Qui si descrive un virus dell'epatite B recentemente sviluppato (HBV) sistema reporter per monitorare le prime fasi del ciclo di vita HBV. Questo semplificata nel sistema vitro sarà di aiuto nella proiezione di agenti anti-HBV utilizzando una strategia ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
Sviluppo di un virus System Reporter dell'epatite B per monitorare la fasi iniziali del ciclo di replicazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Attualmente, è possibile costruire forme ricombinanti di vari virus, come il virus dell'immunodeficienza umana 1 (HIV-1) e il virus dell'epatite C (HCV), che trasportano geni estranei come una proteina reporter o marcatore nei loro genomi. Questi virus ricombinanti di solito imitano fedelmente il ciclo di vita del virus originale nelle cellule infette e mostrano la stessa dipendenza dalla gamma di ospiti. Lo sviluppo di un virus ricombinante consente lo screening efficiente degli inibitori e l'identificazione di specifici fattori dell'ospite. Tuttavia, fino ad oggi la costruzione del virus dell'epatite B ricombinante (HBV) è stata difficile a causa di varie limitazioni sperimentali. La limitazione principale è la dimensione compatta del genoma dell'HBV e una dimensione del genoma abbastanza rigorosa che non supera le dimensioni di 1,3 del genoma, che deve essere impacchettata in virioni. Pertanto, la dimensione di un gene estraneo da inserire dovrebbe essere inferiore a 0,4 kb se non deve essere eseguita alcuna delezione del DNA del genoma. Pertanto, per superare questa limitazione dimensionale, è necessaria la delezione di un po' di HBV DNA. Qui, riportiamo la costruzione di HBV ricombinante che codifica un gene reporter per monitorare la fase iniziale del ciclo di replicazione dell'HBV sostituendo parte della regione codificante il core dell'HBV con il gene reporter eliminando parte della regione codificante il pol dell'HBV. L'individuazione dell'infezione da HBV ricombinante, monitorata dall'attività reporter, è risultata altamente sensibile e meno costosa rispetto all'utilizzo dei metodi convenzionali attualmente disponibili per valutare l'infezione da HBV. Questo sistema sarà utile per una serie di applicazioni, tra cui lo screening ad alto rendimento per l'identificazione di inibitori anti-HBV, fattori dell'ospite e cellule sensibili al virus.
Introduzione
L'infezione cronica da virus dell'epatite B (HBV) è un importante fattore di rischio per le malattie croniche del fegato 1. Sebbene strategie terapeutiche attuali si basano su analoghi nucleotidici che inibiscono la funzione HBV pol e / o la somministrazione di tipo I interferon che attiva risposte immunitarie negli individui infetti nonché indirettamente sopprimere la proliferazione HBV attraverso funzioni genici stimolati 2, questi trattamenti non possono eliminare HBV DNA completamente 3. Inoltre, l'emergere di HBVs che sono resistenti agli agenti anti-Pol è di preoccupazione
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Protocollo
1. Produzione di ricombinante HBV codifica per la proteina Reporter
- Preparazione delle cellule HepG2
- Preparare terreno di coltura cellulare (mezzo di Dulbecco modificato Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 100 U / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e 100 ml aminoacidi U / non essenziali).
- Piastra 4 x 10 6 cellule HepG2 in 10 cm Piatto collagene rivestite in 10 ml di mezzo di coltura il giorno prima della transfezione. Incubare le cellule HepG2 a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
NOTA: Quando circa 4 x 10 6 cellule HepG2 vengono p....
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Risultati
La figura 1 mostra uno schema del genoma HBV, RNA trascritti, proteine del virus e la cui regione codificante sul genoma. Il gene reporter e la sua posizione nel genoma sono anche indicati. La Figura 2 mostra l'HBV plasmide reporter e helper plasmide contenente il gene reporter. Il reporter pUC1.2HBV / NL è stato costruito eliminando posizioni nucleotidiche 223-811 dal sito inizio della trascrizione del mRNA precore di pUC1.2HBV 16<.......
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Discussione
Il genoma HBV ha quattro principali fasi di lettura aperti (ORF), tra cui il nucleo, polimerasi, di superficie e X ORF (Figura 1). Trascrizione di questi quattro HBV ORF è strettamente regolata da quattro promotori: il promotore precore / core contenenti enhancer II, S1 promotore, promotrice S2 e X promotore contenente enhancer I 18. I 3,5 kb e 3,4 kb mRNA sono tradotti in precore e Core proteine, rispettivamente. La grande proteina busta (L) è prodotto dal più grande mRNA subgen.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato in parte dal Programma di Ricerca sull'Epatite dell'Agenzia Giapponese per la Ricerca Medica e lo Sviluppo (AMED) e da Grants-in-Aids for Scientific Research del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) del Giappone.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillina-Streptomicina Soluzione mista | Nacalai | tesque 09367-34 | |
| MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Siero Ridotto Medium | Thermo Fisher Scientific 31985070 | ||
| Piatto rivestito di collagene da 100 mm/collagene | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamina 3000 Reagente per trasfezione | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polietilenglicole (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polietilenglicole (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0,5 mol/L EDTA Soluzione | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0,45 μ m, polietersulfone, filtro | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Piastra a 96 pozzetti rivestita di collagene | Corning | NO3585 | |
| Lisi passiva 5x tampone | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Luminometro per micropiastre | Promega | E6501 | |
| Saccarosio | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Piastra luminometrica | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | - | - | Riferimento 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | - | - | Riferimento 15 |
| pUC1.2HBV/NL- | - | Riferimento 15 | |
| tubo da 50 ml | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc anticorpo | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products | Organization-IFN | |
| -β | Mochida Pharmaceutical 14987224005413 | ||
| Eparina | Sigma-Aldrich | H3393 |
Riferimenti
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), Supple 1 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure....
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Ristampe e permessi
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