 mg di pUC1.2HBV / NL 15 utilizzando una trasfezioneReattivo secondo le istruzioni del produttore.
    2. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco.
    3. Una settimana dopo la trasfezione, trasferire il terreno di coltura contenente l'HBV ricombinante ad un ml tubo 50 e procedere al punto 1.3.1. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco alla piastra contenente le cellule trasfettate.
      NOTA: Produzione del HBV ricombinante viene mantenuta per 4 settimane. Il mezzo di coltura contenente HBV ricombinante può essere conservato a 4 ° C per 1 mese.
  3. Purificazione di HBV ricombinante
    1. Rimuovere detriti cellulari dal mezzo di coltura contenente HBV ricombinante mediante centrifugazione (2300 xg per 5 min).
    2. Passare il surnatante attraverso un filtro da 0,45 micron membrana.
    3. Aggiungere un volume uguale del 26% PEG / 1,5 M NaCl (polietilenglicole 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml di 0,5 M EDTA pH 8,0 e 5 ml di 1 M HEPES pH 7.6 a 500 ml) al mezzo di coltura contenente ricombinanteHBV e mescolare delicatamente. Incubare per una notte a 4 ° C.
    4. Centrifugare a 2300 xg per 20 min a 4 ° C.
    5. Eliminare il supernatante e sciogliere il precipitato in 0,5 ml di TNE (10 mm Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
    6. Rimuovere i detriti per centrifugazione a 2.300 xg per 5 min.
    7. Carico 0.5 ml di TNE contenente HBV ricombinante su 0,8 ml di 20% di saccarosio in TNE.
    8. Centrifugare a 100.000 xg per 3 ore a 15 ° C.
    9. Scartare tanto del surnatante possibile, e salvare il pellet. Risospendere in 1 ml di siero DMEM senza per 40 ml di mezzo di coltura di partenza.
    10. Incubare per una notte a 4 ° C.
    11. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Preparare 0,5 ml aliquote e conservare a -80 ° C.
      NOTA: Se si osserva la contaminazione proteina reporter del campione virus originale, di purificare il virus dal gradiente di densità ultra-centrifugazione del 5-30% di saccarosio in TNE a 100.000 xg per 2 ore, o CsCl densità equilibrata centrifugazione from 1.1-1.6 g / ml a 150.000 xg per 50 ore.

2. L'infezione di HBV ricombinante

  1. Cellule Culture HepG2 stabilmente esprimenti NTCP (HepG2 / NTCP) 15 che sono suscettibili di infezione da HBV in DMEM supplementato con 10% FBS, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina, 250 ug / ml di G-418 e 100 U / ml aminoacidi non essenziali a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
  2. Un giorno prima dell'infezione, piatto di circa 5 x 10 4 HepG2 / cellule NTCP 14 in una piastra ricoperta da 96 pozzetti di collagene in 0,1 ml di terreno di coltura.
  3. Scongelare HBV ricombinante in un bagnomaria C 37 ° fino a quando c'è un piccolo pezzo di ghiaccio che resta nel flaconcino.
  4. Preparare il mezzo di infezione combinando i seguenti: 10 ml di 40% PEG8000 in 1x tampone fosfato salino (PBS), 2 ml di dimetilsolfossido (DMSO), 10 ml di HBV ricombinante e 78 ml di terreno di coltura frescoper pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  5. Aggiungere 100 pl di soluzione di HBV ricombinante ad un pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
  6. Un giorno dopo l'infezione, lavare le cellule infettate 3 volte con 300 ml di PBS per pozzetto per rimuovere la proteina contaminante giornalista dalla frazione virus.
  7. Incubare le cellule infette in 200 ml di terreno di coltura contenente 2% DMSO per una settimana o meno.

3. Analisi

  1. Una settimana dopo l'infezione, lavare le cellule infettate 3 volte con PBS.
  2. Aggiungere 50 ml di tampone di lisi delle cellule infette.
  3. Oscillare la piastra di coltura per 5 minuti, quindi si centrifuga a 2000 xg per 5 min.
  4. Aggiungere 50 ml di substrato giornalista nella piastra luminometro.
  5. Aggiungere 20 ml di lisato cellulare ad una piastra luminometro contenente il substrato giornalista. Mescolare vortexando brevemente.
  6. Porre la piastra in luminometro e avviare la lettura 15.

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Risultati

La figura 1 mostra uno schema del genoma HBV, RNA trascritti, proteine del virus e la cui regione codificante sul genoma. Il gene reporter e la sua posizione nel genoma sono anche indicati. La Figura 2 mostra l'HBV plasmide reporter e helper plasmide contenente il gene reporter. Il reporter pUC1.2HBV / NL è stato costruito eliminando posizioni nucleotidiche 223-811 dal sito inizio della trascrizione del mRNA precore di pUC1.2HBV 16<...

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Discussione

Il genoma HBV ha quattro principali fasi di lettura aperti (ORF), tra cui il nucleo, polimerasi, di superficie e X ORF (Figura 1). Trascrizione di questi quattro HBV ORF è strettamente regolata da quattro promotori: il promotore precore / core contenenti enhancer II, S1 promotore, promotrice S2 e X promotore contenente enhancer I 18. I 3,5 kb e 3,4 kb mRNA sono tradotti in precore e Core proteine, rispettivamente. La grande proteina busta (L) è prodotto dal più grande mRNA subgen...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato in parte dal Programma di Ricerca sull'Epatite dell'Agenzia Giapponese per la Ricerca Medica e lo Sviluppo (AMED) e da Grants-in-Aids for Scientific Research del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Nano-Glo Luciferase Assay RegentPromegaN1110
Penicillina-Streptomicina Soluzione mistaNacalaitesque 09367-34 
MEM Soluzione di Aminoacidi Non EssenzialiThermo Fisher Scientific11140050
DMEMThermo Fisher Scientific11995065
Opti-MEM I Siero Ridotto MediumThermo Fisher Scientific 31985070
Piatto rivestito di collagene da 100 mm/collageneIwaki4020-010
Lipofectamina 3000 Reagente per trasfezioneThermo Fisher ScientificL3000001 
Polietilenglicole (PEG) 6000 Sigma-Aldrich81255
Polietilenglicole (PEG) 8000 Sigma-Aldrich89510
NaClNacalai tesque31319-45 
0,5 mol/L EDTA SoluzioneNacalai tesque06894-14
Tris-HClNacalai tesque35434-21
Millex-HP, 0,45 μ m, polietersulfone, filtroMerck MilliporeSLHP033RS
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Piastra a 96 pozzetti rivestita di collageneCorningNO3585
Lisi passiva 5x tamponePromegaE1941
GloMax 96 Luminometro per micropiastrePromegaE6501
SaccarosioNacalai tesque30403-55
Piastra luminometricaGreiner bio-one655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22--Riferimento 15
pUC1.2HBV delta epsilon--Riferimento 15
pUC1.2HBV/NL--Riferimento 15
tubo da 50 mlViolamo1-3500-02
Anti-Myc anticorpoSigma-AldrichC3956
HBIGJapan Blood ProductsOrganization-IFN
-βMochida Pharmaceutical 14987224005413
EparinaSigma-AldrichH3393

Riferimenti

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