Articolo metodologico

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti Clostridium difficile R20291 Strain

DOI:

10.3791/54850

⸱

10 dicembre 2016

 ,  ,  , 
1Department of Population Health and Pathobiology, North Carolina State University College of Veterinary Medicine, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, Lineberger Comprehensive Cancer Center, University of North Carolina School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea il modello di topo cefoperazone di infezione da Clostridium difficile (CDI) con un ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. L'enfasi sul monitoraggio clinico della malattia, C. enumerazione batterica difficile, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici tutto CDI in un modello di topo sono dettagliati nel protocollo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile è un patogeno enterico anaerobico, gram-positivo, sporigeno che è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità e di conseguenza rappresenta una minaccia urgente per la salute pubblica. La recidiva di un'infezione da C. difficile (CDI) dopo un trattamento efficace con antibiotici è elevata, si verifica nel 20-30% dei pazienti, rendendo quindi necessaria la scoperta di nuove terapie contro questo patogeno. Gli attuali modelli animali di CDI determinano alti tassi di mortalità e quindi non si avvicinano alle manifestazioni croniche e insidiose della malattia osservate nell'uomo con CDI. Per valutare le terapie contro C. difficile, è necessario un modello murino che si avvicini alla malattia umana utilizzando un ceppo clinicamente rilevante. Questo protocollo delinea il modello murino di CDI con cefoperazone utilizzando un ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabile, R20291. Le tecniche per il monitoraggio clinico della malattia, l'enumerazione batterica di C. difficile, la citotossicità delle tossine e le alterazioni istopatologiche in tutta la CDI in un modello murino sono descritte in dettaglio nel protocollo. Rispetto ad altri modelli murini di CDI, questo modello non è uniformemente letale alla dose somministrata, consentendo l'osservazione di un decorso clinico prolungato dell'infezione concordante con la malattia umana. Pertanto, questo modello murino di CDI si dimostra una preziosa piattaforma sperimentale per valutare gli effetti di nuove terapie sul miglioramento della malattia clinica e sul ripristino della resistenza alla colonizzazione contro C. difficile.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile è un anaerobica,, bacillo spore gram-positivi che causa pericolo di vita la diarrea 1. Infezione da C. difficile (CDI) è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità umana e si traduce in più di 4,8 miliardi di $ in spese sanitarie per anno 1-4. Nel 2013, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie classificati C. difficile come un rischio resistenza agli antibiotici urgente, indicando che essa pone una minaccia urgente per la salute pubblica 1. Attualmente, il trattamento antibiotico con vancomicina e metronidazolo sono considerati lo standard di cura per CDI 5. Purtroppo, il ripetersi di CDI dopo il successo del trattamento con antibiotici è alto, che si verificano nel 20 - 30% dei pazienti 2,5-7. Pertanto, la scoperta di nuove terapie contro questo patogeno enterico è necessario. Per valutare terapie contro il C. difficile, un modello animale approssimare la malattia umana in acè necessario un ceppo linically rilevanti.

Inizialmente, i postulati di Koch sono stati stabiliti per il C. difficile nel 1977 utilizzando un modello di criceto siriano clindamicina trattati con 8. Questo modello è ancora utilizzato oggi per studiare gli effetti delle tossine di C. difficile sulla patogenesi 9,10. Tuttavia, CDI nel modello criceto si traduce in alti tassi di mortalità e non, sul ravvicinamento delle manifestazioni della malattia insidiosi croniche che possono essere visti in esseri umani con CDI 10,11. Sulla base della accessibilità e la disponibilità di piattaforme reagente murini in ricerca, un modello murino di CDI è rilevante.

Nel 2008, un modello di topo robusto CDI è stato istituito con il trattamento di topi con un cocktail di antibiotici nell'acqua potabile (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazolo e vancomicina) per 3 giorni, seguiti da un'iniezione intraperitoneale di clindamicina 12. Questo topi resi sensibili alla colite CDI e grave. Dipenderezione della dose somministrata inoculo, una serie di segni clinici e letalità può osservare utilizzando questo modello. Da quel momento, i vari regimi antibiotici sono stati studiati che alterano la flora intestinale murino, diminuendo la resistenza colonizzazione al punto in cui C. difficile può colonizzare il tratto gastrointestinale (rivisto nel miglior et al. E Lawley & Young) 13,14.

Più di recente, un ampio spettro di cefalosporina, cefoperazone, data in acqua potabile per 5 o 10 giorni rende riproducibile topi suscettibili di CDI 15. Dal momento che la somministrazione di cefalosporine di terza generazione sono associati ad un aumentato rischio di CDI negli esseri umani, l'uso del modello cefoperazone riflette in modo più accurato la malattia 16 in natura. Cefoperazone trattati topi suscettibili di C. difficile è stato messo in discussione con entrambe le spore di C. difficile e le cellule vegetativa di una varietà di ceppi che vanno a clinicarilevanza e virulenza 17. Nonostante alcuni degli studi originali che utilizzano C. cellule vegetative difficile del come la forma infettiva, spore di C. difficile del sono considerati la principale modalità di trasmissione 18.

Negli ultimi dieci anni, C. difficile R20291, un NAP1 / BI / 027 ceppo, è emerso, causando epidemie di CDI 19,20. Abbiamo cercato di determinare il decorso clinico della malattia, quando i topi Cefoperazone trattati si sono sfidati con il C. difficile ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. Dettagli Questo protocollo il decorso clinico, tra cui la perdita di peso, la colonizzazione batterica, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici nel tratto gastrointestinale dei topi sfidati con spore di C. difficile R20291. Nel complesso, questo modello di topo si rivela essere una piattaforma sperimentale prezioso per CDI approssimare malattie umane. Questo modello caratterizzato mouse può quindi essere utilizzato per valutare gli effettidi nuove terapie per il miglioramento della malattia clinica e sul restauro della resistenza colonizzazione contro C. difficile.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dichiarazione etica:
La cura degli animali e Usa Comitato Istituzionale (IACUC) alla North Carolina State University College di Medicina Veterinaria (NCSU) ha approvato questo studio. La cura NCSU animali e utilizzare la politica applica gli standard e le linee guida stabilite nel benessere degli animali Act e di estensione Health Research Act del 1985. Laboratorio strutture animali a NCSU aderire alle linee guida indicate nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli stati di salute degli animali sono stati valutati tutti i giorni, e gli animali moribondi sono stati umanamente eutanasia da CO 2 asfissia seguita da misure secondarie. i tecnici animali addestrati o un veterinario eseguite zootecnia in una struttura AAALAC accreditato nel corso di questo studio.

1. Amministrazione della antibiotici Cefoperazone in acqua potabile per raggiungere suscettibilità a C. difficile colonizzazione e malattia

NOTE: 6 topi da 5 a 8 settimane di età C57BL / WT (femmine e maschi)sono stati acquistati e messi in quarantena per 1 settimana prima di iniziare la somministrazione di acqua antibiotico. Dopo la quarantena, i topi sono stati alloggiati con cibo in autoclave, biancheria da letto, e l'acqua. modifiche gabbia sono state eseguite settimanalmente da personale di laboratorio in una cappa a flusso laminare.

  1. Preparare cefoperazone (0,5 mg / ml) in acqua distillata sterile 7 giorni prima del giorno mirato di sfida (Figura 1).
  2. Riempire bottiglie d'acqua in autoclave con acqua cefoperazone (0,5 mg / ml) e metterli in ogni gabbia del mouse.
    NOTA: acqua cefoperazone preparati al momento dovrebbe essere fatto e cambiato ogni 2 giorni nel corso di un periodo di 5 giorni, come indicato nei passi 1.1 e 1.2. Si raccomanda il corretto smaltimento delle acque cefoperazone seguendo le linee guida di salute e sicurezza ambientale istituzionali.
  3. Dopo 5 giorni in acqua cefoperazone, sostituire le bottiglie con bottiglie d'acqua in autoclave riempite con acqua distillata sterile. Dare topi questa acqua potabile per la durata dell'esperimento.

2. Preparazione del C. difficile Spore inoculo e la sonda gastrica dei topi

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi che i seguenti componenti siano introdotti nella cella anaerobica per almeno 24 ore: 1x PBS (PBS; vedi Materiali), taurocolato cicloserina cefoxitina fruttosio agar (TCCFA) piastre (vedi Materiali e il file supplementare ), e sterile spalmatore a forma di L.

NOTA: I topi sfidati con spore di C. difficile del dovrebbero essere ospitati in una struttura di animali biosicurezza di livello 2.

  1. Ottenere un C. difficile spore magazzino del ceppo desiderato (in questo caso, R20291) che è stato preparato in precedenza e conservato a 4 ° C in acqua sterile 21,22. Determinare l'enumerazione di questa spora magazzino prima dell'uso.
  2. Sulla base della concentrazione nota (spore / ml) di spore magazzino, calcolare la diluizione desiderato per ottenere 10 5 spore per 25 microlitri. Assicurarsi che il volume di inoculo è adeguato per inoculare tuttitopi nell'esperimento (25 ml per il mouse), per eseguire l'enumerazione della inoculo (circa 30 ml), e per tenere conto di errori di pipettamento.
  3. Vortex l'originale C. difficile spore magazzino. Poi, risospendere il volume calcolato (dal punto 2.2) dell'originale C. difficile spore magazzino in acqua sterile all'interno di una provetta con tappo a vite. Eseguire questa aerobicamente in una cappa a flusso laminare. Identificare questa miscela diluita come il "spore inoculo."
  4. Inserire l'inoculo di spore in un bagno d'acqua 65 ° C e riscaldare per 20 min.
    NOTA: Questo passaggio farà sì che solo attivi spore di C. difficile del rimangono dopo il trattamento termico.
  5. All'interno della cappa a flusso laminare, prendere 50 ml di inoculo riscaldata spore, metterlo in una provetta sterile e farlo passare nella camera anaerobica 23. Utilizzare questo esempio per spore enumerazione.
  6. All'interno della cappa a flusso laminare, caricare il restante spore riscaldata inoculo intOA siringa da 1 ml collegato a un ago sonda gastrica gastrica lampadina a punta sterile. Utilizzare una siringa passo-passo manuale per garantire la ripetizione accurata e rapida di dosaggio tra i topi. Assicurarsi che l'ago sonda gastrica è riempito con l'inoculo di spore riscaldato prima dell'uso.
    NOTA: Un nuovo ago sonda gastrica sterile per ogni mouse non è richiesto. Tuttavia, se vengono somministrati varie dosi di spore di C. difficile, un nuovo ago sonda gastrica è raccomandato per ogni dose.
    NOTA: spore di C. difficile del sono altamente resistenti ai disinfettanti tradizionali. Pertanto, l'uso di un disinfettante sporicida, ad esempio # 62 Perisept sporicida disinfettante, è necessario. Il produttore consiglia un tempo di contatto di 2 minuti per distruggere spore di C. difficile.
  7. Gavage ogni topo con 25 ml di inoculo spore. Trattenere ogni mouse delicatamente afferrando l'animale dalla pelle allentata del collo e indietro per immobilizzare la testa. Utilizzando l'indice immobilizzare ulteriormente testa dell'animale eallungare l'esofago. Assicurarsi che l'animale non vocalizzare o mostrare altri segni di sofferenza durante la contenzione.
    NOTA: Il volume totale somministrato a topi con sonda gastrica non deve superare i 10 ml / kg di peso corporeo (0,1 ml / 10 g).
  8. Mantenere il mouse in posizione verticale, verticale e passare delicatamente l'ago sonda gastrica nel lato della bocca. Dirigere l'ago sonda gastrica lungo il tetto della bocca e far avanzare lentamente l'ago sonda gastrica nell'esofago.
    NOTA: Se si incontra alcuna resistenza, l'ago sonda gastrica può essere entrare nella trachea e quindi non dovrebbe essere avanzata, ma piuttosto rimosso e riposizionato immediatamente.
  9. Dopo che l'ago sonda gastrica è a circa metà strada nell'esofago, iniettare 25 ml di inoculo spore riscaldata ed estrarre delicatamente l'ago sonda gastrica dall'esofago.
    NOTA: l'avanzamento Forceful dell'ago sonda gastrica può portare alla rottura dell'esofago o dello stomaco. Pertanto, se la resistenza si incontra quando si avanza l'ago sonda gastrica, È meglio rimuovere immediatamente e riposizionare l'ago sonda gastrica.
  10. Rispedire l'animale verso la sua gabbia e osservarlo per qualsiasi tosse o segni di distress respiratorio, in quanto ciò potrebbe indicare amministrazione tracheale accidentale o l'aspirazione del inoculo spore riscaldata.
    NOTA: I topi sono estremamente sensibili a C. difficile dopo il trattamento antibiotico; di conseguenza, le precauzioni per evitare la contaminazione incrociata tra le gabbie è essenziale. Ciò è particolarmente importante nella gestione di topi trattati con antibiotici, ma contestati come controlli.
  11. Dopo vaccinare tutti i topi, posizionare il restante inoculo di spore riscaldato in una provetta sterile e passarlo nella camera anaerobica per spore enumerazione.
  12. Per l'enumerazione delle spore inoculo riscaldata (dal punto 2.4) e per il restante gavaged inoculo di spore riscaldata, fare 1:10 diluizioni seriali di ciascun inoculo in 1x PBS. Si raccomanda di fare e piastra 4 - 5 diluizioni (vale a dire, 10 -1 attraverso10 -5).
  13. Utilizzando una tecnica asettica, trasferire 100 ml di ogni diluizione in serie su una singola piastra TCCFA.
  14. Utilizzando uno sterile spreader a forma di L, distribuito diluizione applicata al mezzo attraverso la piastra. Anche diffusione dell'inoculo diluito è essenziale per il conteggio preciso delle spore.
  15. Incubare le piastre in anaerobiosi per 24 ore a 37 ° C. Dopo 24 ore, C. unità difficile del formanti colonie (CFU) possono essere enumerati per ottenere la dose infettiva somministrata a topi nei 25 ml (0,025 ml) di volume (vedere il file supplementare "Calcoli Esempio"). C. colonie difficile del sono piatte e giallo pallido e hanno bordi irregolari e un aspetto di vetro smerigliato 24.
    NOTA: Il limite di rilevazione per il conteggio dei batteri è di 10 2 CFU.

3. Monitoraggio perdita di peso del mouse e segni clinici della malattia in tutto infezione da C. difficile

  1. pesare unnimals prima e dopo il trattamento antibiotico 5 giorni cefoperazone, dopo il recupero 2 giorni off di antibiotici (giorno 0) e quindi per tutta la durata dell'esperimento.
    NOTA: Ottenere pesi in un momento costante ogni giorno. Pesi ottenuti il giorno di sfida (giorno 0) dovrebbe essere usato come peso di base iniziale per il confronto durante infezione da C. difficile.
  2. Posizionare una bilancia digitale in un armadio biosicurezza. Posizionare un bicchiere di plastica sterile sulla bilancia e tarare il peso del bicchiere di plastica. Poi, delicatamente sollevare il mouse la base della coda e posizionarlo nel bicchiere di plastica.
    1. Posizionare il bicchiere di nuovo sulla scala. Passa una mano sopra la parte superiore del beaker per assicurare che il mouse non sfugge. Si può prendere 2 - 3 secondi per ottenere un peso stabile. Poi, posizionare delicatamente il mouse di nuovo nella sua gabbia. Registrare questo peso e ripetere il processo per ogni mouse in quella gabbia.
      NOTA: E 'imperativo che vengono prese delle precauzioni necessarie per evitare la contaminazionezione tra le gabbie quando l'ottenimento di pesi. Ogni gabbia di topi deve avere la propria beaker di plastica per la pesatura. I bicchieri di plastica devono essere disinfettati con un agente sporicida tra ogni utilizzo e coperto con un foglio di alluminio sterile.
  3. Monitorare gli animali sfidato due volte al giorno (al minimo) per i segni di clinicamente grave infezione da C. difficile, tra letargia, perdita di appetito, diarrea, e la postura ricurva.
  4. Umanamente eutanasia gli animali che perdono il 20% del loro peso corporeo al basale iniziale e / o sviluppare gravi segni clinici di infezione C. difficile (elencati al punto 3.3).
    NOTA: I topi che presentano segni clinici di infezione da C. difficile devono essere valutati in base alle esigenze durante l'esperimento per garantire che essi non hanno perso il 20% del loro peso corporeo al basale iniziale. Durante punti temporali primi nell'esperimento, questo potrebbe significare misurazioni due volte al giorno.

4. Conta batterica di C. difficileda mouse feci e contenuti del cieco

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi che i seguenti elementi sono collocati nella camera anaerobica per almeno 24 ore: 1x PBS (vedi Materiali), piastre TCCFA (vedi Materiali), sterile diffusore a forma di L, e tubi microcentrifuga sterili e / o piastre PCR per diluizioni.

  1. Ottenere campioni di C. difficile enumerazione
    NOTA: Prima di ottenere feci o contenuti del cieco, pesare microprovette sterili su scala analitica. Registrare il peso del tubo sul lato del tubo, arrotondamento alla quarta cifra decimale (ad esempio, 0,9864 g). Indichiamo questo peso come il "peso tubo". Ciascun campione prelevato deve essere posto in una provetta sterile pesato.
    1. raccolta sterile di feci di topo
      1. frenare delicatamente ogni topo afferrando l'animale dalla pelle allentata del collo e indietro per immobilizzare la testa. Utilizzare il dito mignolo di frenare dolcemente la coda dell'animale, thus esponendo l'ano. Assicurarsi che l'animale non vocalizzare o mostrare altri segni di sofferenza durante la contenzione.
      2. Tenere una, provetta sterile pesato direttamente sotto l'ano dell'animale. È indispensabile che il tubo non venga a contatto diretto con il mouse.
        1. Come l'animale defeca, raccogliere il pellet fecale nel tubo. Mantenere il tubo a temperatura ambiente fino a quando tutti i campioni fecali sono raccolti. Si può richiedere diversi minuti per un mouse a defecare, e perciò necessitano di tentativi di ripetizione per raccogliere le feci.
      3. Pesare le provette contenenti feci sulla scala analitica. Registrare il peso del tubo, l'arrotondamento alla quarta cifra decimale (per esempio, 1,0021 g). Indichiamo il peso ottenuto come il "peso tubo finale".
      4. Far passare i campioni di feci nella camera anaerobica per il conteggio dei batteri direttamente dopo la raccolta delle feci.
    2. raccolta sterile di topo contenuti del cieco al momento della necroscopia
      1. Dopo l'eutanasia umana da CO 2 asfissia seguita da misure secondarie, eseguire una necroscopia per ottenere cieco 25. Il cieco è la grande sezione, a forma di virgola del tratto gastrointestinale.
      2. Posizionare il cieco su un piatto di plastica sterile Petri. Utilizzare un usa e getta, non sterili. 10 bisturi per tagliare il cieco aperta da fine cieca della sacca per esporre il contenuto cecale.
        1. estrarre delicatamente il contenuto cecale esercitando una leggera pressione con il bisturi e spazzare il contenuto verso la parte incisa del cieco.
          NOTA: Si deve prestare attenzione a non distruggere il tessuto del cieco, che sarà sottoposto per l'esame istopatologico.
      3. Posizionare il contenuto cecale in una, provetta sterile pesato immediatamente dopo la raccolta. Solo circa 10 mg di contenuto del cieco sono necessari per il conteggio dei batteri.
      4. Pesare le provette contenenti il ​​contenuto del cieco sul scal analiticoe. Registrare il peso del tubo, l'arrotondamento alla quarta cifra decimale (per esempio, 1,0021 g). Indichiamo il peso ottenuto come il "peso tubo finale".
      5. Far passare i campioni di contenuto cecale nella camera anaerobica per il conteggio dei batteri.
  2. Enumerazione batterica di C. difficile
    1. Calcolare il peso finale dei contenuti (feci o cecale) che verranno elencati per C. difficile. Eseguita questa sottraendo il "peso tubo finale" dal "peso tubo".
    2. Calcolare una diluizione 1:10 del contenuto in 1X PBS e risospendere di conseguenza. Per pellet fecali, utilizzare la punta della pipetta di interrompere delicatamente il pellet in soluzione (vedere il file supplementare "Calcoli Esempio").
    3. Anaerobicamente incubare questi campioni risospese a temperatura ambiente per 30 min, permettendo il contenuto di stabilirsi.
    4. Fai diluizioni in serie per ogni campione in PBS 1x per enumrazione del CFU per g di contenuti (feci o del cieco). Eseguire questa anaerobica.
    5. Utilizzando una tecnica asettica, trasferire 100 ml di ogni diluizione seriale piastre TCCFA. Utilizzando uno sterile spreader a forma di L, diffondere la diluizione applicata ai media per diffondere uniformemente esso tutta la piastra. Anche diffusione della diluizione è essenziale per un accurato conteggio delle colonie.
    6. Incubare le piastre in anaerobiosi per 24 ore a 37 ° C. In questo momento, enumerare colonie di C. difficile avere la CFU per g di contenuto (feci o cecale). C. colonie difficile del sono piatte e giallo pallido e hanno bordi irregolari e un aspetto di vetro smerigliato 24.
      NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato per enumerare C. difficile da altri contenuti GI murino, tra cui ileale e il contenuto del colon. piastre PCR possono essere utilizzati per fare diluizioni seriali.

5. Vero cellulare citotossicità test per quantificare C. difficile tossina Cytotoxicittà

NOTA: Si raccomanda che questo dosaggio essere eseguita dopo il completamento del modello di topo su campioni raccolti all'autopsia e conservati a -80 ° C. Asettiche tecniche di coltura cellulare sono essenziali per prevenire la contaminazione di cellule Vero durante questo test. Questo protocollo richiede 2 giorni di tempo per eseguire. Tutte le feci e contenuto intestinale utilizzato in questo test devono essere conservati in una provetta sterile pesato (indicato con il "peso tubo", vedere la sezione precedente). Il peso del tubo finale (compresi i contenuti) viene misurato mediante una bilancia analitica con l'approssimazione di quattro cifre decimali (vedi paragrafo precedente). L'uso di una pipetta multicanale è consigliato per questo test.

NOTA: Prima di iniziare, assicurarsi che i seguenti articoli sono disponibili: cellule Vero, la modifica di Dulbecco di Eagle (DMEM) 1x con il 10% di siero di calore-inattivato fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / media streptomicina (indicato come "DMEM 1x media; "vedi Materiali e il file supplementare), 0,25%Tripsina-EDTA, 1x PBS, 0,4% Trypan Blue, una coltura cellulare piatto fondo piatto a 96 pozzetti, una piastra di filtro a 96 pozzetti, Clostridium difficile Toxin A (aliquota in 3 ml a 1 mg / mL in acqua ultra pura e conservare a -80 ° C), Clostridium difficile antitossina, un foglio di lavoro (per i calcoli e le mappe piatto; vedere file supplementari).

NOTA: Si deve usare cautela durante questo test per l'esposizione del personale a C. difficile e la sua tossina.

  1. Dividere le cellule Vero (1 ° giorno)
    1. Preriscaldare i media DMEM 1x, 0,25% tripsina-EDTA, e 1x PBS in un bagno d'acqua a 37 ° C.
    2. Ottenere un pallone di cellule Vero dall'incubatore coltura cellulare (37 ° C e 5% CO 2) e collocarlo nella coltura cellulare cappa a flusso laminare sterile. Utilizzare il 70% di etanolo per pulire il cofano e le attrezzature prima dell'uso. Usando una pipetta sierologica, aspirare il supporto dal pallone di coltura tissutale per rimuoverlo dalle cellule Vero e scartare in uno spreco container.
    3. Risciacquare le cellule Vero con 5 ml di PBS 1x (preriscaldato) nel pallone di coltura tissutale. Aspirare il PBS e scartare in un contenitore per rifiuti.
    4. Aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina-EDTA al pallone di coltura tissutale. Un tempo di contatto di 2 - 3 min. Durante questo tempo, osservare le cellule iniziano a venire fuori dalla superficie pallone. oscillare delicatamente il lato pallone di coltura tissutale a lato per allentare le cellule Vero.
    5. Dopo il tempo di contatto con tripsina-EDTA, aggiungere subito 5 ml di DMEM 1x supporti nel pallone di coltura tissutale. Ciò neutralizzare la tripsina-EDTA. Utilizzare questa soluzione per lavare delicatamente le cellule Vero slegati dal retro del pallone. Quindi, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire questa miscela in un tubo conico da 15 ml.
    6. Centrifugare le cellule Vero nel tubo conico per 5 minuti a 180 xg e 25 ° C. Assicurarsi che la centrifuga è ben bilanciata. Dopo centrifugazione, osservare un pellet visibile di cellule Vero sul fondo del tubo conico. Fare attenzione a non DISRUPT questo pellet. Aspirare il surnatante dal tubo conico e scartarla.
    7. Risospendere le cellule Vero in 3 ml di DMEM 1x media.
  2. Contando le cellule Vero
    1. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare Vero (fatta nel passaggio 5.1.7) a 100 ml di 0,4% Trypan Blue. Mescolare delicatamente pipettando la soluzione su e giù.
    2. Aggiungere 10 ml di questa miscela a ciascuna camera di un emocitometro.
    3. Contare il numero di cellule vitali all'interno dei quattro quadranti della emocitometro. cellule Vero morti prenderanno il Blu Trypan e, quindi, saranno di colore blu (queste cellule non devono essere conteggiati). Registrare questi numeri nella "cella del foglio Vero," a condizione.
    4. Somma il numero totale di cellule Vero vitali nei quattro quadranti e calcolare la media. Moltiplicare per il fattore di diluizione, che è 2 da 100 ml di cellule sono in un totale di 200 ml di liquido.
    5. Moltiplicare per il fattore di correzione per dare il "; numero di cellule / ml "Quando si usa un emocitometro, il fattore di correzione è sempre 10 4 Moltiplicare per il volume totale a dare." numero totale di cellule "..
  3. Determinare il numero di pozzetti necessari per ogni esperimento
    NOTA: un singolo campione (feci o contenuto intestinale) richiede 24 pozzetti separati da eseguire in duplice copia. È necessaria una concentrazione di 10 5 cellule Vero per pozzetto (volume totale di 90 microlitri).
    NOTA: Se si desidera incubare le cellule Vero piastre a 96 pozzetti notte a 37 ° C, una concentrazione di 10 3 cellule Vero per pozzetto è raccomandato per tenere conto del tempo di incubazione. I calcoli all'interno della cella del foglio Vero avrebbero bisogno di essere regolato per tenere conto di questo cambiamento.
    1. Determinare il numero di pozzetti che possono essere utilizzati in base alla quantità di cellule Vero disponibili (dal punto 5.2; utilizzare la cella di prospetto Vero, fornito).
    2. Determinare il volume disospensione cellulare Vero necessario per riempire il numero di pozzetti desiderati (in base al numero di campioni in prova). Assicurarsi che qualsiasi volume supplementare è aggiunto al conto per l'errore pipettando (utilizzare la condizione Vero cella del foglio di lavoro).
    3. Diluire la sospensione cellulare Vero (ottenuto nel passaggio 5.1.7) in mezzi DMEM 1x per ottenere il volume richiesto per l'esperimento.
  4. Cellule Vero semina in un 96 pozzetti cultura zolla delle cellule
    1. Utilizzando la risospensione delle cellule Vero dal punto 5.3.2, utilizzare una pipetta multicanale aggiungere 90 ml di sospensione cellulare Vero a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto di coltura cellulare a 96 pozzetti.
    2. Incubare la piastra con le cellule Vero in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 per almeno 4 ore prima di aggiungere tossina (campioni) ai pozzetti. Questo tempo di incubazione consentirà alle cellule Vero di aderire al fondo di ciascun pozzetto.
  5. Creazione di soluzioni madre dai campioni (feci oContenuto intestinale)
    NOTA: Tutti i campioni devono avere il "peso tubo" e "peso tubo finale" misurata tramite una scala analitica. Utilizzare Vero cella del foglio per i calcoli.
    1. Calcolare il peso del contenuto. Convertire g a mg, poi mg per ml. Calcolare il numero totale finale di ml di soluzione necessari per fare una diluizione 1:10 in PBS 1x. Calcolare la quantità totale di PBS 1x per aggiungere al campione.
    2. Aggiungere il volume totale di PBS 1x (calcolato sopra) al campione. Eseguire questa aerobico, e con tecnica asettica. Per pellet fecali, utilizzare la punta della pipetta di interrompere delicatamente il pellet nella soluzione.
    3. Agitare i campioni e poi centrifugare a 3.522 xg per 5 min a temperatura ambiente. Assicurarsi che la centrifuga è ben bilanciata. Fare attenzione a non disturbare il pellet e risospendere il campione in soluzione.
      NOTA: Durante la fase 5.5.3, anche se solo pochi campioni sono in fase di elaborazione, i contenuti possono essere sterilizzati confacendoli passare attraverso un filtro da 0,22 micron invece di utilizzare una piastra filtrante a 96 pozzetti. Alcuni campioni possono richiedere più filtri per sterilizzare l'intero contenuto del volume utilizzando questa tecnica.
    4. Sterilizzare la miscela campione / PBS prendendo 150 ml di surnatante e sistemazione in pozzetti separati su una piastra filtrante a 96 pozzetti. Posizionare la piastra filtrante saldamente sulla sommità di una piastra a fondo piatto di coltura cellulare a 96 pozzetti in modo che il contenuto sarà filtrata in questa piastra.
    5. Centrifugare la pila piastra di coltura piatto filtro / cellulare a 431 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Assicurarsi che la centrifuga sia correttamente bilanciato e che il / Cell Stack piastra di coltura piastra filtrante sono strettamente allineati e non si sposterà durante la centrifugazione.
      NOTA: Questi contenuti filtrati sono lo stock di 10 -1 che verrà utilizzato nelle piastre di diluizione.
    6. Mettere piastra con i campioni filtro sul ghiaccio.
  6. Creazione di diluizione Plate # 1
    NOTA: diluizione PlaTE # 1 (DP 1 #) richiederà 6 pozzi per campione, tra cui positivo controlli negativi (1x PBS) (vedi il DP # 1 il layout sulla cella del foglio Vero) (C. difficile tossina A) e.
    1. Per preparare il controllo positivo (C. difficile tossina A) per questa analisi, ottenere 3 microlitri aliquote (1 mg / mL) da -80 ° C e aggiungere 297 ml di acqua ultrapura, ottenendo una concentrazione finale di 0,01 mg / mL. Mettere in ghiaccio.
    2. Etichettare i pozzi con le loro diluizioni (10 -1 a 10 -6) per ogni campione e indicare i controlli positivi e negativi (vedi il DP # 1 layout).
    3. Aggiungere adeguate quantità di 1x PBS a ciascun pozzetto. Nei 10 -1 pozzi, aggiungere NO PBS. Per i 10 -2 a 10 -6 pozzi, aggiungere 90 ml di PBS 1x.
    4. Aggiungere adeguate quantità di campioni in ciascun pozzetto. Nei 10 -1 pozzi, aggiungere 100 ml di brodo 10 -1 per ogni campione (vedere il passaggio 5.5.7 dal plat filtroe). Per i 10 -2 a 10 -6 pozzi, fare diluizioni seriali; cominciare prendendo 10 microlitri dal pozzo 10 -1 e aggiungendolo al 10 -2 bene. Continuare le diluizioni seriali fuori alla diluizione 10 -6.
    5. Coprire il DP # 1 piastra con un chiaro sigillo adesivo di plastica e posizionarlo sul ghiaccio.
  7. Creazione di diluizione Plate # 2
    NOTA: piastra di diluizione (DP # 2) richiederà 2 corsie di 6 pozzetti per ciascun campione, compresi i controlli positivi e negativi (vedere il layout DP # 2 sulla cella del foglio Vero).
    1. Etichettare i pozzi con le loro diluizioni (10 -1 a 10 -6) per ogni campione e indicare i controlli positivi e negativi (vedere il layout DP # 2). Etichettare i pozzetti con il nome del campione (indicato come "pozzi campione") o il nome del campione con l'antitossina (indicato come "pozzi di antitossina").
    2. Calcolare la quantità di antitossina richiesto per questo test. NOTA: L'antitossina è uno stock 25xsoluzione che deve essere diluito 1:25 in PBS 1x. Mettere la soluzione preparata antitossina 1x sul ghiaccio.
    3. Per "i pozzetti del campione," aggiungere 20 ml di PBS 1x per ogni bene per tutte le diluizioni (10 -1 a 10 -6) di quel campione. Per i "pozzi di antitossina," aggiungere 20 ml di 1x antitossina per ogni bene per tutte le diluizioni (10 -1 a 10 6) di quel campione.
    4. Trasferire 20 ml di campione diluito in pozzetti da DP # 1 nei pozzetti su DP # 2 per righe 1 - 6 e righe 7 - 12 (vedere la disposizione DP # 2 sulla cella di prospetto Vero). Mescolare lentamente la soluzione pipettando su e giù.
    5. Coprire DP # 2 per un buon sigillo adesivo plastico e consentire 40 min di incubazione a temperatura ambiente. Questo incubazione è quello di permettere l'antitossina di legare e quindi inattivare e neutralizzare la tossina di C. difficile.
    6. Dopo l'incubazione, aggiungere 10 ml di miscela da DP # 2 alle appropriate pozzi cellule Vero (vedere il layout zolla delle cellule Vero sul Vero cella del foglio di lavoro). Mescolare delicatamente la soluzione pipettando su e giù, facendo attenzione a non disturbare le cellule Vero che sono rispettati la superficie inferiore dei pozzetti.
    7. Incubare la piastra di cellule Vero notte in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2.
  8. Valutare cellule Vero per arrotondamento utilizzando un microscopio ottico (giorno 2)
    NOTA: Ricordiamo che il fattore di diluizione cambia di un fattore pari a 10 quando si aggiungono le miscele campione alla piastra cellule Vero (ad esempio, 10 -3 è ora 10 -4). Wells che hanno antitossina presenti dovrebbero avere poco o nessun arrotondamento delle cellule Vero notato. Arrotondamento cellule Vero (citotossicità) sarà notato in campioni che contengono C. difficile tossina. Se l'attività citotossica è neutralizzata in una diluizione contenente il campione e l'antitossina, viene confermata la presenza di tossina di C. difficile conseguente citotossicità su cellule Vero.
    1. Esaminare per l'arrotondamento delle cellule Vero utilizzando un light microscopio a 200X ingrandimento. Per i pozzetti del campione (compreso il controllo positivo), registrare la diluizione del bene che è l'ultima ad avere l'80% di arrotondamento delle cellule Vero notato.
    2. Calcolare il titolo citotossico, che è definito come il reciproco della diluizione più elevata che ha prodotto 80% di cellule Vero arrotondamento per g di campione. Ad esempio, se la diluizione massima è 10 -5, allora il fattore di diluizione sarebbe 10 -6 per questo esempio. Così, il registro [fattore di diluizione finale] / g di campione sarebbe log [10 6], da cui si ricava un titolo reciproco di 6.
      NOTA: cellule Vero devono aver percorso almeno 3 - 4 passaggi e non più di 30 passaggi prima del loro utilizzo in questo test 26.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante uno studio rappresentativo, 5 settimane di età C57BL / 6 topi WT sono stati pretrattati con cefoperazone nella loro acqua potabile (0,5 mg / ml) per 5 giorni e ha permesso a 2 giorni lavare con acqua potabile normale. I topi sono stati sfidati con 10 5 spore di C. difficile R20291 tramite sonda gastrica al giorno 0 (Figura 1A). I topi sono stati monitorati per la perdita di peso e segni clinici (letargia, inappetenza, diarrea, e la postura ing...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo caratterizza il decorso clinico, compresa la perdita di peso, la colonizzazione batterica, la citotossicità delle tossine e le alterazioni istopatologiche nel tratto gastrointestinale, dei topi trattati con antibiotici sottoposti a test con spore di C. difficile R20291. Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo in cui l'attenzione ai dettagli è essenziale. Il calcolo accurato dell'inoculo di spore di C. difficile è fondamentale. Questo calcolo si basa sull'enumerazion...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare in questo momento.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare Trevor Lawley del Wellcome Trust Sanger Institute per le spore di C. difficile R20291 e James S. Guy del North Carolina State University College of Veterinary Medicine per le cellule Vero, entrambi utilizzati in questo manoscritto. L'istopatologia animale è stata eseguita presso la LCCC Animal Histopathology Core Facility presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill, con l'assistenza speciale di Traci Raley e Amanda Brown. Il nucleo di istopatologia animale LCCC è supportato in parte da una sovvenzione di supporto del nucleo del centro NCI (2P30CA016086-40) all'UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Vorremmo anche ringraziare Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie e Cassie Schumacher per le utili discussioni sul protocollo del test di citotossicità cellulare Vero. JAW è finanziato dalla sovvenzione Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training T32OD011130 da NIH. La CMT è finanziata dal premio per lo sviluppo della carriera in metabolomica K01GM109236 dal NIGMS del NIH.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
#62 Detergente disinfettante sporidiciale Perisept SSS Navigator48027Questo prodotto richiederà la diluizione come raccomandato dal produttore
0,22 μ m filtroFisherbrand09-720-3Alternativa alla piastra filtrante per campioni individuali testati nel Vero Cell Assay
0,25% Tripsina-EDTAGibco25200-056Deve essere riscaldato in bagnomaria a 37 ° C prima dell'uso
0,4% Trypan BlueGibco15250-061
1% Peniciilin/StreptomycinGibco15070-063
10% inattivato a caldo FBSGibco16140-071Deve essere riscaldato a bagnomaria a 37 gradi; C prima dell'uso
siringa di plastica da 1 ml BD Medical Supplies309628
1x PBSGibco10010-023
Tappo a vite per microcentrifuga da 2 mlCorning430917
Piastra a fondo piatto per colture cellulari a 96 pozzettiCostar CorningCL3595
Piastra filtrante a 96 pozzettiMillipore
ThermoScientificAB-0558
Bacto AgarBecton Dickinson214010Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
Bacto Proteose PeptoneBecton Dickinson211684Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
CefoperazoneMP Bioworks199695
CefoxitineSigmaC47856Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
Clostridium difficile Antitoxin KitTech LabsT5000Utilizzato come controllo per il saggio Vero Cell
Clostridium difficile Tossina AList Biological Labs152CControllo positivo per Vero Cell Assay
D-cicloserinaSigmaC6880Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
Acqua distillataGibco15230
DMEM 1x MediaGibco11965-092Deve essere riscaldato a bagnomaria a 37 ° C prima dell'uso
FruttosioFisherL95500Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
EmocitometroBright-Line, SigmaZ359629
KH2PO4FisherP285-500Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
MgSO4 (anidro)SigmaM2643Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
Millex-GS 0.22 μ m filterMillex-GSSLGS033SSFiltro per piastre TCCFA
Na2HPO4SigmaS-0876Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
NaClFisherS640-3Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
Lama per bisturi monouso numero 10Miltex, Inc4-410
Piastre PCR Fisherbrand14230244
Capsula di Petri in plasticaKord-Valmark Brand2900
Divaricatore di cellule sterili a forma di Lin plastica Fisherbrand14-665-230
Siringa passo-passoDymax CorporationT15469
TaurocholateSigmaT4009Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)
Acqua distillata ultrapuraInvitrogen10977-015
C57BL/6J TopiThe Jackson Laboratory664I topi dovrebbero avere 5-8 settimane di età
Microscopio ottico Olympus BX43FFotocamera Olympus Life Science
DP27Olympus Life Science
cellSens Dimension software Olympus Scienze
Guarnizione adesiva MSGVS2210 della vita

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf (2013).
  2. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  3. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  4. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, Suppl 2 88-92 (2012).
  5. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  6. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile--more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  7. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  8. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  9. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  10. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  11. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  12. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  13. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  14. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  15. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  16. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, Suppl 1 19-31 (2008).
  17. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  18. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  19. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  20. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  21. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  22. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , Chapter 9, Unit9A.1 (2009).
  23. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787(2013).
  24. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  25. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S. Comparative Anatomy and Histology. Dintzis, S. M. , Academic Press. 15-40 (2012).
  26. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , Appendix 4, Appendix 4E (2008).
  27. Clostridium difficile Toxin/Antitoxin Kit Cat No.T5000. , TECHLAB. Available from: http://www.techlab.com/wp-content/uploads/2013/06/t5000isert_rev_0307.pdf (2007).
  28. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114(2014).
  29. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  30. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045(2016).
  31. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  32. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  33. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102(2009).
  34. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Cefoperazone Mouse ModelClostridium difficile InfectionBacterial EnumerationToxin CytotoxicityHistopathologic ChangesFecal Sample CollectionSpore Inoculum PreparationAnaerobic Chamber UseClinical Disease MonitoringColony Forming Units

Articoli correlati